趙小琴 楊奕櫻 楊慧云 羅英婷

吳茱萸堿是蕓香科植物吳茱萸、石虎和疏毛吳茱萸的干燥近成熟果實(shí)中的主要生物堿成分[1]。吳茱萸有溫中止嘔、散寒止痛、助陽(yáng)止瀉的功效[2]，而它的提純物吳茱萸堿有抗腫瘤、免疫、抗炎鎮(zhèn)痛、減肥等藥理作用[1]。本實(shí)驗(yàn)采用高脂飼料復(fù)制高脂血癥小鼠模型[3]，觀察HE染色切片小鼠肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)，檢測(cè)血清總抗氧化能力（T-AOC）、總超氧化物歧化酶（T-SOD）活性、丙二醛（MDA）的含量、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）活性，探討吳茱萸堿對(duì)高脂血癥小鼠的肝臟脂肪病變、抗氧化能力的影響。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物SPF級(jí)KM小鼠60只，體重18～22g，雌雄各半，購(gòu)于重慶騰鑫生物技術(shù)有限公司許可證號(hào)SCXK（渝）2015-0001。

1.2 試劑與儀器吳茱萸堿（純度98%，批號(hào)：zl2015 0813，南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司），辛伐他汀膠囊（批號(hào)：171002，規(guī)格：10mg，廈門(mén)福滿藥業(yè)有限公司），總抗氧化能力（T-AOC）測(cè)定試劑盒（批號(hào)：20180917，南京建成生物工程研究所），總超氧化物歧化酶（T-SOD）測(cè)試盒（批號(hào)：20180927，南京建成生物工程研究所），丙二醛（MDA）測(cè)試盒（批號(hào)：20180909，南京建成生物工程研究所），谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）測(cè)試盒（批號(hào)：20180926，南京建成生物工程研究所）。多功能酶標(biāo)儀（1510-01031C，美國(guó)賽默飛世爾科技公司），可見(jiàn)分光光度計(jì)（722N，上海佑科儀器儀表有限公司），電子分析天平（FA2004，德國(guó)賽多利斯公司），離心機(jī)（TD3WS，湖南邁達(dá)有限公司），切片機(jī)（KD-3368，浙江科迪有限公司），顯微鏡（BX53，日本奧林巴斯公司）。

1.3 方法

1.3.1 高脂血癥模型的建立 將60只小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為兩組：正常對(duì)照組10只和高脂飼料組50只，根據(jù)文獻(xiàn)制備高脂血癥模型小鼠[4]，正常對(duì)照組基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)，高脂飼料組高脂飼料喂養(yǎng)，喂養(yǎng)4周造模成功后，將高脂飼料組隨機(jī)分為5組：模型組、吳茱萸堿高、中、低劑量組和辛伐他汀組，給藥期間同時(shí)飼以高脂飼料，分別灌胃相應(yīng)藥物干預(yù)3周后處死小鼠，吳茱萸堿高、中、低劑量組分別給予吳茱萸堿 40mg/kg、20mg/kg、10mg/kg；辛伐他汀組給予辛伐他汀10mg/kg，每日灌胃給藥。

1.3.2 血液采集 給藥3周后，禁食24h，摘眼球取血后，處死小鼠。小心分離小鼠肝臟左葉，用生理鹽水清洗，分別置于4%多聚甲醛溶液中固定。使用離心機(jī)將血液3 000r/min分離，取上清液，保存于-20℃冰箱待檢。

1.3.3 肝臟病理切片 從肝左葉中部做橫切面取材切成1cm左右的小方塊，置于4%多聚甲醛溶液中固定，進(jìn)行常規(guī)脫水、透化、石蠟包埋、切片，HE染色。最后鏡檢組織結(jié)構(gòu)病變。

1.3.4 抗氧化指標(biāo)檢測(cè)

1.3.4.1 血清中T-AOC活性測(cè)定 采用比色法測(cè)定：取小鼠血清樣本，按試劑盒說(shuō)明書(shū)分別配置所需試劑，再按照實(shí)驗(yàn)操作表添加試劑及樣品，混勻、水浴、靜置后，最后用可見(jiàn)光光度計(jì)分別測(cè)其在520nm處的吸光值（OD），再根據(jù)說(shuō)明書(shū)上血清中T-AOC計(jì)算公式，將測(cè)出的OD值代入計(jì)算公式中算出所對(duì)應(yīng)樣品中總抗氧化能力。

1.3.4.2 血清中T-SOD活性測(cè)定 采用羥胺法測(cè)定：取小鼠血清樣本，按照T-SOD測(cè)試盒說(shuō)明書(shū)的操作步驟分別配置所需的試劑，確定最佳小鼠血清樣本取樣量，再按照實(shí)驗(yàn)操作表添加試劑及樣品，混勻、水浴、加顯色劑、靜置后，最后在酶標(biāo)儀分別測(cè)其在550nm處的吸光值（OD）之后代入公式計(jì)算。

1.3.4.3 血清中MDA含量測(cè)定 采用硫代巴比妥酸（TBA）法：分別配置所需的試劑，再按照說(shuō)明書(shū)實(shí)驗(yàn)操作表添加試劑及樣品，混勻、水浴、放冷、離心、取上清液后，最后在酶標(biāo)儀上分別測(cè)其在532nm處的吸光值（OD），再根據(jù)說(shuō)明書(shū)上血清中MDA含量計(jì)算公式，將測(cè)出的OD值代入計(jì)算公式中算出相對(duì)應(yīng)樣品中的MDA濃度。

1.3.4.4 血清中GSH-Px活性測(cè)定 采用比色法測(cè)定：取小鼠血清樣本，按照測(cè)試盒說(shuō)明書(shū)操作步驟分別配置所需的試劑，確定最佳小鼠血清樣本取樣量，根據(jù)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行反應(yīng)，最后在酶標(biāo)儀分別測(cè)其在412nm處的吸光度再根據(jù)說(shuō)明書(shū)上血清中GSHPx活力計(jì)算公式，將測(cè)出的吸光值代入計(jì)算公式中算出所對(duì)應(yīng)樣品中GSH-Px活力。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料采用±s表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肝臟HE染色觀察結(jié)果正常對(duì)照組小鼠肝細(xì)胞排列整齊、肝小葉正常，體積正常，形狀較為規(guī)則；模型組肝細(xì)胞腫大且有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)造模成功。吳茱萸堿高、中劑量和辛伐他汀組的肝小葉的正常結(jié)構(gòu)部分保留且肝細(xì)胞、少見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；吳茱萸堿低劑量組的肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)不清晰、多見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。見(jiàn)圖1。

2.2 吳茱萸對(duì)小鼠抗氧化能力的影響與正常對(duì)照組比較，模型組小鼠血清中MDA含量顯著升高（P＜0.05），血清中T-AOC、T-SOD、GSH-Px活性顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，辛伐他汀組小鼠血清中T-AOC、T-SOD、GSH-Px活性顯著升高（P＜0.05）、血清中MDA含量沒(méi)有顯著影響（P＞0.05）；吳茱萸堿低、中、高劑量組小鼠血清中T-SOD、GSH-Px、T-AOC活性顯著升高（P＜0.05），血清中MDA含量顯著降低（P＜0.05），見(jiàn)表1。

圖1 小鼠肝臟HE染色切片

表1 吳茱萸堿對(duì)小鼠血清中抗氧化指標(biāo)的影響（±s，n=10）

表1 吳茱萸堿對(duì)小鼠血清中抗氧化指標(biāo)的影響（±s，n=10）

注：與正常對(duì)照組相比，*P＜0.05；與模型組相比，#P＜0.05

組別 劑量（mg/kg）T-AOC（U/ml）T-SOD（U/ml）MDA（nmol/ml）GSH-Px（U/ml）正常對(duì)照組 - 22.51±2.16 217.58±8.04 6.48±1.50 269.18±5.50模型組 - 9.95±2.20* 166.20±9.05* 16.02±6.04* 171.15±9.23*辛伐他汀組 10 13.41±2.15# 176.59±4.71# 9.69±2.78 187.28±6.51#低劑量組 10 16.44±1.54# 200.45±4.76# 11.04±1.50# 204.39±11.82#中劑量組 20 16.03±2.19# 206.63±9.21# 7.57±1.57# 295.48±4.01#高劑量組 40 18.50±3.58# 209.60±7.58# 7.92±1.05# 306.49±6.27#

3 討論

心腦血管疾病對(duì)人體健康危害極大，常伴有動(dòng)脈粥樣硬化、腦梗死、糖尿病、脂肪肝等并發(fā)癥[5]，降低了人們的生活質(zhì)量。近代醫(yī)學(xué)研究證明吳茱萸的有效成分吳茱萸堿具有調(diào)節(jié)血壓、收縮或舒張血管、改善血管壁重構(gòu)、調(diào)節(jié)血脂、改善動(dòng)脈粥樣硬化和抗氧化的功效[6，7]。因此本研究通過(guò)吳茱萸堿干預(yù)觀察其對(duì)高脂模型小鼠抗氧化能力的影響。

肝臟脂質(zhì)過(guò)氧化是肝細(xì)胞損傷的重要原因[8]。研究表明，高血脂可導(dǎo)致體內(nèi)自由基的產(chǎn)生與清除之間的失平衡，增加體內(nèi)氧化應(yīng)激水平，對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生多種毒性作用[9]。本研究肝臟HE染色示：正常對(duì)照組小鼠肝細(xì)胞排列整齊、肝小葉正常，體積正常，形狀較為規(guī)則；模型組肝細(xì)胞腫大且有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)造模成功。吳茱萸堿高、中劑量和辛伐他汀組：肝小葉的正常結(jié)構(gòu)部分保留且肝細(xì)胞、少見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；吳茱萸堿低劑量組：肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)不清晰、多見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，說(shuō)明吳茱萸堿具有改善高脂血癥小鼠肝臟病變的作用。

氧化應(yīng)激可以對(duì)血管壁細(xì)胞造成損傷，如促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞增殖、脂質(zhì)沉積、內(nèi)膜增厚等[10]。在脂質(zhì)過(guò)氧化的過(guò)程中，產(chǎn)生了許多脂質(zhì)過(guò)氧化物，MDA是多不飽和脂肪酸與活性氧反應(yīng)的產(chǎn)物，其含量的高低反映了機(jī)體脂質(zhì)過(guò)氧化的程度；T-SOD是一種抗氧化酶，能有效清除體內(nèi)的超氧陰離子自由基，其活性大小反映了人體清除氧自由基的能力；GSH-Px是機(jī)體內(nèi)催化過(guò)氧化氫分解的一種酶，它特異性催化還原谷胱甘肽（GSH）還原過(guò)氧化氫反應(yīng)，增強(qiáng)這些抗氧化酶清除自由基的能力，從而減少氧化應(yīng)激反應(yīng)；T-AOC反映機(jī)體防御體系的抗氧化能力，機(jī)體防御體系的抗氧化能力與人體健康密切相關(guān)[11，12]。

氧化應(yīng)激狀態(tài)下活性氧（ROS）生成過(guò)多，可使內(nèi)皮細(xì)胞變性、壞死、脫落，誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，從而促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生[13]。此次實(shí)驗(yàn)，與正常對(duì)照組比，模型組小鼠血清中T-SOD、T-AOC、GSH-Px活性降低，MDA含量升高（P＜0.05），證實(shí)在高脂狀態(tài)下小鼠抗氧化能力減弱經(jīng)吳茱萸堿干預(yù)后，小鼠血清中T-AOC、T-SOD、GSH-Px活性升高，MDA含量降低（P＜0.05）。推測(cè)吳茱萸堿能使高脂血癥小鼠的T-AOC、T-SOD、GSH-Px活性升高，MDA含量降低，增強(qiáng)抗氧化能力。

吳茱萸堿能對(duì)抗高脂血癥引起小鼠血清中T-SOD、T-AOC、GSH-Px活性降低、MDA含量升高，經(jīng)吳茱萸堿干預(yù)后T-AOC、T-SOD、GSH-Px活性升高，MDA含量降低，加強(qiáng)抗氧化能力，因此推測(cè)吳茱萸堿有抗氧化改善作用，減少脂質(zhì)抗氧化程度，提高抗氧化能力，有助于防治動(dòng)脈粥樣硬化，減少心腦血管疾病的發(fā)生。