劉務(wù)玲， 姚堯， 陳娟， 吳昌學(xué)， 宋晶睿， 王春林， 邱劍飛， 王立平， 朱偉明,3， 龍群**， 李艷梅**

(1.貴州省中國科學(xué)院 天然產(chǎn)物化學(xué)重點實驗室， 貴州 貴陽 550014； 2.貴州醫(yī)科大學(xué)， 貴州 貴陽 550025； 3.中國海洋大學(xué)， 山東 青島 266100)

白血病(leukemia)是危害人類健康的惡性血液疾病[1]，美國癌癥協(xié)會預(yù)測2019年美國將有22 846人死于白血病，并且白血病仍會是第六大癌癥[2]。目前，白血病的主要治療方法是化療和放療[1]，但白血病細(xì)胞對化療藥物的耐藥性是臨床治療的主要障礙[3]。因此，探索新的白血病化療藥物具有重要的醫(yī)學(xué)意義。已有研究顯示，誘導(dǎo)細(xì)胞分化可作為一種有效抑制多種癌癥細(xì)胞的新思路[4-5]，且細(xì)胞周期檢查點抑制劑對白血病、實體腫瘤有一定的治療效果[6]，這使通過細(xì)胞分化和細(xì)胞周期阻滯途徑抑制癌細(xì)胞增殖的化合物有著重要的應(yīng)用前景。1982年，Martin等[7]科學(xué)家首次報道從白血病病人外周血中分離并建立了HEL(human erythroleukemia)細(xì)胞系，自此HEL細(xì)胞系作為人白血病細(xì)胞模型廣泛用于科學(xué)研究[8-11]。雙吲哚馬來酰亞胺及其衍生物主要用于抑制蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)[12-13]，但雙吲哚馬來酰亞胺衍生物GZWM-051(簡稱化合物GZWM-051)對白血病細(xì)胞的周期及分化的影響未見報道。因此，本研究就化合物GZWM-051對HEL細(xì)胞系的周期及分化的影響進(jìn)行探討，報告如下。

1 材料與方法

1.1 主要材料和儀器

1.1.1細(xì)胞、藥物和試劑 人紅白血病HEL細(xì)胞系為貴州省中國科學(xué)院天然產(chǎn)物化學(xué)重點實驗室保存?；衔颎ZWM-051由中國海洋大學(xué)朱偉明教授課題組設(shè)計合成，相對分子量為638，純度95%以上。細(xì)胞分化抗體CD61、CD41a、CD235a、CD71購自美國Thermo Fisher公司，PBS緩沖液、二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)、細(xì)胞周期碘化丙啶(propidium iodide, PI)染料及RNAase及試劑購自北京索萊寶科技有限公司，蛋白裂解液(radio-immunoprecipitation assay，RIPA)、BCA蛋白濃度測定試劑盒和SDS-PAGE凝膠快速配置試劑盒購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司，PVDF膜購于美國Bio-Rad公司，蛋白內(nèi)參(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)、c-Myc、Cyclin B1、STAT3(signal transducer and activator of transcription 3)、P-STAT3(phosphorylated signal transducer and activator of transcription 3)抗體購自美國Abcam公司，熒光標(biāo)記抗兔二抗購自美國CST公司。

1.1.2主要儀器 Microfuge 20R冷凍離心機(jī)購自美國Beckman公司，SDS-PAGE電泳轉(zhuǎn)膜儀購自美國Bio-Rad公司產(chǎn)品，Synergy2酶標(biāo)儀購自美國Bio-Tek公司，NovoCyte 2040R流式細(xì)胞儀購自杭州安捷倫生物有限公司，Odyssey CLX雙色紅外激光成像系統(tǒng)購自美國LI-COR公司。

1.2 實驗方法

1.2.1細(xì)胞周期測定 取2×106個對數(shù)生長期細(xì)胞，鋪于6孔板中，分別加入0.025、0.050、0.100 μmol/L化合物GZWM-051作為低劑量、中劑量和高劑量組，以DMSO為對照組；作用24 h后，用離心管收集細(xì)胞，1 500 r/min離心5 min，棄上清液；用PBS輕輕沖洗細(xì)胞，洗3次；接著1 500 r/min離心5 min，棄上清液；加入75%乙醇1 mL固定細(xì)胞，置-20 ℃固定處理過夜；取出樣品1 500 r/min離心5 min去除乙醇上清液，用PBS洗滌細(xì)胞后去除上清液；加入500 μL的 PBS重懸細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中，加入RNAase酶、PI染液使其終濃度分別為100 mg/L和50 mg/L；輕輕混勻，置37 ℃避光處理1 h；用1 mL的PBS洗滌細(xì)胞1次，并1 500 r/min離心5 min，棄上清液；用適量PBS重懸細(xì)胞沉淀，后用流式細(xì)胞儀檢測并分析HEL細(xì)胞周期分布。

1.2.2細(xì)胞分化分析 收集生長狀態(tài)良好的細(xì)胞，放入離心機(jī)1 500 r/min離心5 min，棄去上清液；用培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)后，鋪6孔板，每孔2×106個；加入1.2.1項下化合物GZWM-051低、中、高劑量作用48 h，用離心管收集細(xì)胞，1 500 r/min離心5 min，棄去上清液；用PBS重懸細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)后，調(diào)整細(xì)胞密度至1×1010個/L；取100 μL轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管，加入分化抗體進(jìn)行染色：對于巨核分化檢測，加入CD61-APC抗體及CD41a-FITC抗體各2 μL至細(xì)胞懸液；對于紅系分化檢測，則加入CD235a-APC抗體及CD71-FITC抗體各2 μL至細(xì)胞懸液；加入分化抗體后混勻，置冰上染色1 h，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測并分析HEL細(xì)胞CD61、CD41a、CD235a及CD71的百分比分布。

1.2.3Western blot測定 取2×106個對數(shù)生長期穩(wěn)定生長細(xì)胞，鋪于6孔板中，加入1.2.1項下化合物GZWM-051低、中、高劑量，同時以DMSO為對照組；處理48 h，收集細(xì)胞，加入適量蛋白裂解液置于冰上作用30 min，12 000 r/min低溫離心15 min，取上清液，棄去沉淀。用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白樣品濃度，加入5×蛋白上樣緩沖液，100 ℃蛋白變性5 min，置于超低溫冰箱備用；進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳分離(100 V恒壓，2 h)，將PVDF膜置于甲醇中激活1 min，放入1×轉(zhuǎn)膜緩沖液浸潤后轉(zhuǎn)膜(220 mA恒流，2 h)；用5%脫脂牛奶進(jìn)行封閉1 h，一抗孵育過夜；完成一抗孵育后洗膜3次，二抗孵育1 h后洗膜3次，用雙色紅外熒光成像系統(tǒng)檢測和分析HEL細(xì)胞的蛋白表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞周期

流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，處理24 h后，與對照組HEL細(xì)胞相比，化合物GZWM-051中、高劑量組 HEL細(xì)胞處于G1和S期細(xì)胞數(shù)量顯著減少，處于G2期的數(shù)量顯著增加，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見圖1、圖2。

圖1 化合物GZWM-051促使HEL細(xì)胞G2期阻滯Fig.1 G2 phase arrest induced by compound GZWM-051

注：(1)與DMSO組比較，P<0.01。圖2 化合物GZWM-051處理24 h后HEL細(xì)胞周期分布Fig.2 The effect of GZWM-051 on different phrases of cell cycle

2.2 細(xì)胞分化

流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，相比對照組，作用48 h化合物GZWM-051低、中、高劑量組HEL細(xì)胞的CD41a和CD71均上調(diào)。見圖3。

2.3 Cyclin B1、c-Myc、STAT3及P-STAT3蛋白表達(dá)水平

Western blot檢測結(jié)果顯示，與對照組HEL細(xì)胞對比，中劑量化合物GZWM-051及高劑量化合物GZWM-051組HEL細(xì)胞生長相關(guān)蛋白c-Myc表達(dá)水平降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。與對照組HEL細(xì)胞對比，低化合物GZWM-051、中化合物GZWM-051及高劑量的化合物GZWM-051組HEL細(xì)胞的P-STAT3表達(dá)水平降低(P<0.05或P<0.01)，中、高劑量化合物GZWM-051組HEL細(xì)胞周期蛋白Cyclin B1表達(dá)水平降低(P<0.05)。見圖4。

圖3 化合物GZWM-051誘導(dǎo)HEL細(xì)胞分化Fig.3 The effect of compound GZWM-051on HEL cell differentiation

注：A為Western blot檢測結(jié)果，B為蛋白相對表達(dá)水平直條圖；與DMSO組比較，(1)P<0.05，(2)P<0.01。圖4 化合物GZWM-051對HEL細(xì)胞Cyclin B1、c-Myc、STAT3及P-STAT3蛋白表達(dá)水平的影響Fig.4 Effect of compound GZWM-051 on the expression levels of Cyclin B1、c-Myc、STAT3 and P-STAT3

3 討論

為了探索不同濃度化合物GZWM-051對HEL細(xì)胞的作用效果，本研究檢測低劑量(0.025 μmol/L)、中劑量(0.050 μmol/L)、高劑量(0.100 μmol/L)3種濃度對HEL細(xì)胞的周期、分化及相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響。結(jié)果顯示，化合物GZWM-051低、中、高劑量組HEL細(xì)胞的CD41a陽性率均高于對照組，這表明化合物GZWM-051誘導(dǎo)HEL細(xì)胞向巨核分化。中、高劑量化合物GZWM-051處理組CD71陽性率高于對照組，表明化合物GZWM-051誘導(dǎo)HEL細(xì)胞向紅系分化。正常血細(xì)胞在骨髓中增殖、分化并成熟，然后進(jìn)入血液發(fā)揮作用，所以大部分血細(xì)胞處于高度分化的狀態(tài)，其蛋白合成及細(xì)胞分裂能力較低，壽命大多很短，如中性粒細(xì)胞只有幾小時，血小板只有幾天，紅細(xì)胞只有幾周[14]。然而，大部分癌癥細(xì)胞尤其是白血病細(xì)胞，在細(xì)胞成熟的不同階段分化被阻斷而保持未分化狀態(tài)[15]。因此，誘導(dǎo)癌細(xì)胞分化可改變癌細(xì)胞的干細(xì)胞特征，抑制其惡性增殖。分化療法是用小劑量的化合物誘導(dǎo)癌細(xì)胞分化，將惡性癌癥細(xì)胞及無用的細(xì)胞重新分化成為功能細(xì)胞，這被認(rèn)為是誘導(dǎo)癌細(xì)胞死亡和增殖抑制的一種新思路[14,16-17]。相比其他癌癥治療方法，分化療法可以降低細(xì)胞化療帶來的毒副作用，更重要的是可以提高完全緩解和治愈率，且不易產(chǎn)生耐藥性[15,18]?；衔颎ZWM-051處理組HEL細(xì)胞的紅細(xì)胞標(biāo)志物CD41a及巨核細(xì)胞標(biāo)志物CD71增多，意味著化合物GZWM-051促使HEL細(xì)胞發(fā)生紅系及巨核分化，從而抑制其惡性增殖。因此，該化合物有重要的潛在臨床應(yīng)用價值。許多抗癌藥物都能在特定的檢查點阻滯細(xì)胞周期，從而導(dǎo)致分裂停止[19]。抑制細(xì)胞周期已成為抑制癌癥進(jìn)展中最常見的方法之一，已報道的一些化合物可以通過誘導(dǎo)G2周期阻滯進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖[20-22]。本研究檢測結(jié)果顯示，處理24 h后，與對照組HEL細(xì)胞相比，化合物GZWM-051中、高劑量組HEL細(xì)胞處于G1和S期細(xì)胞數(shù)量顯著減少，處于G2期的數(shù)量顯著增加(P<0.01)，這表明化合物GZWM-051誘導(dǎo)HEL細(xì)胞阻滯于G2期，從而抑制細(xì)胞分裂與增殖。STAT3是STAT蛋白家族中的一員[23]。在細(xì)胞因子和生長因子的作用下，STAT3被受體相關(guān)的Janus激酶(janus kinase, JAK)磷酸化，并轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中，在細(xì)胞核中發(fā)揮轉(zhuǎn)錄激活劑的作用[23]。STAT3介導(dǎo)多種基因在細(xì)胞刺激反應(yīng)中的表達(dá)，在細(xì)胞生長、凋亡等細(xì)胞過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[24-26]。有報道指出，一些影響癌癥進(jìn)展的microRNA，如miR-337-3、miR-17-5p及miR-20a等，通過調(diào)控JAK/STAT3信號通路發(fā)揮作用[27-28]。JAK/STAT3信號通路還在促進(jìn)腫瘤干細(xì)胞自我更新和分化過程中扮演重要角色[29-30]。不僅如此，STAT3還可通過調(diào)控線粒體功能及表觀遺傳影響癌癥進(jìn)展[24]。因此，可以認(rèn)為STAT3是癌癥治療的重要靶點。本研究中化合物GZWM-051下調(diào)P-STAT3蛋白表達(dá)水平(P<0.05)，推測其抑制STAT3所在信號通路，從而抑制細(xì)胞生長。此外，Cyclin B1對細(xì)胞發(fā)育至關(guān)重要，細(xì)胞有絲分裂必須從細(xì)胞核中釋放Cyclin B1，以防止細(xì)胞過早進(jìn)入有絲分裂[31]。本研究顯示化合物GZWM-051可顯著下調(diào)Cyclin B1表達(dá)水平(P<0.05)，從而抑制細(xì)胞的分裂。c-Myc通常在癌癥組織中表達(dá)，并引起許多參與細(xì)胞增殖及有助于癌癥形成的基因表達(dá)增加[32-33]?；衔颎ZWM-051顯著下調(diào)c-Myc的表達(dá)水平(P<0.05或P<0.01)，從而進(jìn)一步抑制細(xì)胞分裂。

綜上所述，化合物GZWM-051不僅能誘導(dǎo)白血病HEL細(xì)胞發(fā)生G2周期阻滯，促進(jìn)其向巨核及紅系進(jìn)行分化，抑制細(xì)胞惡性增殖，還能失活STAT3關(guān)鍵通路。因此，化合物GZWM-051是良好的治療癌癥的潛在化合物。