蔣莉 蔡安季 文錦麗 李寧 戴勇

急性 B 淋巴細胞白血?。˙-cell acute lymphoblastic leukemia，B-ALL）是由原始B淋巴細胞在骨髓、外周血或髓外組織克隆性異常增生所導致的一種急性血液系統(tǒng)惡性腫瘤，好發(fā)于2～5歲的兒童，在兒童以及成人的急性淋巴細胞白血?。╝cute lymphoblastic leukemia，ALL）中分別占85%以及75%，是最常見的一種ALL亞型[1，2]。近年來隨著對B-ALL發(fā)病機制研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)了一些有價值的診斷標志物和治療的分子靶點，同時也提出了一些更有針對性的治療方案且取得了一定的效果。但對于成人B-ALL患者，包括化療、自體外周血干細胞移植等多種方法都不能提高總體的療效，治療后復發(fā)頻繁發(fā)生；復發(fā)患者多在6個月內(nèi)死亡，其5年生存率僅為7%[3]。因此，迫切需要對成人B-ALL的致病機理進行研究，以尋找新的分子靶點和治療方法。

在人類白血病中，多種細胞遺傳學缺陷均可引起轉(zhuǎn)錄因子的異常[4，5]。最近的研究發(fā)現(xiàn)，miRNA（microRNA，微小RNA）參與的基因表達調(diào)控在白血病的發(fā)生、發(fā)展中具有十分重要的作用[6]。miRNA與轉(zhuǎn)錄因子（Transcription factor，TF）常通過兩者之間的相互作用更精確地調(diào)節(jié)靶基因的表達，這是哺乳動物體內(nèi)一種重要的基因調(diào)控模式。因此，以miRNA與轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控作為切入點，從系統(tǒng)水平上研究B-ALL的發(fā)病機制具有非常重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 一般資料 15例成人B-ALL患者以及10例非惡性血液病對照者的骨髓標本均采集自廣東醫(yī)科大學附屬醫(yī)院血液科的住院患者。成人B-ALL患者，男7例，女8例，年齡18～71歲，平均36.5歲；全部患者均為初發(fā)病例，在采樣前均未接受化療或放療，且均符合B-ALL的診斷標準。非惡性血液病對照者為骨髓象正常的發(fā)熱或貧血原因待查的患者，其中男6例，女4例，年齡10～73歲，平均39.0歲。本研究經(jīng)廣東醫(yī)科大學附屬醫(yī)院倫理學委員會批準，并征得所有患者的知情同意。

1.1.2 實驗材料 組織核蛋白抽提試劑盒、Spin column separation system 試劑盒、TranSignalTMProtein/DNA 轉(zhuǎn)錄因子芯片（美國Panomics公司）；SuperscriptTMⅢ反轉(zhuǎn)錄酶（Invitrogen 公司）；2×SYBR Green PCR 混合液（Applied Biosystems公司）。

1.2 方法

1.2.1 Illumina測序 參照我們以前的方法應用Illumina HiSeq 2000 測序系統(tǒng)進行高通量 miRNA測序[7]。

1.2.2 轉(zhuǎn)錄因子芯片檢測 采用美國TranSignalTMProtein/DNA轉(zhuǎn)錄因子芯片進行芯片的雜交與檢測。按照組織核蛋白抽提試劑盒說明抽提組織核蛋白，Bradford法檢測蛋白濃度。25μg的組織核蛋白抽提物與生物素標記的DNA探針混勻，15℃孵育30min，得到核蛋白/DNA探針復合物。該復合物經(jīng)20g/L瓊脂糖凝膠在0.5×TBE電泳緩沖液中120V電泳20min，回收并純化核蛋白/DNA探針復合物；然后按照 Spin column separation system 試劑盒說明書洗脫、分離出游離的探針。洗脫下來的探針95℃變性3min后迅速放置在冰上2min，隨后置入雜交瓶里與芯片膜42℃雜交24h。1×封閉緩沖液室溫封閉芯片膜15min，加入HRP偶聯(lián)鏈酶素親和素抗體（1∶500），室溫孵育 15min，顯影，X 光片曝光。X光片上的圖像經(jīng)ImageScanner掃描和ScanAlyze軟件處理，獲得芯片檢測數(shù)據(jù)。實驗組信號強度/對照組信號強度的比值≥2.0或≤0.5均判定差異有意義。

1.2.3 實時定量 PCR（q-PCR）使用 Oligo（dT）作為反轉(zhuǎn)錄引物，參照SuperscriptTMⅢ反轉(zhuǎn)錄酶說明書進行cDNA的合成。以18S rRNA作為內(nèi)參照，根據(jù) 2×SYBR Green PCR 混合液說明書，在 ABI Prism? 7500型熒光定量PCR儀上進行q-PCR反應。q-PCR反應參數(shù)為：95℃預反應10min；然后95℃變性10s，60℃退火和延伸60s，重復40個循環(huán)。用2-△△Ct法計算miRNA的差異表達比值。

1.2.4 miRNA和轉(zhuǎn)錄因子的生物信息學關(guān)聯(lián)分析

1.2.4.1 差異表達miRNA的靶基因預測 應用miRanda、TargetScan、PicTar以及miRTarBase四個數(shù)據(jù)庫，選擇miRNA測序中差異表達倍數(shù)≥2的miRNA進行靶基因預測。其中，轉(zhuǎn)錄因子也作為基因參與miRNA的靶基因預測。為了提高靶基因預測的準確性，將 miRanda、TargetScan、PicTar三個數(shù)據(jù)庫中任意兩個數(shù)據(jù)庫預測到的靶基因與miRTarBase數(shù)據(jù)庫中已經(jīng)實驗驗證的靶基因取并集獲得候選的miRNA及其靶基因。

1.2.4.2 獲取與B-ALL相關(guān)的miRNA-靶基因配對以及miRNA-靶轉(zhuǎn)錄因子配對 為了減少冗余，將上述候選的miRNA靶基因與MalaCards數(shù)據(jù)庫中B-ALL相關(guān)的基因和轉(zhuǎn)錄因子取交集，獲取與B-ALL相關(guān)的miRNA-靶基因配對以及miRNA-靶轉(zhuǎn)錄因子配對。

1.2.4.3 轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點的預測 提取miRNA-靶基因配對以及miRNA-靶轉(zhuǎn)錄因子配對中的相應miRNA以及靶基因進行轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點的預測。取基因轉(zhuǎn)錄起始點上游5 000 bp到下游1 000 bp區(qū)域，應用UCSC Genome Browser中的TFBS Conserved Track數(shù)據(jù)庫進行轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點的預測。

1.2.4.4 生物信息學預測的轉(zhuǎn)錄因子與轉(zhuǎn)錄因子芯片檢測中差異表達轉(zhuǎn)錄因子的合并 為了提高轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點預測的準確性，將生物信息學預測的轉(zhuǎn)錄因子與轉(zhuǎn)錄因子芯片檢測中差異表達倍數(shù)≥2的轉(zhuǎn)錄因子取交集，然后提取相應的miRNA以及靶基因獲得與B-ALL相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子-miRNA配對以及轉(zhuǎn)錄因子-靶基因配對。

1.2.4.5 構(gòu)建miRNA-轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控網(wǎng)絡及網(wǎng)絡節(jié)點分析 合并轉(zhuǎn)錄因子-miRNA配對、轉(zhuǎn)錄因子-靶基因配對、miRNA-靶基因配對以及miRNA-靶轉(zhuǎn)錄因子配對，構(gòu)建miRNA-轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控網(wǎng)絡并利用Gephi軟件繪制調(diào)控網(wǎng)絡圖。在miRNA-轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控網(wǎng)絡中查找前饋環(huán)與反饋環(huán)調(diào)控模塊，并選擇連通度≥10的節(jié)點作為中心節(jié)點，鑒定出相應的核心調(diào)控因子。利用基因功能注釋工具GO（Gene Ontology，基因本體論）數(shù)據(jù)庫和KEGG數(shù)據(jù)庫對網(wǎng)絡節(jié)點進行GO分析和Pathway分析，查找與B-ALL相關(guān)的信號通路以及基因功能分類。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)錄因子的差異表達分析兩組樣本共檢測出201個差異表達的轉(zhuǎn)錄因子，其中57個轉(zhuǎn)錄因子在B-ALL組呈表達上調(diào)，144個轉(zhuǎn)錄因子呈表達下調(diào)；在芯片檢測結(jié)果中，我們選擇4個表達上調(diào)以及4個表達下調(diào)的轉(zhuǎn)錄因子，應用q-PCR技術(shù)驗證了轉(zhuǎn)錄因子芯片結(jié)果的可靠性，其檢測結(jié)果的變化趨勢一致。

2.2 構(gòu)建miRNA-轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控網(wǎng)絡通過合并miRNA-靶基因、miRNA-靶轉(zhuǎn)錄因子、轉(zhuǎn)錄因子-miRNA以及轉(zhuǎn)錄因子-靶基因4種配對關(guān)系見表1，我們構(gòu)建了成人B-ALL的miRNA-轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控網(wǎng)絡（見圖1）。

表1 B-ALL的miRNA-轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控網(wǎng)絡配對關(guān)系總結(jié)

圖1 成人急性B淋巴細胞白血病的miRNA-轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控網(wǎng)絡

2.3 網(wǎng)絡調(diào)控模塊分析以及核心調(diào)控因子的鑒定

我們從調(diào)控網(wǎng)絡中共鑒定出526個前饋環(huán)（feedforward loop，F(xiàn)FL）以及 9 個反饋環(huán)（feedback loop，F(xiàn)BL）調(diào)控模塊，見表2。此外，我們選擇連通度≥10的節(jié)點作為中心節(jié)點，在網(wǎng)絡中鑒定出47個核心調(diào)控因子，包括28個核心miRNA如miR-17-5p、miR-181b-5p、miR-29b-3p、miR-29c-3p、miR-20a-5p等；19個核心轉(zhuǎn)錄因子如CREB1、MYC、FOXO4、NFKB1、MEF2A 等。

表2 B-ALL的miRNA-轉(zhuǎn)錄因子-靶基因調(diào)控網(wǎng)絡中前饋環(huán)與反饋環(huán)調(diào)控模塊相關(guān)性總結(jié)

2.4 網(wǎng)絡節(jié)點的GO分析和Pathway分析如表2所示，網(wǎng)絡節(jié)點的GO分析表明，網(wǎng)絡節(jié)點主要參與了基因表達的正性調(diào)控、大分子代謝過程的正性調(diào)控、造血或淋巴樣器官發(fā)育等10個生物學過程。Pathway分析表明，網(wǎng)絡節(jié)點主要富集在癌癥信號通路、癌癥轉(zhuǎn)錄失調(diào)信號通路以及慢性髓性白血病信號通路等25個信號通路。其中，PI3K-Akt信號通路、Jak-STAT信號通路、Ras信號通路以及細胞周期信號通路為目前已知的與B-ALL發(fā)病相關(guān)的信號通路。

3 討論

急性B淋巴細胞白血病是一種遺傳異質(zhì)性和復雜性疾病，多種不同類型的細胞遺傳學異常以及分子遺傳學突變在B-ALL發(fā)病機制中起重要作用[8，9]。但這些遺傳學上的變異無法完全解釋其生物學特征以及遺傳異質(zhì)性[9]。目前，B-ALL的發(fā)病機制尚未完全清楚。尤其，遺傳的異質(zhì)性和復雜性限制了其發(fā)病機制中起主導作用的核心調(diào)控因子與核心調(diào)控模塊的發(fā)現(xiàn)。因此，迫切需要對其發(fā)病機制進行進一步研究?；诟咄康谋磉_譜檢測技術(shù)以及生物信息學分析方法，系統(tǒng)生物學致力于在網(wǎng)絡水平探討生物分子的相互作用，有助于發(fā)現(xiàn)新的核心調(diào)控因子、調(diào)控模塊及其相關(guān)的信號通路，并在整體水平揭示疾病發(fā)生的分子機制[10，11]。因此，應用系統(tǒng)生物學方法研究B-ALL的發(fā)病機制具有一定的必要性。

作為一種具有基因表達調(diào)控功能的內(nèi)源性小片段單鏈RNA，miRNA與轉(zhuǎn)錄因子關(guān)系密切。轉(zhuǎn)錄因子較一般基因更有可能成為miRNA調(diào)控的靶標，其作為潛在靶標的概率較一般基因高出2倍左右[12，13]。miRNA可通過與轉(zhuǎn)錄因子mRNA的3'UTR結(jié)合下調(diào)其基因表達；而miRNA在轉(zhuǎn)錄階段也可受到同一轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控，轉(zhuǎn)錄因子可通過與miRNA基因啟動子的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點結(jié)合，調(diào)節(jié)miRNA的轉(zhuǎn)錄；兩者之間形成一種反饋調(diào)控關(guān)系，這種調(diào)控關(guān)系模塊稱之為反饋環(huán)（feedback loop，F(xiàn)BL）。此外，轉(zhuǎn)錄因子除了直接調(diào)控靶基因，還可通過調(diào)節(jié)miRNA轉(zhuǎn)錄間接調(diào)控同一靶基因表達，這樣轉(zhuǎn)錄因子、miRNA和靶基因三者之間就形成了一種前饋調(diào)控關(guān)系，這種調(diào)控關(guān)系模塊稱之為前饋環(huán)（feedforward loop，F(xiàn)FL）。根據(jù)前饋環(huán)中起主導作用的調(diào)控因子不同，可將前饋環(huán)分為miRNA主導的前饋環(huán)（miRNA-FFL）、轉(zhuǎn)錄因子主導的前饋環(huán)（TF-FFL）以及復合的前饋環(huán)（composite FFL）三種形式[14，15]。miRNA與轉(zhuǎn)錄因子的前饋環(huán)和反饋環(huán)共調(diào)控作用是哺乳動物體內(nèi)一種重要的基因調(diào)控模式。

為了探討miRNA與轉(zhuǎn)錄因子在B-ALL中的作用機制，本研究應用Illumina測序和轉(zhuǎn)錄因子芯片技術(shù)，對成人B-ALL與非惡性血液病對照組骨髓樣本的miRNA和轉(zhuǎn)錄因子的表達水平進行了對比分析，兩組樣本共檢測出差異表達的miRNA 291個（168個miRNA在B-ALL組呈表達上調(diào)，123個miRNA呈表達下調(diào)）以及差異表達的轉(zhuǎn)錄因子201個（57個轉(zhuǎn)錄因子在B-ALL組呈表達上調(diào)，144個呈表達下調(diào)）。隨后，我們應用qPCR技術(shù)分別驗證了Illumina測序以及轉(zhuǎn)錄因子芯片檢測結(jié)果的可靠性。通過運用系統(tǒng)生物學方法，將miRNA和轉(zhuǎn)錄因子表達譜與miRNA靶基因預測以及轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點預測等生物信息學分析相結(jié)合，本研究首次構(gòu)建了成人B-ALL的miRNA-轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控網(wǎng)絡，從中鑒定出526個FFL以及9個FBL調(diào)控模塊。有研究報道，F(xiàn)FL可作為基因調(diào)控網(wǎng)絡的核心，在疾病分子機制中發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)控作用[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，在這些調(diào)控模塊中TF-FFL占絕大多數(shù)（93.5%）。這與文獻報道在B淋巴細胞發(fā)育的miRNA-轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控網(wǎng)絡中其主要的調(diào)控模塊為TF-FFL基本一致[16]；提示TF-FFL在B細胞發(fā)育以及B-ALL發(fā)病機制中可能具有重要作用。

為了評估網(wǎng)絡的功能特性，本研究利用功能注釋工具GO數(shù)據(jù)庫以及KEGG數(shù)據(jù)庫對網(wǎng)絡節(jié)點進行了GO分析和Pathway分析。GO分析結(jié)果表明，網(wǎng)絡節(jié)點主要參與了包括基因表達的正性調(diào)控、大分子代謝過程的正性調(diào)控、造血或淋巴樣器官發(fā)育等10個生物學過程。其中，一半的生物學過程（包括基因表達的正性調(diào)控、造血或淋巴樣器官發(fā)育、造血、DNA依賴性的轉(zhuǎn)錄正性調(diào)控以及大分子生物合成的正性調(diào)控5個生物學過程）與B-ALL的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。Pathway分析結(jié)果表明，網(wǎng)絡節(jié)點主要富集在癌癥信號通路、癌癥轉(zhuǎn)錄失調(diào)信號通路以及慢性髓性白血病信號通路等25個信號通路。其中，PI3K-Akt信號通路、Jak-STAT信號通路、Ras信號通路以及細胞周期信號通路為目前已知的與 B-ALL 發(fā)病相關(guān)的信號通路[8，9，17～20]。此外，我們選擇連通度≥10的節(jié)點作為中心節(jié)點，鑒定出47個核心調(diào)控因子，包括28個核心miRNA和19個核心轉(zhuǎn)錄因子。在這些核心調(diào)控因子中，4個核心 miRNA（包括 miR-17-5p、miR-125b-5p、miR-18a-5p和miR-34a-5p）以及5個核心轉(zhuǎn)錄因子（包括MYC、STAT5A、STAT5B、FOXO1和HLF）已有文獻報道與B-ALL發(fā)病機制相關(guān)；其余的24個核心miRNA和14個核心轉(zhuǎn)錄因子為新發(fā)現(xiàn)的調(diào)控因子。

綜上所述，本研究首次構(gòu)建了成人B-ALL的miRNA-轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控網(wǎng)絡，從整體水平上闡述miRNA和轉(zhuǎn)錄因子對B-ALL相關(guān)基因的調(diào)控機制。多種核心調(diào)控因子可能成為B-ALL潛在的分子靶點，用于B-ALL發(fā)病機制的進一步研究。