包永華，王璐璐

(1.浙江經(jīng)貿(mào)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，杭州 310018；2.浙江方圓檢測(cè)集團(tuán)股份有限公司，杭州 310013)

硝基呋喃類藥物(呋喃它酮、呋喃唑酮、呋喃妥因、呋喃西林)是一類人工合成的具有硝基呋喃基本結(jié)構(gòu)的廣譜抗生素，曾廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)，治療由大腸桿菌或沙門氏菌所引起的腸炎、疥瘡、潰瘍等[1]。該類藥物及其代謝物具有潛在的致癌、致畸、致突變等毒副作用,因而引起人們的高度重視[2-3]。目前，全球大多數(shù)國家均將其列為禁用藥物，硝基呋喃類藥物及其代謝物殘留是國際動(dòng)物源性食品貿(mào)易的必檢項(xiàng)目[3]。有關(guān)水產(chǎn)品中硝基呋喃類代謝物的檢測(cè)方法，主要有酶聯(lián)免疫法(ELISA)[4]、高效液相色譜法(HPLC)[5]、液相色譜-紫外法[6]、液相色譜-質(zhì)譜法(HPLC-MS)[7]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法((HPLC-MS/MS)[8]、超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(UPLC-MS/MS)[9]等。UPLC-MS/MS法能夠充分發(fā)揮超高效液相色譜的高分離度、高分析速度與串聯(lián)質(zhì)譜的高特異性和高靈敏度的優(yōu)勢(shì)，成為檢測(cè)水產(chǎn)品硝基呋喃類代謝物的最常使用的技術(shù)路線。本研究以國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 20752-2006[10](豬肉、牛肉、雞肉、豬肝和水產(chǎn)品中硝基呋喃類代謝物殘留量的測(cè)定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法)中的實(shí)驗(yàn)方法為基礎(chǔ)，對(duì)樣品前處理過程進(jìn)行了優(yōu)化，樣品衍生后乙酸乙酯直接提取，確保在能達(dá)到低檢出限要求的同時(shí)，控制回收率在90%～110%以內(nèi)，RSD均小于10%。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 水產(chǎn)樣品(魚片、河蝦、明蝦、螃蟹)，購于杭州世紀(jì)聯(lián)華超市。試劑：呋喃它酮代謝物(AMOZ)，Dr.Ehrenstorfer GmbH，10 mg/瓶，純度≥99.2%；呋喃西林代謝物(SEM)，Dr.Ehrenstorfer GmbH，0.1 g/瓶，純度≥99.5%；呋喃妥因代謝物(AHD)，Dr.Ehrenstorfer GmbH，0.1 g/瓶，純度≥99.38%；呋喃唑酮代謝物(AOZ)，Dr.Ehrenstorfer GmbH，50 mg/瓶，純度≥98.2%；呋喃它酮代謝物的內(nèi)標(biāo)物(D5-AMOZ)，WITEGA，10 mg/瓶，純度≥99.10%；呋喃西林代謝物的內(nèi)標(biāo)物(13C15N-SEM)，WITEGA，10 mg/瓶，純度≥99%；呋喃妥因代謝物的內(nèi)標(biāo)物(13C3-AHD)，WITEGA，100 mg/瓶，純度≥99.10%；呋喃唑酮代謝物的內(nèi)標(biāo)物(D4-AOZ)，WITEGA，50 mg/瓶，純度≥99.80%；2-硝基苯甲醛(C7H5NO3)，含量≥99.0%；二甲基亞砜(C2H6OS)，含量≥99%；乙酸乙酯，德國Merck公司，含量≥99.8%，規(guī)格4 L；磷酸氫二鉀(K2HPO4)，含量≥98%；乙腈，德國Merck公司，含量99.9%，規(guī)格4 L。

1.2 儀器與設(shè)備 1290 Infinity高效液相色譜儀(Agilent Technologies公司)；QTRAP 5500 串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀(AB SCIEX公司)超純水儀，美國Millipore公司；氮?dú)獯蹈蓛x；分析天平：感量0.1 mg；離心機(jī)：轉(zhuǎn)速4000 r/min以上。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件 色譜柱：C18柱，100 mm×2.1 mm，1.7 μm；柱溫:35 ℃；進(jìn)樣量:10 μL；流動(dòng)相及流速見表1。

1.3.2 質(zhì)譜條件 離子源：ESI；掃描方式：正離子掃描；檢測(cè)方式：MRM；霧化氣GS1：55.0 psi；輔助加熱氣GS2：55.0 psi；氣簾氣CUR：35.0 psi；輔助氣溫度TEM：600 ℃；噴霧電壓IS：5500 V；入口電壓EP：10.0 V；碰撞池電壓CXP：12.0 V；碰撞氣CAD：MEDIUM。4種硝基呋喃類代謝物及其內(nèi)標(biāo)物質(zhì)譜條件參數(shù)見表2。

表1 梯度洗脫程序Tab 1 Program of gradient elution

表2 質(zhì)譜條件Tab 2 Condition of mass spectrometry

* 為定量離子

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 將呋喃它酮代謝物(AMOZ)，呋喃西林代謝物(SEM)，呋喃妥因代謝物(AHD)，呋喃唑酮代謝物(AOZ)及其相對(duì)應(yīng)的四種內(nèi)標(biāo)物分別配制成濃度為1 mg/L的標(biāo)樣待用。

1.3.4 樣品預(yù)處理 取樣2 g，加入10 μL，濃度為1 mg/L的內(nèi)標(biāo)，20 mL 0.2 mol/L鹽酸溶液，0.3 mL衍生劑，充分渦旋混勻后37 ℃恒溫振蕩水浴避光反應(yīng) 16 h。衍生后加入5 mL磷酸氫二鉀，混勻后用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH約為7.4。加入5 mL乙酸乙酯，充分振蕩后離心提取上清液，重復(fù)操作兩次，合并上清液，氮?dú)獯蹈桑尤攵ㄈ芤? mL復(fù)溶后過0.22 μm濾膜，上機(jī)待測(cè)即可。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)樣質(zhì)譜圖 根據(jù)GB/T 20752-2006標(biāo)準(zhǔn)中要求，呋喃它酮代謝物(AMOZ)，呋喃西林代謝物(SEM)，呋喃妥因代謝物(AHD)，呋喃唑酮代謝物(AOZ)檢出限為0.5 μg/kg。因此，按照改進(jìn)步驟中的質(zhì)量數(shù)，將配制好的標(biāo)準(zhǔn)溶液再次稀釋后分別適量加入空白樣的水產(chǎn)品中，使得四種硝基呋喃類代謝物標(biāo)樣上機(jī)濃度為1 μg/L，經(jīng)過改進(jìn)的實(shí)驗(yàn)方法處理后，進(jìn)樣分析(圖1～圖8)。

圖1 呋喃它酮代謝物(AMOZ)定量及定性離子出峰質(zhì)譜圖Fig 1 The mass-spectrogram of AMOZ

圖2 呋喃它酮代謝物的內(nèi)標(biāo)物(D5-AMOZ)出峰質(zhì)譜圖Fig 2 The mass-spectrogram of internal-standard for AMOZ

圖3 呋喃西林代謝物(SEM)定量及定性離子出峰質(zhì)譜圖Fig.3 The mass-spectrogram of SEM

圖5 呋喃妥因代謝物(AHD)定量及定性離子出峰質(zhì)譜圖Fig.5 The mass-spectrogram of AHD

圖6 呋喃妥因代謝物的內(nèi)標(biāo)物(13C3-AHD)出峰質(zhì)譜圖Fig.6 The mass-spectrogram of internal-standard for AHD

圖7 呋喃唑酮代謝物(AOZ)定量及定性離子出峰質(zhì)譜圖Fig.7 The mass-spectrogram of AOZ

圖8 呋喃唑酮代謝物的內(nèi)標(biāo)物(D4-AOZ)出峰質(zhì)譜Fig.8 The mass-spectrogram of internal-standard for AOZ

從圖1～圖8出峰質(zhì)譜圖來看，呋喃它酮出峰時(shí)間在2.06 min，峰高最大值4.0 e5cps，D5-AMOZ內(nèi)標(biāo)出峰時(shí)間在2.02 min，峰高最大值3.1 e5cps；呋喃西林出峰時(shí)間在3.67 min，峰高最大值1.6 e5cps，13C15N-SEM內(nèi)標(biāo)出峰時(shí)間在3.66 min，峰高最大值1.9 e5cps；呋喃妥因出峰時(shí)間在3.87 min，峰高最大值1.6 e5cps，13C3-AHD內(nèi)標(biāo)出峰時(shí)間在3.86 min，峰高最大值2.85 e5cps；呋喃唑酮出峰時(shí)間在4.65 min，峰高最大值1.3 e6cps，D4-AOZ內(nèi)標(biāo)出峰時(shí)間在4.60 min，峰高最大值2.1 e6cps。由此可見水產(chǎn)品中的基質(zhì)對(duì)硝基呋喃類代謝物的檢測(cè)并無干擾，出峰時(shí)間穩(wěn)定峰型較為明顯。

2.2 回收率試驗(yàn) 取上述陰性樣品，分別加入標(biāo)準(zhǔn)溶液，使得四種硝基呋喃類代謝物理論上機(jī)濃度分別為1、5、10、15、20 μg/L，按照樣品預(yù)處理方法進(jìn)行處理，上機(jī)進(jìn)樣分析后，結(jié)果如表3，由此可見，經(jīng)過多次實(shí)驗(yàn)表明，該改良版實(shí)驗(yàn)步驟，能夠完全保證實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的有效可行性，回收率控制在90%～120%之間。

表3 各目標(biāo)物加標(biāo)回收率Tab 3 The recovery rate of four nitrofuran metabolites

2.3 精密度試驗(yàn) 取濃度為1 μg/L的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液,重復(fù)進(jìn)樣3次，結(jié)果(表4)表明，四種硝基呋喃類代謝物3次相應(yīng)的RSD值均<10%，精密度良好。

表4 檢測(cè)方法精密度Tab 4 Precision of inspection method

2.4 實(shí)際樣品測(cè)定 為驗(yàn)證方法的可靠性，從超市購買了多種類水產(chǎn)品(魚片、河蝦、明蝦、螃蟹)，根據(jù)改進(jìn)后的方法進(jìn)行測(cè)定。多數(shù)陰性樣品各離子譜圖較為干凈，沒有檢出。其中一明蝦樣品檢出含有呋喃西林代謝物(SEM)，該樣品在對(duì)應(yīng)時(shí)間出峰明顯(圖9)，多次重復(fù)檢測(cè)后判定其為陽性樣品。

3 討論與結(jié)論

在硝基呋喃類代謝物殘留檢測(cè)時(shí)，固相萃取方法在樣品前處理的凈化方面具有明顯效果，可同時(shí)完成樣品的提取與凈化，大大提高檢測(cè)靈敏度。華正罡[11]等采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定雞肉中硝基呋喃類藥物殘留，對(duì)陰離子交換混合機(jī)理柱(MAX)和親水-親脂平衡料固相萃取柱(HLB)的凈化效果進(jìn)行考察，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在 pH 7.2～7.4時(shí) HLB 固相萃取柱回收率最高。王娜[12]等在高效液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用法檢測(cè)豬肉中四種硝基呋喃類代謝物中，衍生溶液用Oasis HLB固相萃取柱凈化，甲醇洗脫，流動(dòng)相定容，使用 Oasis HLB柱所得四硝基呋喃代謝物各自的平均回收率均在96.3% 以上。但是固相萃取方法也存在操作繁瑣、費(fèi)時(shí)較多、需要耗費(fèi)大量的有機(jī)溶劑等缺點(diǎn)。GB/T 20752-2006《豬肉、牛肉、雞肉、豬肝和水產(chǎn)品中硝基呋喃類代謝物殘留量的測(cè)定》[10]中采用Oasis HLB固相萃取柱凈化，Oasis HLB 需要提前用甲醇和水活化，同時(shí)一定要保證柱體濕潤。另外，固相萃取對(duì)畜肉、禽肉等動(dòng)物組織具有較好的提取凈化效果，但對(duì)基質(zhì)比較復(fù)雜的水產(chǎn)樣品(魚、蝦、蟹和貝類)，樣品組織提取液呈黏稠、膠體狀，則易產(chǎn)生堵塞、不宜洗脫。因此，采用GB/T 20752-2006的方法處理樣品，效果并不好，因此，需要改進(jìn)樣品的提取凈化方式。

圖9 陽性樣品SEM及其內(nèi)標(biāo)出峰譜圖Fig 9 The mass-spectrogram of SEM and its internal-standard for of Positive Sample

劉四新[13]等研究液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)水產(chǎn)品硝基呋喃類代謝物，對(duì)現(xiàn)行GB/T 20752-2006中的前處理中的樣品稱取量、水解和衍生化、凈化和定容試劑都進(jìn)行了改進(jìn)，其中在凈化環(huán)節(jié)采用乙酸乙酯液液萃取，改進(jìn)后方法的回收率為81.3%～106.0%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于11%。吳亞梅[14]等就農(nóng)業(yè)部783號(hào)公告-1-2006(簡(jiǎn)稱方法1)和GB/T 20752-2006(簡(jiǎn)稱方法2)兩種檢測(cè)方法進(jìn)行對(duì)比研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)方法1采用乙酸乙酯提取的前處理方法簡(jiǎn)單，檢測(cè)信號(hào)干擾少，檢出限、精密度和回收率優(yōu)于方法 2，結(jié)果相對(duì)更準(zhǔn)確可靠。在水產(chǎn)中硝基呋喃類代謝物檢測(cè)時(shí)，樣品經(jīng)酸水解后衍生化，采用乙酸乙酯直接提取，氮吹后用流動(dòng)相溶解殘留物，然后上機(jī)檢測(cè)。該方法操作簡(jiǎn)單，提取液易揮干(約20 min)，無需固相萃取特殊裝置，成本較低，并且通過二級(jí)質(zhì)譜的高選擇性，可以進(jìn)一步排除雜質(zhì)的干擾，結(jié)果也比較穩(wěn)定。

在本文研究中，以國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 20752-2006的實(shí)驗(yàn)方法為基礎(chǔ)，對(duì)樣品前處理過程進(jìn)行了改進(jìn)，樣品衍生后采用乙酸乙酯直接提取，操作步驟簡(jiǎn)單方便。經(jīng)過多次試驗(yàn)，證明改進(jìn)后方法的結(jié)果及穩(wěn)定性可靠，四種代謝物回收率控制在90%～120%以內(nèi)，RSD<10%，能夠達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)要求的目標(biāo)物檢出限，可適用于日常水產(chǎn)品中硝基呋喃代謝物的大批量樣品檢測(cè)工作。