鄧 永，孔冬妮，侯力丹，毛婭卿，王 嘉

(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081)

犬細小病毒病是由犬細小病毒(Canineparvo-virus，CPV)引起的一種高度接觸性、烈性傳染病[1]。該病在臨床上以劇烈嘔吐、出血性腸炎及白細胞顯著減少為主要特征，分為出血性胃腸炎和急性心肌炎兩種類型[2]。前者主要侵害犬的腸上皮隱窩細胞，引起犬劇烈嘔吐及血樣下痢；后者主要侵害犬心肌細胞，引起犬心率紊亂，突然死亡[3-4]。該病在世界范圍內(nèi)流行，是危害犬健康最嚴重的疾病之一，給養(yǎng)犬業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟損失。隨著我國經(jīng)濟的發(fā)展，養(yǎng)犬的人數(shù)越來越多，犬細小病毒對犬的危害非常嚴重[5-7]。本實驗采集了納米PCR檢測為陽性疑似感染犬細小病毒病犬的糞便，并在F81細胞上增殖培養(yǎng)，將分離的病毒通過納米PCR試驗檢測、血凝試驗、免疫過氧化物酶單層細胞染色(IPMA)試驗和基因測序分析，確定其株型[8-10]，為監(jiān)測CPV的變異狀況和流行趨勢提供依據(jù)，對其進行持續(xù)監(jiān)測將為是否需要更新當前可用的疫苗和檢測方法提供依據(jù)。

1 材 料

1.1 細胞、病料和載體 貓腎細胞(F81)由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所病毒制品檢測實驗室保存；病料采集于廣西大學動物醫(yī)院臨床糞便；pMD-18T克隆載體(批號K8201AB)購自于TaKaRa公司。

1.2 主要試劑 DMEM培養(yǎng)液(批號8118126)購自GIBCO公司、MEM培養(yǎng)液(批號AC10447375)購自Hyclone公司、胎牛血清(批號ST170802)購自PAN SERATECH；注射用青霉素鈉(批號180508)購自山東魯抗公司、注射用硫酸鏈霉素(批號20180201)購自華北制藥公司；DL2000 DNA Marker(批號746087AH)購自博邁德公司 and Pluss Marker(批號AHF1915A)購自TaKaRa公司、Taq DNA聚合酶(批號745661AH)購自博邁德公司；DNA提取試劑盒(批號03718KC5)購自AXYGEN公司；膠回收試劑盒(批號R6620)購自AXYGEN公司；納米PCR試劑盒(批號NPK01)購自山東大正生物有限公司；質粒提取試劑盒(批號Q6020)購自TIANGEN公司。

1.3 主要儀器 CO2培養(yǎng)箱(THERMO公司)、熒光顯微鏡(OLYMPUS公司)、PCR儀(美國BIO-RAD公司)、小型高速冷凍離心機(HIMAC公司)、高速冷凍離心機(PROTEINSIPMLE公司)、紫外凝膠成像系統(tǒng)(TANON2500)(上海天能科技有限公司)、電子天平(METTLER TOLEDO PL203-IC)、低溫臺式高速離心機(Biofugo primo R)(美國THERMO公司)、Milli-Q純水儀(美國MILLIPORE公司)、移液槍(美國EPPENDORF公司)、96 孔V型血凝板、微型血凝振蕩(上海生物工程公司)、普通光學顯微鏡(OLYMPUS公司)等。

2 方 法

2.1 臨床樣品處理 采用納米PCR檢測為陽性疑似感染犬細小病毒的糞便作為樣品，將糞便放入EP管中，用PBS將其重旋，并加入1%青、鏈霉素。15000 r/min離心15 min，將上清用0.22 μm濾膜過濾除菌后作為分離病毒樣品，-80 ℃保存。

2.2 病毒的分離與增殖 將病料用適量PBS重懸，然后15000 r/min離心15 min，用移液器吸取上清，用0.22 μm濾器無菌過濾，同步接種于新消化的F81細胞中，加入含5% FBS(胎牛血清)的DMEM細胞培養(yǎng)液，加入1% 青、鏈霉素雙抗，然后放入37 ℃，5%CO2細胞培養(yǎng)箱進行培養(yǎng)，同時設正常細胞對照。每天觀察細胞生長情況和細胞病變(CPE)情況。盲傳3代無CPE則棄去，產(chǎn)生CPE的細胞再連續(xù)傳3代，當出現(xiàn)90%的CPE時，收獲病毒。

2.3 樣品PCR的測定

2.3.1 引物設計及合成 參照GenBank 中發(fā)表的CPV-2(登錄號：AB054222)基因組序列的分析，應用Primer 6.0軟件設計擴增CPV VP2基因的全長序列引物，經(jīng)過VP2基因全長序列比對后篩選出保守區(qū)域并設計能擴增出574 bp目的條帶的引物[11-12]。引物由華大基因公司合成(表1)。

表1 CPV VP2基因保守序列PCR擴增引物Tab 1 The primers of CPV VP2 gene conservative sequence PCR amplification

2.3.2 樣品DNA提取 樣品及病毒分離后細胞培養(yǎng)物 DNA的提取使用AXYGEN公司的 DNA 提取試劑盒進行，具體操作按照使用說明書進行。

2.3.3 PCR的擴增 以提取的DNA為模板，應用引物 VP2-F和VP2-R來擴增目的片段，大小為574 bp，用已經(jīng)優(yōu)化好條件的納米PCR進行擴增，將PCR產(chǎn)物 5 μL與6× Loading buffer加樣緩沖液混勻，在1%的瓊脂糖凝膠上電泳，電壓為120 V，30 min后，于凝膠成像系統(tǒng)內(nèi)觀察結果，并照相。

2.3.4 血凝實驗 按常規(guī)微量 HA操作方法在96孔 “V”型微量板上進行。將待檢病毒液于 96孔微量血凝板中倍比稀釋后加入等量1%豬紅細胞懸液，4 ℃靜置1 h后判定結果。

2.3.5 免疫過氧化物酶單層細胞染色法(IPMA)鑒定 取1 mL經(jīng)過離心的病料上清，經(jīng)過0.22 μL濾器同步接種于F81細胞，加入足量的含5%胎牛血清的MEM，于5% CO2，37 ℃培養(yǎng)48 h，用PBS(200 μL/孔)洗3次，電吹風吹干，直到孔邊緣出現(xiàn)白色圈為宜。每孔加入100 μL 33%丙酮-PBS，室溫放置30 min。棄固定液，用電吹風吹干。進行IPMA試驗，具體操作步驟如下：每孔加入200 μL洗滌液，置室溫漂洗一次，輕輕甩出洗液，吸水紙上輕叩。用樣品稀釋液將待檢樣品、陰性血清對照品和陽性血清對照品作1∶100倍稀釋。取上述稀釋血清樣品分別加入到對應孔，每孔100 μL，于37 ℃溫箱中孵育1 h。再次洗板后，每孔加入100 μL稀釋的HRP-SPA辣根過氧化物酶標記的二抗，將反應板放入盒中，于37 ℃溫箱中放置30 min。再次洗板。每孔加入100 μL底物顯色液，避光，于37 ℃溫箱中反應15 min。棄去反應液，每孔加入200 μL蒸餾水洗板一次，每孔加入100 μL ddH2O觀察結果。在顯微鏡下觀察各孔顯色情況，進行樣品結果判定。在CPV陽性血清下，若有病毒感染的細胞染色后細胞質內(nèi)或細胞核周圍呈棕紅色判定為陽性，若無病毒感染細胞核無著色反應判定為陰性。

2.3.6 VP2基因PCR擴增與序列分析 在NCBI網(wǎng)站上下載幾個CPV的VP2序列，使用DNAMAN軟件進行比對。根據(jù)比對結果，選擇CPV的VP2基因的保守區(qū)域使用Primer6.0軟件設計一對覆蓋犬細小病毒VP2基因全長的引物P1、P2(表2)，通過PCR擴增獲得VP2全長基因(表3)。所使用的引物為上海生工生物公司合成，擴增片段長度為1755 bp。按文獻[13]方法提取待檢樣品、陰性對照與標準CPV的DNA，進行PCR擴增和瓊脂糖電泳凝膠觀察。用AXYGEN公司的凝膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物。將回收的目的基因片段與pMD18-T載體16 ℃連接過夜，轉化E．coliJM109，經(jīng)酶切鑒定和質粒PCR鑒定后，將陽性克隆送上海生工生物公司測序。

表2 CPV VP2全長基因PCR擴增引物Tab 2 The primers of CPV VP2 gene PCR amplification

表3 PCR擴增參數(shù)Tab 3 PCR amplification parameters

2.3.7 序列測定及分析 將鑒定后的陽性菌液送去測序，測序結果用 DNAMAN 軟件對獲得的VP2基因序列進行拼接，并與NCBI上已經(jīng)公布的犬細小病毒的全基因組序列以及相關蛋白的核酸序列進行比較，確定其所分離的病毒株型并推導氨基酸序列。

3 結果與分析

3.1 病毒在F81細胞上的分離與增殖結果 病料上清接種于F81細胞后培養(yǎng)5 d，接種的細胞明顯出現(xiàn)拉長，變圓，脫落狀態(tài)，呈現(xiàn)明顯的CPE，未接種的細胞狀態(tài)正常(圖1)。反復凍融并繼續(xù)傳代，仍然出現(xiàn)同樣的CPE，將出現(xiàn)CPE的樣品命名為CPV-Guangxi23。

3.2 目的基因的擴增結果 將PCR擴增的目的基因以1%瓊脂糖凝膠電泳，結果顯示在574 bp處可見目的條帶，與預期結果相符合，表明成功擴增出VP2保守序列(圖2)。

3.3 紅細胞血凝檢測結果 采用微量血凝試驗檢測分離上清對豬紅細胞的凝集作用，結果顯示病毒在4 ℃條件下能夠凝集豬紅細胞，與己知CPV血凝譜相符(圖3)。該上清液血凝效價可達214。

A:CPV感染的F81細胞；B:正常細胞A:F81 cells infected with CPV (×100)；B:control F81 cells (×100)圖1 感染CPV的F81細胞和健康F81細胞Fig 1 Healthy F81 cell and F81 cell infected with CPV

M：DL2000 DNA Marker；1、2：樣品PCR產(chǎn)物；3：陰性對照M：DL2000 DNA Marker；1、2：PCR production of sample；3：Negative control圖2 CPV-VP2基因保守序列的PCR產(chǎn)物Fig 2 PCR production of CPV-VP2 gene conservative sequence from samples

3.4 免疫過氧化物酶單層細胞染色法(IPMA)鑒定結果 將病毒液同步接種F81細胞培養(yǎng)48 h后用33%丙酮固定，然后用CPV陽性血清和陰性血清，按1∶100稀釋，按照IPMA操作方法進行，結果顯示接種病毒F81細胞能與陽性血清反應，細胞核周圍呈棕紅色染色；接種病毒F81細胞不能與陰性血清反應，呈現(xiàn)細胞正常顏色，未接種病毒的F81細胞也不能與陽性血清反應，呈現(xiàn)正常細胞顏色，結果與預期相符(圖4)。

3.5 測序結果 圖5顯示，Guangxi23樣品細小病毒序列中編碼VP2蛋白426位氨基酸的密碼子為GAA，編碼Glu，表明這份樣品中的細小病毒為CPV-2c型，命名為CPV-2c-Guangxi23。

1-23列：病毒液依次按2倍倍比稀釋；24列：紅細胞對照Line1-23:serial two-fold dilutions of the virus;Line24:RBC control圖3 病毒血凝特性檢測結果Fig 3 The result of hemagglutination

A:陰性血清；B:陽性血清；C:陽性血清 A:Rabbit negative serum；B:Rabbit positive serum；C:positive serum圖4 F81細胞接種CPV病毒48 h后IPMA結果(×100)Fig 4 IPMA results detected 48 h after inoculation of CPV in F81 cells (×100)using different sera

CPV-Guangxi23編碼426位氨基酸的密碼子為GAA，而CPV-2a編碼426位氨基酸的密碼子為AAT,CPV-2b編碼426位氨基酸的密碼子為GATThe codon for AA at position 426 of VP2 of CPV-Guangxi23 is GAA,while AAT for CPV-2a and GAT for CPV-2b圖5 CPV-Guangxi23樣品測序彩圖Fig 5 The sequencing result of CPV-Guangxi23

3.6 序列分析 使用 DNAMAN軟件進行分析比對，結果顯示Guangxi23樣品與CPV-2c型同源性都在99%以上。從所測的VP2基因氨基酸序列推導序列變異位點，CPV-Guangxi23在VP2蛋白426位氨基酸為Glu，蛋白序列比對結果表明細小病毒為CPV-2c型，并存在267(F)→267(Y)、324(Y)→324(I)2個位點突變，如表4所示。

表4 CPV-Guangxi23 VP2 與參考株VP2 蛋白序列關鍵位點氨基酸比較Tab 4 The comparison of the amino acids at critical sites within VP2 protein of CPV-Guangxi23 and the reference strains.Accession number of reference

*strains:CPV-b (M38245),CPV-GZ(JX120178),CPV-431(AY742951),CPV-M52 (KC196087)

4 討論與結論

本研究從疑似犬細小病毒感染的犬糞便中分離出一株病毒，后經(jīng)細胞培養(yǎng)、病毒形態(tài)學鑒定、血凝試驗、免疫過氧化物酶單層細胞染色法以及納米PCR擴增試驗和VP2基因分析等多種方法鑒定[14]，確定分離的病毒為犬細小病毒，該毒株屬CPV-2c型，并命名為CPV-2c-Guangxi23。

為了區(qū)別于1967年由Binn等人從健康犬糞便中分離到的犬極細小病毒(Minute virus of canine，MVC)(習慣上被叫做CPV-1)而將后來發(fā)現(xiàn)的病毒命名為犬細小病毒2型(CPV-2)[16]。迄今為止，CPV只有一個抗原型，即CPV-2，但不同毒株間抗原性有所差異，已出現(xiàn)了多個亞型，即CPV-2a、CPV-2b、CPV-2c (a)和CPV-2c (b)。CPV-2型出現(xiàn)后很快在世界廣泛傳播，該病毒可能由貓的白血病病毒變異而來，通過野生的犬科動物如貂和狐貍，適應了新的宿主犬，連續(xù)傳播幾年后，CPV已經(jīng)發(fā)生抗原漂移，在抗原性、宿主范圍和血凝性上都發(fā)生了變化，Mara B等研究證實CPV-2與RNA病毒相似，表現(xiàn)有高的遺傳異質性。Parrish等報道，1978-1980年分離的毒株是CPV-2型，1980年后分離的毒株又是另一個型，Parrish等提出將新的毒株命名為CPV-2a，以表明是CPV-2的亞型，能感染犬和貓。很快，最初的CPV-2被CPV-2a完全替代。較CPV-2而言，CPV-2a 在VP2外膜蛋白上有5個氨基酸的改變，已證明這些氨基酸代表了抗原和宿主范圍的病毒特性。1984年，出現(xiàn)了另一種新的抗原變異株，命名為CPV-2b，一般和CPV-2a混合感染，兩者不同之處在CPV-2b衣殼的主要抗原位點有1個氨基酸(Asn426Asp)替換。隨后應用單克隆抗體發(fā)現(xiàn)，Asn/Asp426 Glu 替代引起抗原的改變。因此，有的研究者將Glu-426變異株作為一個新的型，命名為CPV-2c[15]。

研究表明 VP2基因是CPV的特異性基因，為其最主要的毒力基因，也是 CPV最易變異的集中區(qū)段，尤其是CPV 基因型分型依據(jù)就是位于VP2 蛋白的第426aa。為進一步驗證該分離株，本實驗又對該病毒株的VP2基因進行了克隆和分析。結果顯示從病料樣品和細胞培養(yǎng)物中均能夠擴增出大小約為 l755bp的基因片段，測序后進行同源性比較顯示該基因與CPV VP2的同源性可達 99%以上，從分子水平上證明了該分離株為CPV。進一步對 VP2基因對應的氨基酸序列分析表明，該病毒株 426aa為Glu，符合CPV-2c型的特征[17]，而且該病毒株在一些其他位點也發(fā)生了變異，在267(F)→267(Y)、324(Y)→324(I)2個位點發(fā)生突變，從而可能會影響該分離株的感染譜或毒力。

犬細小病毒隨時在變異，可能再經(jīng)過幾年，又會有新的病毒株型出現(xiàn)。我國主要以CPV-2a株流行[18]，在2010年之前，國內(nèi)沒有CPV-2c出現(xiàn)，最近幾年開始陸續(xù)報道我國有CPV-2c的出現(xiàn)，這說明犬細小病毒的傳播速度很快，具有跨區(qū)域傳播的能力。本研究從犬的糞便中，成功分離到一株CPV-2c型病毒，在VP2蛋白426位氨基酸為Glu，血凝價為214，病毒的增殖能力較強，病毒液中所含病毒的量較高，氨基酸推導序列分析發(fā)現(xiàn)存在267(F)→267(Y)、324(Y)→324(I)2個位點突變，說明細小病毒在不斷進化，應隨時監(jiān)測犬細小病毒變異情況，如若出現(xiàn)新的株型，就可以快速更新疫苗，從而對犬起到保護作用。