胡曉艷， 吳宇亮， 李科錚， 鐘宇萍， 徐頌周， 王存艷

1北京大學(xué)深圳醫(yī)院新生兒科(廣東深圳 518036)； 2深圳鼎新融合科技有限公司研發(fā)中心(廣東深圳 518101)

地中海貧血是全球發(fā)病率最高的常染色體單基因隱性遺傳病，輕型地中海貧血對健康無明顯影響，而重型地中海貧血則是嚴(yán)重危害人類健康的疾病。目前防治地中海貧血最行之有效的方法是加強高危人群的篩查，避免重型地中海貧血新生兒的出生，基因檢測是地中海貧血篩查中最準(zhǔn)確、最有效的手段[1]。目前臨床上檢測缺失型地中海貧血基因的方法主要是跨越斷裂點 PCR 法(gap-PCR)，該方法具有其快速簡便、經(jīng)濟準(zhǔn)確的特點[2]。檢測非缺失型α和β地中海貧血基因主要采用反向斑點雜交法[3-4]，該方法存在檢測步驟繁瑣、檢測時間長、檢測成本高等缺陷。文獻報道[5-7]用多重不對稱PCR探針熔解曲線法進行基因檢測，具有操作簡單、檢測快速、成本低、污染風(fēng)險小的優(yōu)勢，但未見有將該方法用于地中海貧血基因檢測的報道。2017年6月1日至2018年10月31日，本研究將開發(fā)一種用于地中海貧血基因檢測的多重不對稱PCR探針熔解曲線法，對每個待測的基因位點設(shè)計一條特異的熒光探針，根據(jù)該探針與特定等位基因結(jié)合后的熔解溫度不同來實現(xiàn)非缺失型地中海貧血基因位點的檢測。我國常見的非缺失型α和β地中海貧血基因位點主要包括以下9個[8-9]：αWSα、αQSα、αCSα、βIVSⅡ654、βCD-17、β-28、βCD41-42、βCD-71-72、βCD-26，我們的方法將針對這9個基因位點進行檢測。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑 臨床標(biāo)本由北京大學(xué)深圳醫(yī)院提供(30份已知基因型別的地貧血液標(biāo)本，200份臨床疑似地貧的標(biāo)本，乙二胺四乙酸抗凝，-20℃保存)，PCR引物、探針及靶序列由上海生工合成，全血基因組DAN提取試劑盒(Simgen)，Taq HS酶和UNG酶(Takara)，10×PCR Buffer(上海生工)，dNTP 和dUTP(Takara)，非缺失型α地中海貧血基因檢測試劑盒(益生堂)，β地中海貧血基因檢測試劑盒(益生堂)，熒光定量PCR儀(Bio-Rad CFX96)。

1.2 方法

1.2.1 引物、探針及靶序列 從NCBI的核酸數(shù)據(jù)庫上下載9個位點(αWSα、αQSα、βIVSⅡ654、βCD-17、β-28、βCD41-42、αCSα、βCD-71-72、βCD-26)基因序列，根據(jù)位點所在的上下游15～25 bp的序列設(shè)計的探針和靶序列，并用Primer3.0在線設(shè)計8個引物對，其中αWSα、αQSα因為相隔較近可以共用1對引物以及同一個熒光探針。每個熒光探針各占用1個熒光通道，共分兩組反應(yīng)管，見表1。其中TW為依據(jù)該位點的野生型序列設(shè)計的靶序列，TM為依據(jù)該位點的突變序列設(shè)計的靶序列，將TW與TM按照1∶1的濃度混合，則可得到該位點雜合型的靶序列。

1.2.2 探針與靶序列熔解曲線效果驗證 (1)反應(yīng)體系：2.5 μL的10×PCR Buffer，4 μL的熒光探針(對應(yīng)個型別的熒光探針終濃度各0.2 μmol/L)，4 μL的靶序列(對應(yīng)個型別的靶序列終濃度各0.2 μmol/L)，3 μL的25 mmol/L MgCl2，2 μL的dNTP，補ddH2O至25 μL。(2)反應(yīng)條件：步驟一，95℃ 30 s；步驟二，30℃ 30 s；步驟三，運行熔解曲線程序，0.3℃/s的升溫速率從30～90℃遞增進行熔解曲線分析，每隔 0.6℃采集FAM、HEX、Texas Red、Cy5熒光；步驟四，12℃ 2 min。使用Bio-Rad CFX96熒光定量PCR儀自帶的軟件機進行熔解曲線峰溫度判讀。

1.2.3 多重PCR與熔解曲線實驗流程 (1)反應(yīng)體系：2.5 μL的10×PCR Buffer，12 μL的引物探針MIX(反應(yīng)管a各探針終濃度：Pa1、Pa2為0.1 μmol/L，Pa3、Pa4為0.2 μmol/L；反應(yīng)管b各探針終濃度：Pb1、Pb2為0.1 μmol/L，Pb3、Pb4為0.2 μmol/L；a和b兩管各上游引物F終濃度為0.04 μmol/L，下游引物R終濃度為0.4 μmol/L)，0.25 μL的UNG酶，1 μL的HS Taq酶，3.75 μL的25 mmol/L MgCl2，2 μL的dNTP，補ddH2O至25 μL。(2)反應(yīng)條件：步驟一:25℃ 10 min；步驟二:95～94℃ 7 min；步驟三：95～94℃ 30 s，65℃ 20 s(每個循環(huán)降低1℃)，72℃ 15 s;(10個循環(huán))；步驟四：95～94℃ 15 s，58～60℃ 15 s，72℃ 15 s;(40 個循環(huán))；步驟五：95℃ 30 s；步驟六：30℃ 30 s；步驟七：0.3℃/s的升溫速率30～90℃遞增進行熔解曲線分析，每隔 0.6℃采集FAM、HEX、Texas Red、Cy5熒光；步驟八：12℃ 2 min。使用Bio-Rad CFX96熒光定量PCR儀自帶的軟件機進行熔解曲線峰溫度判讀。

1.2.4 地中海貧血基因檢測對照實驗 收集2018年1—9月在北京大學(xué)深圳醫(yī)院就診疑似地中海貧血病例的血液樣本200例，本研究疑似地中海貧血的標(biāo)準(zhǔn)定為符合下列任一項者：(1)有地中海貧血家族史者；(2)外周血紅細(xì)胞體積(MCV)<60 fL者。使用商用地中海貧血試劑盒(非缺失型α地中海貧血基因檢測試劑盒、β地中海貧血基因檢測試劑盒，均使用反向斑點雜交法)，以及本研究開發(fā)的PCR探針熔解曲線法及試劑對收集的200例血液樣本進行檢測。商用地中海貧血試劑盒具體操作步驟及判讀標(biāo)準(zhǔn)均按照試劑盒說明書進行。本研究經(jīng)北京大學(xué)深圳醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，所有入選病例均取得患者或監(jiān)護人同意并簽署之情同意書。

2 結(jié)果

2.1 靶序列熔解曲線峰值檢測 使用各位點的TW靶序列、TM靶序列、TW+TM混合靶序列，作為模板進行熔解曲線分析，得到實驗結(jié)果見圖1，實驗結(jié)果可以見到熔解峰均存在較大的差異，本研究設(shè)計的檢測探針可以很好地對αWSα、αQSα、βIVSⅡ654、βCD-17、β-28、βCD41-42、αCSα、βCD-71-72、βCD-26等9個位點進行檢測。

表1 地中海貧血基因位點探針、引物序列與反應(yīng)管編號

2.2 已知型別的臨床樣本的熔解曲線峰值檢測 使用多重不對稱PCR探針熔解曲線法對30份已知型的地貧血液標(biāo)本進行分析，檢測到的各種基因型別按照FAM、HEX、Texas Red和Cy5檢測通道的熔解曲線結(jié)果見圖2。根據(jù)軟件判讀的熔解曲線的Tm值不同可以分辨不同的亞型，9個位點對應(yīng)的Tm值及基因型見表2。其中，βIVSⅡ654，受旁邊SNP的影響，雜合子和野生型峰型個有2種，對應(yīng)的Tm值也有兩種。

圖1 地中海貧血的基因位點靶序列的熔解曲線

圖2 地中海貧血的基因位點臨床樣本的熔解曲線

2.3 兩種方法檢測地中海貧血基因位點結(jié)果比較 200例臨床樣本中，共檢出69例目標(biāo)突變基因，檢出率34.5%，發(fā)生率最高的前兩位突變類型是CD41-42和IVS-Ⅱ-654，探針熔解曲線法的檢測結(jié)果與傳統(tǒng)的反向斑點雜交法完全符合，見表3。

表2 地中海貧血的基因位點的熔解曲線Tm值

2.4 兩種方法檢測地中海貧血優(yōu)缺點比較 經(jīng)過臨床樣本的檢測與方法學(xué)的比較，本項目開發(fā)的探針熔解曲線法相比與反向斑點雜交法將原有的DNA提取、PCR擴增、雜交、洗膜、顯色等步驟縮減為DNA提取、PCR擴增與熔解曲線分析兩步，大大縮短了檢測的時間，降低了樣本污染的風(fēng)險以及檢測成本，見表4。

表3 兩種方法檢測200例臨床樣本結(jié)果比較 例(%)

表4 探針熔解曲線法、反向斑點雜交法的方法學(xué)對比

3 討論

地中海貧血是由于組成血紅蛋白的珠蛋白基因缺陷，使珠蛋白肽鏈1種或幾種合成減少或不能合成，而導(dǎo)致的一種溶血性貧血，根據(jù)缺陷的珠蛋白肽鏈種類主要分為α-地中海貧血和β-地中海貧血。我國長江以南地區(qū)是地中海貧血高發(fā)區(qū)，尤其是廣東、廣西、海南發(fā)病率最高，其中海南黎族人群地中海貧血基因攜帶率高達65%[10]。重型地中海貧血是嚴(yán)重危害人類健康的疾病，重型α-地中海貧血多在胎兒期或出生后數(shù)小時死亡，重型β-地中海貧血需終身輸血治療，造成了嚴(yán)重的家庭、社會經(jīng)濟負(fù)擔(dān)[11-12]。加強高危人群的篩查，避免重型地中海貧血新生兒的出生是地中海貧血防治的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，因此建立一種快速、操作簡便、準(zhǔn)確率高的地中海貧血基因檢測方法，是地中海貧血防治的重點。

目前用探針熔解曲線法檢測非缺失型α和β地中海貧血基因突變的很少，已報道的有分子信標(biāo)探針法[13-14]，用分子信標(biāo)探針檢測SNP分型的原理是設(shè)計一條與靶序列產(chǎn)物匹配的探針，人工添加兩端或其中一端的堿基，使探針在低溫下兩端形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，3′端的淬滅劑淬滅5′端的熒光報告分子，隨著溫度的升高，莖結(jié)構(gòu)被破壞，熒光報告分子與淬滅劑相互分離，熒光報告分子得以發(fā)射熒光。在探針與靶序列熔解的過程中，不同匹配度的靶序列的Tm值不同，從而可以達到SNP單堿基分辨的目的。但是分子信標(biāo)探針設(shè)計難，其莖環(huán)結(jié)構(gòu)容易使錯配的靶序列結(jié)合效率低甚至結(jié)合不上，需要進行大量設(shè)計合成探針和實驗驗證才能選出合適的探針，且理論的Tm值與實際的Tm值區(qū)別大，不容易僅在設(shè)計層次就預(yù)測出合適的探針。

本研究設(shè)計的探針與分子信標(biāo)探針不同，不在任何位置添加堿基，從而避免了增加錯配，提高了當(dāng)?shù)任换蚺c探針不匹配時的結(jié)合效率。且我們這種方法的探針與靶序列的預(yù)測的理論Tm值與實際實驗的Tm值基本一致，也就是可以在設(shè)計層次上就得出最合適的探針，不用通過大量的實驗去驗證篩選出合適的探針。

通過對方法學(xué)的改良，本研究成功建立了一種檢測9個常見的非缺失型α和β地中海貧血的基因位點(αWSα、αQSα、βIVSⅡ654、βCD-17、β-28、βCD41-42、αCSα、βCD-71-72、βCD-26)的實驗方法，且只需要使用2個PCR孔即可對9種常見突變型進行檢測，只需要DNA提取、PCR擴增與熔解曲線分析兩步，無需反向斑點雜交法的雜交、洗膜、顯色等步驟，大大簡化了操作步驟，節(jié)省了實驗時間，降低了氣溶膠污染風(fēng)險。本研究也使用了反向斑點雜交法對200例臨床樣本進行了平行試驗對比，兩種方法的匹配度完全一致，檢出率均為檢出率34.5%，對不同地貧類型的判斷完全一致。

本研究成功建立了一種可同時檢測9個常見的非缺失型α和β地中海貧血的基因位點的實驗方法，該方法可在目前臨床常見的熒光定量PCR儀上進行閉管操作，只需要DNA提取、PCR擴增與熔解曲線分析兩步，檢測結(jié)果與反向斑點雜交法一致，具有準(zhǔn)確、方便、快速、無污染等優(yōu)點，可用于臨床非缺失型α和β地中海貧血檢測，該方法也可推廣到對其他單基因遺傳病的檢測中，有著廣闊的應(yīng)用前景。