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        中獸藥散劑中非法添加酰胺醇類藥物的檢測方法研究

        2019-10-14 01:22:10李應(yīng)超王亞芳張連彥張小飛鐘昆芮
        中國獸藥雜志 2019年9期

        高 婷,李應(yīng)超,王亞芳,張連彥,張小飛,鐘昆芮

        (北京市獸藥監(jiān)察所,北京 102629)

        酰胺醇類藥物,主要有氯霉素、甲砜霉素及氟苯尼考,其作為一種抑菌性廣譜抗生素,作用是抗感染,可作用于細菌核糖核蛋白體的 50S 亞基,而阻撓蛋白質(zhì)的合成[1]。由于其價格低廉,可大量生產(chǎn),因此有些不法商家將酰胺醇類藥物加入綠色、安全的中獸藥散劑中,以提高藥物抗菌作用。添加的化學(xué)藥物與中藥的相互作用既有可能減弱療效,又有可能對動物產(chǎn)生新毒副作用[2-3]。非法添加酰胺醇類藥物導(dǎo)致畜禽產(chǎn)品中藥物殘留,對人的造血系統(tǒng)、消化系統(tǒng)具有嚴重的毒性反應(yīng),有可能引發(fā)人的再生障礙性貧血[4-5],因此急須建立一種穩(wěn)定的、可靠的方法監(jiān)測中獸藥散劑中酰胺醇類藥物的非法添加現(xiàn)象。

        目前,中獸藥制劑中非法添加化學(xué)藥物分析檢測的技術(shù)手段主要有顯微鑒別[6]、薄層色譜分析[7]、高效液相色譜[8-9]、液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)[10]等。顯微鑒別方法能夠?qū)崿F(xiàn)快速檢測,但該方法只能進行初步定性;薄層色譜分析也是起到初篩的作用,存在假陽性的風(fēng)險;液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)—般不作為主要分析手段用于常量分析。高效液相色譜以分離性能高、分析速度快,通過保留時間及紫外圖譜雙重定性,減小了假陽性的可能性,因此,高效液相色譜不僅是獸藥檢驗的常用分析方法,也是檢查中獸藥制劑中非法添加化學(xué)藥物的最主要的分析手段。

        實驗在上述文獻的基礎(chǔ)上,結(jié)合國家標(biāo)準(zhǔn),對中獸藥散劑中非法添加酰胺醇類藥物進行研究,以滿足檢測需要。試樣經(jīng)40%甲醇溶解、離心、定容,最后經(jīng)高效液相色譜二極管陣列檢測器檢測。本方法快速、高效,能夠準(zhǔn)確測定中獸藥散劑中非法添加的酰胺醇類藥物。

        1 材料與方法

        1.1 儀器與試劑 高效液相色譜儀(Agilent 1100,美國,配有二極管陣列檢測器)、電子天平(Mettler Toledo,瑞士)。甲醇、乙腈(色譜級,美國Fisher公司),實驗用水由MilliQ-Gradient 超純水系統(tǒng)(美國Millipore公司)制備。

        1.2 對照品 甲砜霉素對照品(來源:中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所,批號K0241406,含量99.7%)、氟苯尼考對照品(來源:中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所,批號K0301305,含量99.3%)、氯霉素對照品(來源:中國藥品生物制品檢定研究院,批號130555-201203,含量99.8%)。

        1.3 供試品 健胃散、止痢散、球蟲散、胃腸活等中獸藥散劑均來自企業(yè)審批檢驗的合格產(chǎn)品。

        1.4 色譜條件 色譜柱為Waters Atiantis?T3 5 μm,4.6 mm×250 mm。流動相A為甲醇;流動相B為乙腈;流動相C為水,梯度洗脫。流速1.0 mL/min;檢測波長為224和278 nm;進樣體積為10 μL。流動相梯度洗脫方法如表1所示。

        表1 梯度洗脫方法Tab 1 The method of gradient elution

        1.5 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

        1.5.1 對照品儲備溶液 分別精密稱取甲砜霉素、氟苯尼考、氯霉素對照品50、50、125 mg置100 mL量瓶中,加40%甲醇溶液超聲使溶解,用40%甲醇溶液稀釋至刻度,濃度分別為0.5、0.5、1.25 mg/mL,用時根據(jù)需要稀釋至相應(yīng)濃度。

        1.5.2 系統(tǒng)適用性溶液 精密稱取甲砜霉素、氟苯尼考和氯霉素對照品各25 mg,置50 mL量瓶中,加40%甲醇溶液適量,超聲使溶解,放置至室溫,加40%甲醇溶液稀釋至刻度,搖勻;精密量取5 mL,置50 mL量瓶中,加40%甲醇溶液稀釋至刻度,搖勻,濃度為50 μg/mL。

        1.6 樣品溶液的制備

        1.6.1 陰性樣品儲備溶液 分別稱取供試品0.50 g,精密加入50 mL 40%甲醇溶液超聲,6000 r/min離心5 min,取上清液備用。

        1.6.2 陰性樣品溶液 精密量取陰性樣品儲備液1 mL,精密加入9 mL 40%甲醇溶液,混勻,上機前使用0.45 μm濾膜過濾。

        1.6.3 陽性樣品溶液 精密量取陰性樣品儲備液1 mL,精密加入對照品儲備液1 mL和8 mL 40%甲醇溶液,混勻。上機前使用0.45 μm濾膜過濾。

        1.6.4 陽性添加樣品 按照甲砜霉素、氟苯尼考及氯霉素制劑常用規(guī)格,即5%,5%,12.5%的比例在供試品中添加3種酰胺醇類藥物。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 系統(tǒng)適用性試驗 取40%甲醇溶液、系統(tǒng)適用性溶液、陰性樣品溶液、陽性添加樣品溶液,在本試驗確定色譜條件下測定,記錄色譜峰,如圖1,圖2,圖3,圖4所示。在此測定條件下,40%甲醇溶液及各陰性樣品溶液對待測組分沒有干擾,各藥物之間的分離度良好,甲砜霉素、氟苯尼考和氯霉素的出峰時間分別為9.1、18.7、24.2 min,各目標(biāo)峰純度角小于純度閾值,表明峰的純度較好。

        圖1 40%甲醇溶液色譜圖Fig 1 The chromatogram of 40% Methanol solution

        圖2 酰胺醇類藥物對照品溶液(50 μg/mL)色譜圖Fig 2 The chromatogram of Amide alcohol reference solution (50 μg/mL)

        圖3 健胃散-空白色譜圖Fig 3 The blank chromatogram of Jianweisan

        圖4 健胃散-添加(50 μg/mL)色譜圖Fig 4 The chromatogram of Jianweisan-addition (50 μg/mL)

        2.2 精密度試驗 取濃度為50 μg/mL的甲砜霉素、氟苯尼考和氯霉素的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,在本試驗確定色譜條件下,連續(xù)進樣6次,其峰面積的RSD分別為0.11%、0.11%、0.13%,表明在該色譜條件下檢測,標(biāo)準(zhǔn)溶液精密度良好。

        2.3 重現(xiàn)性試驗 按陽性添加樣品的制備方法制備6份健胃散添加溶液,在本試驗確定色譜條件下進樣,測定甲砜霉素、氟苯尼考和氯霉素的峰面積,RSD分別為2.13%、2.56%、2.29%,表明此方法的重現(xiàn)性良好。

        2.4 檢測限 精密量取各樣品的陰性樣品儲備液1 mL,置15 mL離心管中,精密加入系統(tǒng)適用性溶液適量(0.5 mL、0.6 mL和0.8 mL),用40%甲醇溶液稀釋至10 mL,搖勻,在本試驗確定色譜條件下進樣,以光譜未失真的最低添加量作為檢測限。經(jīng)對比光譜圖及純度峰,所檢測藥物中甲砜霉素的檢測限為3 g/kg、氟苯尼考及氯霉素的檢測限均為4 g/kg,如圖5至16所示。

        圖5 甲砜霉素-對照品(50 μg/mL)光譜圖Fig 5 The spectrum of Thiopentomycin-reference (50 μg/mL)

        圖6 甲砜霉素-對照品(50 μg/mL)純度峰Fig 6 The purity peak of Thiamphenicol- reference (50 μg/mL)

        圖7 氟苯尼考-對照品(50 μg/mL)光譜圖Fig 7 The spectrum of Fluoroquinol -reference (50 μg/mL)

        圖9 氯霉素-對照品(50 μg/mL)光譜圖Fig 9 The spectrum of Chloramphenicol-reference (50 μg/mL)

        圖10 氯霉素-對照品(50 μg/mL)純度峰Fig 10 The purity peak of Chloramphenicol-reference (50 μg/mL)

        圖11 止痢散(甲砜霉素3 g/kg)光譜圖Fig 11 The spectrum of Zhili San (Memboxin 3 g/kg)

        圖12 止痢散(甲砜霉素3 g/kg)純度峰Fig 12 The purity peak of Zhili San (Memboxin 3 g/kg)

        圖13 止痢散(氟苯尼考4 g/kg)光譜圖Fig 13 The spectrum of Zhili San (Flufenicol 4 g/kg)

        圖14 止痢散(氟苯尼考4 g/kg)純度峰Fig 14 The purity peak of Zhili San (Flufenicol 4 g/kg)

        圖15 止痢散(氯霉素4 g/kg)光譜圖Fig 15 The spectrum of Zhili San (Chloramphenicol 4 g/kg)

        圖16 止痢散(氯霉素4 g/kg)純度峰Fig 16 The purity peak of Zhili San (Chloramphenicol 4 g/kg)

        2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密量取甲砜霉素、氟苯尼考和氯霉素的對照品儲備液,用40%甲醇稀釋至濃度分別為10、20、50、100、250、500 μg/mL,在本試驗的色譜條件下進行測定,以系列標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為橫坐標(biāo),峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,三種藥物的線性方程分別為y=21.46x-7.1245;y=21.009x-4.1586;y=15.876x-3.5812,相關(guān)系數(shù)R2均在0.999以上,如圖17所示。結(jié)果表明,三種藥物在10~500 μg/mL濃度范圍內(nèi)時,藥物濃度與相應(yīng)峰面積線性關(guān)系良好。

        2.6 加樣回收率試驗 在陰性樣品中按照80%,100%,120%添加甲砜霉素、氟苯尼考和氯霉素3種酰胺醇類藥物,按外標(biāo)法計算其回收率,三種藥物的回收率在均在98.0%~103.0%,變異系數(shù)均在0.6%~1.6%,其試驗結(jié)果如表2所示。

        圖17酰胺醇類藥物標(biāo)準(zhǔn)曲線方程與相關(guān)系數(shù)Fig 17 Standard curve equation and correlation coefficient of amide alcohols

        表2 中獸藥散劑中添加酰胺醇類藥物(甲砜霉素、氟苯尼考和氯霉素)的回收率和變異系數(shù)(n=9)Tab 2 Recovery and coefficient of variation of amide alcohols (Methamphetamine,Florfenicol and Chloramphenicol)added to Chinese veterinary drug powder (n=9)

        3 討論與結(jié)論

        3.1 中獸藥散劑種類的選擇 一直以來,中獸藥具有綠色、安全、無殘留的特點,備受廣大養(yǎng)殖戶的青睞,寄托了獸醫(yī)獸藥行業(yè)的厚望。本試驗選擇的四種中獸藥散劑為養(yǎng)殖過程中的常用藥,均有一定的預(yù)防和治療腸道感染的作用。其中健胃散具有治療嘔吐反胃、消化不良的功效;止痢散具有治療濕熱瀉痢、熱毒血痢的功效;球蟲散具有抗球蟲病、涼血止血的功效;胃腸活具有治療消化不良的功效。酰胺醇類藥物,屬抑菌性廣譜抗生素,用于治療敏感細菌所致的呼吸系統(tǒng)、腸道及尿路等感染,故在畜禽養(yǎng)殖中極有可能被非法添加到上述四種中獸藥散劑中,用于加強預(yù)防及治療細菌感染。

        3.2 色譜柱及柱溫的選擇 通過改變柱溫,未見色譜圖有明顯變化,考慮到本方法檢測較多樣品及采用梯度洗脫的方式,試驗選擇以35℃為檢測溫度,以提高色譜峰的重現(xiàn)性。本試驗使用了不同品牌、不同型號的色譜柱:Waters Atiantis?T3 (5 μm,4.6 mm×250 mm)、Waters symmetry C18 (5 μm,4.6 mm×250 mm)、Waters Xterra C18(5 μm,4.6 mm×250 mm)、Agilent Eclipse XDB-C18(5 μm,4.6 mm×150 mm)等色譜柱,綜合考慮待測組分與其他藥物的分離度,以及保留時間和靈敏度,只有Waters Atiantis?T3(5 μm,4.6 mm×250 mm)對甲砜霉素保留時間較長,能使被測成分有效的分離,并且與其他成分峰不產(chǎn)生干擾。其他色譜柱不能使中獸藥制劑與三種酰胺醇類藥物有效的分離,或者不能將三種被測藥物有效的分離。

        3.3 流動相的選擇 試驗在優(yōu)化流動相的過程中盡量避免引入酸或鹽類物質(zhì),以免減少柱子壽命。本試驗探究了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-乙腈-水三種流動相組合,經(jīng)比較甲醇-乙腈-水的分離效果比甲醇-水或乙腈-水的分離效果要好。由于中藥的成分比較復(fù)雜,等度洗脫未能完全實現(xiàn)藥物的基線分離,因此選擇梯度洗脫,洗脫程序為表1,其中甲砜霉素的極性最強,最先出峰,保留時間為9.3 min,氟苯尼考居中,保留時間為19.1 min,氯霉素的極性最弱,最后出峰,保留時間為24.2 min,此時三種酰胺醇類藥物能實現(xiàn)基線分離,并能與中獸藥制劑中的成分有效的分離。

        3.4 結(jié)論 試驗采用高效液相色譜-二極管陣列檢測器、梯度洗脫的方法,建立的中獸藥散劑中非法添加酰胺醇類藥物檢查方法,能夠?qū)崿F(xiàn)添加的酰胺醇藥物與固體制劑藥物中其他成分的有效分離,經(jīng)峰純度檢查確保酰胺醇類藥物出峰處無干擾,同時該方法較穩(wěn)定、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好,可用于中獸藥散劑中酰胺醇類藥物的檢測。此外,經(jīng)試驗驗證,該方法對于β-內(nèi)酰胺類、四環(huán)素類等固體藥物制劑中酰胺醇類非法添加的檢測也具有較好的效果。

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