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        高效液相色譜法測定不同產(chǎn)地蒲黃藥材中3種黃酮苷元含量

        2019-10-14 01:57:50楊棣華梁文能
        中國藥業(yè) 2019年19期
        關(guān)鍵詞:蒲黃異鼠槲皮素

        楊棣華,梁文能

        (廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院,廣東 廣州 510405)

        蒲黃為香蒲科植物水燭香蒲Typha angustifoliaL.、東方香蒲T.orientalisPresl或同屬植物的干燥花粉,通常夏季采收,篩取花粉,作為藥用[1]。臨床主要用生品蒲黃和蒲黃炭,二者作用稍有不同,生品主要用于活血化瘀,蒲黃炭主要用于外傷出血[2-3]。蒲黃的主要活性成分為黃酮苷及苷元[4-5]。2015 年版《中國藥典(一部)》中采用薄層色譜和液相色譜對其苷元香蒲新苷和異鼠李素-3-O-新橙皮苷進(jìn)行測定[1]。黃酮苷和苷元在藥理中都具有活性,黃酮苷類化合物也具有活血化瘀作用[6-7]。目前,對于黃酮苷類的測定方法主要有紫外光譜法[8-9]、毛細(xì)管電泳法[10]、高效液相色譜法[11-12]等,本研究中根據(jù)黃酮苷的化學(xué)性質(zhì)并參考文獻(xiàn)[13]建立高效液相色譜法,測定不同產(chǎn)地蒲黃中3種黃酮苷元的含量并比較其差異,為優(yōu)化蒲黃的質(zhì)量和臨床使用提供參考?,F(xiàn)報道如下。

        1 儀器與試藥

        1.1 儀器

        Ulitimate3000型高效液相色譜儀,包括四元洗脫泵,DAD檢測器和變色龍工作站(美國賽默飛世爾儀器公司);BSA-124S型電子天平(十萬分之一,德國賽多利斯公司)。

        1.2 試藥

        槲皮素對照品(批號為100081-201408,質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 99.1%),山柰素對照品(批號為 110861-201310,質(zhì)量分?jǐn)?shù)為93.2%),異鼠李素對照品(批號為110860-201109,質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.0%),均購于中國食品藥品檢定研究院;甲醇(色譜純,美國Fisher公司);水為超純水(美國Milli-Q公司);磷酸(分析純,國藥試劑化學(xué)有限公司);蒲黃藥材分別來源于江蘇、內(nèi)蒙古、陜西、安徽、寧夏、湖北、四川、廣西8個不同產(chǎn)地的12批藥材(見表1),經(jīng)我院梁文能副主任藥師鑒定為香蒲科植物水燭香蒲Typha angustifoliaL.的干燥花粉,均符合藥典要求。

        表1 不同產(chǎn)地蒲黃藥材樣品

        2 方法與結(jié)果

        2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗

        色譜柱:Hypersil BDS-C18柱(250 mm × 4.6 mm,5 μm);流動相:甲醇 -0.4% 磷酸溶液(50 ∶50,V/V);流速:1.0 mL/min;柱溫:30 ℃;檢測波長:360 nm;進(jìn)樣量:10 μL。在此色譜條件下,理論板數(shù)按槲皮素峰計不低于 3690,拖尾因子為 0.95 ~1.05,各色譜峰分離度均大于1.5。色譜圖見圖1。

        圖1 高效液相色譜圖

        2.2 溶液制備

        取置五氧化二磷干燥12 h以上的槲皮素10.12 mg,精密稱定,置 25 mL容量瓶中,山柰素 5.82 mg置25 mL容量瓶中,異鼠李素6.05 mg置50 mL容量瓶中,加甲醇分別稀釋至刻度,搖勻,作為對照品貯備液。分別精密吸取上述槲皮素對照品貯備液1 mL、山柰素對照品貯備液1 mL和異鼠李素對照品貯備液5 mL,置同一10 mL量瓶中,加甲醇稀釋至刻度,搖勻,作為對照品混合溶液(每1 mL含槲皮素40.48 μg、山柰素23.28 μg、異鼠李素 60.50 μg)。取浙江湖州產(chǎn)的蒲黃藥材粉碎,過4號篩,取粉末1.0 g,精密稱定,精密加入甲醇 -25%鹽酸溶液(4∶1,V/V)的混合溶液 25 mL,加熱回流提取1 h,迅速冷卻至室溫,轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中,用甲醇稀釋至刻度,搖勻,用0.45 μm微孔濾膜濾過,取續(xù)濾液,作為供試品溶液。

        2.3 方法學(xué)考察

        線性關(guān)系考察:精密吸取對照品混合溶液1,2,5,10,25 μL,分別注入液相色譜儀,按擬訂色譜條件進(jìn)樣測定,以進(jìn)樣量(X,ng)為橫坐標(biāo)、相對應(yīng)的峰面積(Y)為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。結(jié)果見表2。

        表2 方法學(xué)考察結(jié)果

        精密度試驗:取對照品混合溶液,按擬訂色譜條件進(jìn)樣10 μL,重復(fù)6次,記錄峰面積。結(jié)果見表2,表明儀器精密度良好。

        穩(wěn)定性試驗:取同一供試品(批號為180501)溶液,按擬訂色譜條件分別于 0,1,2,4,8,12,24 h 時進(jìn)樣測定,進(jìn)樣量為10 μL,記錄色譜峰面積。結(jié)果見表2,表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

        重復(fù)性試驗:取同一批蒲黃藥材(批號為180501),依法制備供試品溶液,平行6份,按擬訂色譜條件進(jìn)樣測定。結(jié)果見表2,表明方法重復(fù)性良好。

        加樣回收試驗:精密稱取已知含量的蒲黃藥材(批號為 180501)粉末 0.50 g,平行制備 6份供試品;分別精密吸取槲皮素貯備液3 mL,置10 mL容量瓶中(每1 mL含槲皮素0.1214 mg)作為待加溶液,分別精密量取上述槲皮素待加對照品溶液1 mL,山柰素對照品貯備液1 mL,異鼠李素對照品貯備溶液3 mL,加入6份供試品中,依法制備供試品溶液,按擬訂色譜條件進(jìn)樣測定,分別計算回收率。結(jié)果見表3。

        2.4 樣品含量測定

        取上述不同產(chǎn)地的樣品,依法制備供試品溶液并測定,用標(biāo)準(zhǔn)曲線法計算含量(以干燥品計)。結(jié)果見表4。

        3 討論

        按《中國藥典(一部)》蒲黃含量測定的取樣量進(jìn)行考察,分別取樣 0.5,1.0,2.0 g。當(dāng)取樣量少時,色譜峰面積較小,基線噪音干擾較大;取樣量太大,則對照品稱樣需要增大,易造成對照品浪費。故選擇1.0 g作為取樣量。參照銀杏葉中3種黃酮苷的測定方法對供試品溶液的制備方法進(jìn)行考察,考察了鹽酸的不同比例(甲醇-10%鹽酸溶液、甲醇-25%鹽酸溶液、甲醇-35%鹽酸溶液)、不同提取方式(超聲、回流、索氏提?。⒉煌崛r間(30,60,90 min)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),甲醇和鹽酸的用量對3種黃酮苷元的含量影響很大。鹽酸濃度低,水解不完全,提取率低;鹽酸濃度大,對液相色譜的管路有腐蝕作用,同時酸濃度過大對色譜柱的要求較高,影響其適用性。綜合考慮,采用25%鹽酸溶液進(jìn)行水解,同時對甲醇 -25%鹽酸溶液不同體積比(1 ∶1,2 ∶1,4 ∶1,8 ∶1,10 ∶1,V/V)進(jìn)行考察,結(jié)果甲醇 -25%鹽酸溶液(4 ∶1,V/V)提取效率最高,回流和索氏提取效率基本一致,均高于超聲,由于回流方法簡單,故采用回流提取。提取時間在60 min以后含量基本不變,故采用提取時間為60 min,綜合考慮選擇甲醇 -25%鹽酸溶液(4 ∶1,V/V),回流提取60 min作為供試品溶液的制備方法。

        表33種黃酮苷元的加樣回收結(jié)果(n=6)

        表4 不同產(chǎn)地蒲黃藥材中3種黃酮苷含量測定結(jié)果(mg/g,n=2)

        參考2015年版《中國藥典(一部)》銀杏葉藥材及其制劑[13]項下含量測定條件,對色譜條件中的流動相和檢測波長進(jìn)行了考察,采用DAD檢測器在200~400 nm波長內(nèi)進(jìn)行全波長掃描,分別結(jié)合槲皮素、山柰素和異鼠李素3種對照品的光譜圖進(jìn)行比較,最后選擇檢測波長為360 nm。考察流動相的組分,分別以甲醇-0.4%磷酸溶液、乙腈-0.4%磷酸溶液、乙腈-水和甲醇-水作為流動相,結(jié)果發(fā)現(xiàn)以甲醇-水和乙腈-水作為流動相時,異鼠李素的峰均有拖尾現(xiàn)象,對稱因子較低,而采用甲醇-0.4%磷酸溶液為流動相時,供試品中3種成分的色譜法峰形良好,基線平穩(wěn),對稱因子為0.95~1.05內(nèi),理論板數(shù)高,陰性對照無干擾。故確定甲醇-0.4%磷酸溶液為流動相,檢測波長為360 nm,與《中國藥典(一部)》中銀杏葉項下色譜條件一致。

        本研究結(jié)果顯示,不同產(chǎn)地的蒲黃藥材中3種黃酮苷的含量差異較大,廣西桂林產(chǎn)的蒲黃藥材中3種黃酮苷類成分含量最高,槲皮素為0.3721 mg/g,山柰素為0.4173 mg/g,異鼠李素為 1.7028 mg/g,這可能與當(dāng)?shù)貧夂蚝蜕L環(huán)境有關(guān)。蒲黃多生長在沼澤湖泊周圍等水量充足的地方,寧夏固原產(chǎn)和內(nèi)蒙古包頭產(chǎn)的蒲黃藥材中3種黃酮苷元成分含量最低,可能與當(dāng)?shù)亟涤炅可儆嘘P(guān)??梢姡煌a(chǎn)地蒲黃藥材中3種黃酮苷類成分差異較大,故建議增加黃酮苷類化合物作為蒲黃藥材的質(zhì)控指標(biāo)。不同產(chǎn)地蒲黃藥材對其臨床使用具有一定影響,臨床使用蒲黃藥材應(yīng)多采購廣西、江蘇、湖北等地的,可保證藥效的最大限度發(fā)揮,同時為開發(fā)和利用蒲黃藥材的藥用價值提供參考。

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