林曉堅(jiān)， 袁兆偉， 潘彩燕， 孫黔云， 宛蕾**

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 藥理學(xué)教研室， 貴州 貴陽 550025； 2.貴州省中國科學(xué)院 天然產(chǎn)物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 貴州 貴陽 550014)

血栓性疾病是由血栓形成和血栓栓塞兩種病理過程引起的一類疾病，前者是指血液中的有形成分在血管中形成栓子，造成血管部分或完全堵塞；后者則是指血栓自形成部位脫落，隨血液循環(huán)部分或全部堵塞某些血管[1]。血栓性疾病有高死亡率和高致殘率的特點(diǎn)，其中血小板活化異常是血栓形成的重要病理學(xué)基礎(chǔ)[2-3]。抗血小板治療已成為預(yù)防動脈粥樣硬化性疾病，尤其是冠心病的重要治療手段[4]，因此具有抗血小板活性的藥物對于防治血栓有著重要作用。紅景天是大花紅景天(rhodiolaroseaL.)的干燥根莖和根，是藏醫(yī)常用藥材，紅景天苷(salidroside，Sal)則是紅景天的主要有效成分[5]。研究表明，Sal有廣泛的藥理作用，如抗氧化、抗動脈粥樣硬化、心肌保護(hù)、神經(jīng)保護(hù)、腦保護(hù)、抑制血小板聚集等[6-11]，但目前對其抗血小板活性和抗血栓作用研究少有報(bào)道。因此，本研究采用小鼠斷尾出血時(shí)間和角叉菜膠誘導(dǎo)的體內(nèi)血栓模型，觀察Sal抗血小板活性和抗血栓作用，為臨床抗血栓和抗血小板藥物的研發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物、藥物、試劑及儀器

1.1.1實(shí)驗(yàn)動物 清潔級昆明小鼠160只，體質(zhì)量18～22 g，雌鼠60只，雄鼠100只，由貴州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，合格證號為SCXK(黔)2018-0001。實(shí)驗(yàn)前均適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d。

1.1.2藥物及試劑 Sal購自上海瓦蘭生物科技有限公司(批號HJT20180812，純度≥98%)，角叉菜膠購自Sigma公司(22048-25G Type κ，批號BCBG5890V)，水合氯醛購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司(批號20170803)，二水合檸檬酸三鈉購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司(批號20170718)，阿司匹林腸溶片購自大同市利群藥業(yè)有限責(zé)任公司(批號170605)。

1.1.3儀器 BC-5130型全自動血液細(xì)胞分析儀購自深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司，5810R型高速冷凍離心機(jī)購自德國Eppendorf公司，移液器購自德國Eppendorf公司，XS205型萬分之一電子天平購自瑞士梅特勒-托利多科學(xué)儀器公司產(chǎn)品，RP6002K型電子天平購自常州銳品精密儀器有限公司，RAC-1830全自動凝血分析儀購自美國Rayto公司。

1.2 方法

1.2.1體質(zhì)量及血細(xì)胞數(shù)目的測定 取40只昆明小鼠，雌雄各半，隨機(jī)分為對照組(生理鹽水)、陽性藥組(阿司匹林100 mg/kg)、Sal高劑量組(Sal 100 mg/kg)和Sal低劑量組(Sal 50 mg/kg)。每日稱重小鼠，記錄體質(zhì)量，按照體質(zhì)量腹腔注射給藥1次/d，給藥體積為10 mL/kg，連續(xù)7 d；末次給藥30 min后，將小鼠麻醉(4%水合氯醛，400 mg/kg)、固定、采血(3.8%枸櫞酸鈉抗凝，抗凝劑與血液體積之比為1 ∶9)，檢測白細(xì)胞(white blood cell，WBC)、紅細(xì)胞(red blood cell，RBC)、血小板計(jì)數(shù)(platelet，PLT)和平均血小板體積(mean plate volume，MPV)。

1.2.2凝血4項(xiàng)的測定 取昆明小鼠40只，雌雄各半，分組給藥同1.2.1。末次給藥30 min后，將小鼠麻醉、固定、采血，檢測凝血酶原時(shí)間(prothrombin time ，PT)、活化部分凝血酶時(shí)間(activated partial thromboplastin time， APTT)、凝血酶時(shí)間(thromboplastin time，TT)和纖維蛋白原(fibrinogen，F(xiàn)IB)。

1.2.3小鼠斷尾出血時(shí)間測定 取昆明小鼠40只，雌雄各半，分組給藥同1.2.1。參照文獻(xiàn)[12]末次給藥30 min后，小鼠麻醉(4%水合氯醛，400 mg/kg)，在距離尾尖4 mm 處剪斷，濾紙擦去第一滴血，隨后將鼠尾放入37 ℃生理鹽水中，待小鼠尾部停止流血后，繼續(xù)觀察60 s，如停止出血?jiǎng)t以該時(shí)間為小鼠尾巴出血時(shí)間，若尾部再次出血?jiǎng)t繼續(xù)計(jì)時(shí)，到15 min出血未停止，則記為15 min。

1.2.4小鼠尾部血栓測定 取雄性昆明小鼠40只，隨機(jī)分為4組，分組給藥同1.2.1。腹腔注射給藥1次/d，至第5天給藥30 min后，各組腹腔注射角叉菜膠(20 mg/kg，10 mL/kg)[13]第6天、第7天按分組持續(xù)給藥；分別測量并記錄給予角叉菜膠12 h、24 h、48 h后的黑尾率以及黑尾長度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 體質(zhì)量

各組小鼠實(shí)驗(yàn)開始時(shí)體質(zhì)量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；實(shí)驗(yàn)開始后各組小鼠每日體質(zhì)量均有增長，腹腔給藥第7天相較于給藥第1天，各組小鼠體質(zhì)量均有明顯增加，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0. 01)，但同日各組小鼠體質(zhì)量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

2.2 血細(xì)胞、PLT和MPV

實(shí)驗(yàn)表明，各組小鼠WBC、RBC、PLT和MPV比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

時(shí)間小鼠體質(zhì)量對照組(n=10)陽性藥組(n=10)Sal低劑量組(n=10)Sal高劑量組(n=10)第1天21.14±0.9221.74±0.8421.89±0.7921.46±0.70第2天22.35±0.7222.57±1.1722.26±1.4321.99±1.67第3天23.30±1.0523.24±1.1723.40±1.2023.55±1.15第4天24.56±0.8324.11±1.4124.78±1.3924.73±1.22第5天25.17±1.4025.76±1.3925.21±1.2025.59±1.39第6天26.18±1.3526.29±1.1126.37±1.2426.61±1.30第7天26.83±1.41(1)27.04±1.48(1)27.43±1.35(1)27.34±1.37(1)

注：(1)與同組第1天比較，P<0.01。

指標(biāo)對照組(n=10)陽性藥組(n=10)Sal低劑量組(n=10)Sal高劑量組(n=10)FPWBC(×109/L)3.47±0.993.61±1.043.33±0.903.05±0.950.4920.994RBC(×1012/L)8.72±0.688.37±0.588.46±0.578.65±0.720.5720.877PLT(×109/L)559.60±91.60 566.10±107.30572.60±109.10543.10±146.800.1070.577MPV(fL)5.54±0.355.83±0.395.63±0.405.66±0.460.8230.490

2.3 凝血4項(xiàng)指標(biāo)

與對照組小鼠相比，Sal高、低劑量組小鼠PT、APTT、TT及FIB差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

2.4 小鼠斷尾出血時(shí)間

陽性藥組、Sal低劑量組和Sal高劑量組小鼠斷尾平均出血時(shí)間分別較對照組為長，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)，但其余各組之間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表4。

2.5 小鼠黑尾率及黑尾長度

造模12 h時(shí)，對照組小鼠黑尾率明顯高于Sal高劑量組小鼠，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，

指標(biāo)對照組(n=10)陽性藥組(n=10)Sal低劑量組(n=10)Sal高劑量組(n=10)PT(s)12.22±0.5512.44±0.8912.37±0.6512.26±0.61APTT(s)22.60±1.3626.60±2.83(1)22.80±1.3322.79±1.28TT(s)18.99±1.0418.90±1.1019.10±1.0518.91±1.07FIB(g/L)1.76±0.141.73±0.161.77±0.171.82±0.17

注：(1)與對照組比較，P<0.01。

表4 各組小鼠斷尾出血時(shí)間比較Tab.4 Effect of Sal on mice tail bleeding time

注：與對照組比較，(1)P<0.05，(2)P<0.01。

但陽性藥組小鼠和Sal低劑量組小鼠間黑尾率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；造模24 h時(shí)，對照組小鼠黑尾率高于陽性藥組和Sal高劑量組小鼠，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；造模48 h時(shí)，各組小鼠間黑尾率差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。在造模12 h、24 h和48 h時(shí)，與對照組小鼠相比，陽性藥組、Sal低劑量組和Sal高劑量組小鼠黑尾長度均有縮短，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)，提示Sal有改善小鼠血栓形成的作用。見表5、圖1。

表5 各組小鼠黑尾率及黑尾長度Tab.5 Effect of Sal on black tail rate and black tail length of mice

注：與對照組同時(shí)間比較，(1)P<0.05，(2)P<0.01。

對照組 陽性藥組 Sal低劑量組 Sal高劑量組圖1 各組小鼠在角叉菜膠誘導(dǎo)48 h時(shí)黑尾長度Fig.1 Tail thrombosis length of different groups at 48 h after carrageenan induction

3 討論

近年來，我國心血管疾病發(fā)病率持續(xù)升高，心血管疾病造成的死亡人數(shù)已居各類疾病死亡率的首位[14]。血栓性疾病在心血管疾病中比例很高，其中血小板功能異常導(dǎo)致的血栓形成和栓塞并發(fā)癥是心血管疾病發(fā)病的主要原因[15]?？寡ㄋ幬锸欠乐窝ㄐ约膊〉闹匾侄危渲兄兴幖捌渲苿τ诳寡“搴涂寡ㄓ兄?dú)到的療效，且副作用小[16]。本研究結(jié)果顯示，Sal對小鼠的體質(zhì)量增長并無明顯影響，對小鼠血細(xì)胞計(jì)數(shù)以及平均血小板體積均未產(chǎn)生明顯影響。平均血小板體積可反應(yīng)血小板體積以及體積的差異程度，該指標(biāo)亦可體現(xiàn)血小板的產(chǎn)率及激活，相對于血小板計(jì)數(shù)，平均血小板體積更能反映血小板功能[17]。小鼠斷尾出血是測定血小板功能的整體模型，包括血小板功能、血小板計(jì)數(shù)以及凝血系統(tǒng)在內(nèi)的因素均可影響機(jī)體的止血功能[18]。同時(shí)，Sal對小鼠的凝血4項(xiàng)并無明顯影響，則排除了小鼠凝血系統(tǒng)的影響。據(jù)此，本研究推測Sal可以延長小鼠出血時(shí)間，原因可能是通過抗血小板活性實(shí)現(xiàn)的。

角叉菜膠又名卡拉膠，是從紅藻中提取的多糖物質(zhì)的統(tǒng)稱，屬于較強(qiáng)的致炎物質(zhì)，可用于復(fù)制炎癥模型[19]。已有研究顯示，皮下注射以及腹腔注射一定劑量的角叉菜膠可誘導(dǎo)小鼠尾部形成血栓[20]。此法復(fù)制的模型，血栓直觀、肉眼可見，易于測量和觀察，可用于抗血栓藥物的評估[21-22]。參考文獻(xiàn)多采用雄性小鼠進(jìn)行造模，預(yù)實(shí)驗(yàn)觀察到雌性小鼠經(jīng)相同給藥途徑注射相同劑量的角叉菜膠后，其尾部血栓發(fā)生率以及血栓長度均低于雄性小鼠，故本研究亦采取了雄性小鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。研究結(jié)果表明，Sal低、高劑量對延緩小鼠尾部血栓形成，減少尾部血栓長度均有作用，提示Sal對血栓形成具有明顯的抑制作用。

綜上所述，Sal對血栓形成具有明顯的抑制作用，可能與其抗血小板功能活性有關(guān)，從而為Sal用于血栓性疾病的防治提供了理論基礎(chǔ)。