張大革 黃漫青 高秀芝 張紅星 徐文生 *

（1農(nóng)產(chǎn)品有害微生物及農(nóng)殘安全檢測(cè)與控制北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 北京 102206

2北京農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院 北京 102206）

中式發(fā)酵香腸又稱臘腸，在我國具有悠久的制作歷史，其制法約始創(chuàng)于南北朝，始見載于《齊民要術(shù)》。中式發(fā)酵香腸由于具有易于加工、口感鮮美、香味濃郁、存貯期長等特點(diǎn)而深受國人喜愛，是我國傳統(tǒng)發(fā)酵肉制品的典型代表。我國不同地域飲食文化的差異，造就不同地域生產(chǎn)的香腸各有特色，然而制作方法大同小異，主要是在臘月以肉類為原料切成丁，配以糖、香辛料等輔料，灌入動(dòng)物腸衣，經(jīng)自然發(fā)酵、成熟干制而成的具有中國特色的肉制品。目前中式發(fā)酵香腸生產(chǎn)主要以傳統(tǒng)自然發(fā)酵為主，存在生產(chǎn)受季節(jié)限制、產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定等問題，嚴(yán)重制約了中式發(fā)酵香腸的發(fā)展。要拓展中式發(fā)酵香腸的發(fā)展空間，需要對(duì)傳統(tǒng)的生產(chǎn)工藝進(jìn)行現(xiàn)代化改良。

自Morris于1970年代開始研究發(fā)酵香腸微生物群落以來，科學(xué)家一直致力于揭示發(fā)酵香腸制備過程中微生物群落的發(fā)展規(guī)律。研究表明：乳酸菌對(duì)發(fā)酵香腸發(fā)酵、后熟和風(fēng)味形成等起著主導(dǎo)作用[1]；而且發(fā)酵香腸中微生物群落的發(fā)展也與香腸的加工工藝密切相關(guān)，如在加工工藝時(shí)間較短的香腸中常分離出乳桿菌；而在后熟時(shí)間長的發(fā)酵香腸中常分離出微球菌[2]等。植物乳桿菌、清酒乳桿菌等是常見于自然發(fā)酵的香腸中的乳酸菌[3]，也常作為香腸發(fā)酵劑應(yīng)用于發(fā)酵香腸的生產(chǎn)[4]。這些微生物對(duì)發(fā)酵香腸中乙酸、乙醇、丙酮酸等及其支鏈氨基酸降解產(chǎn)物如3-甲基丁醇、2-和3-甲基丁醇、3-甲基丁酸等發(fā)酵香腸典型風(fēng)味成分的形成具有重要意義[2，5]。

植物乳桿菌是食品、醫(yī)藥工業(yè)重要的微生物[6-7]，也是中式自然發(fā)酵香腸中最常見的微生物之一，對(duì)中式發(fā)酵香腸發(fā)酵和風(fēng)味物質(zhì)形成具有重要作用。發(fā)酵香腸中的乳酸菌也是引起發(fā)酵香腸的口感偏酸的主要原因，在制作時(shí)往往需要添加蔗糖等甜味劑改善口感。植物乳桿菌等乳酸菌常單獨(dú)或混合作為發(fā)酵劑應(yīng)用于發(fā)酵香腸的制備，然而生產(chǎn)的發(fā)酵香腸在風(fēng)味上還無法與自然發(fā)酵生產(chǎn)的香腸競(jìng)爭(zhēng)。

Saulnier等[8]研究表明：當(dāng)蔗糖/果聚糖攝取和降解相關(guān)基因表達(dá)受到抑制時(shí)，植物乳桿菌將上調(diào)其支鏈氨基酸攝取及相關(guān)代謝基因的表達(dá)。而支鏈氨基酸、芳香族氨基酸和含硫氨基酸代謝產(chǎn)物對(duì)發(fā)酵香腸典型風(fēng)味的形成具有重要意義。蔗糖利用缺陷的植物乳桿菌菌種作為發(fā)酵劑，可改善發(fā)酵香腸的風(fēng)味，降低酸度。YesN是雙組分系統(tǒng)YesM/YesN中的應(yīng)答調(diào)控子，屬于參與細(xì)菌代謝、脅迫應(yīng)答和毒力因子的AraC/XylS轉(zhuǎn)錄調(diào)控子家族。雙組分系統(tǒng)YesM/YesN的生物學(xué)功能目前還不清楚，主要參與細(xì)菌降解植物細(xì)胞壁多糖和細(xì)胞內(nèi)糖代謝的調(diào)控[9-11]。徐文生等[12]研究表明：植物乳桿菌轉(zhuǎn)錄調(diào)控子基因yesN參與細(xì)胞的蔗糖代謝。植物乳桿菌SNB是本實(shí)驗(yàn)室通過基因敲除技術(shù)構(gòu)建的一株植物乳桿菌基因yesN缺陷菌株。為研究以植物乳桿菌SNB作為模式菌株應(yīng)用于中式發(fā)酵香腸發(fā)酵劑的潛力，本研究以植物乳桿菌SNB為發(fā)酵劑制備香腸，檢測(cè)發(fā)酵香腸揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)成分、酸度、總游離氨基酸等指標(biāo)，并與自然發(fā)酵制備香腸和以野生植物乳桿菌為發(fā)酵劑制備香腸進(jìn)行比較。

1 材料與方法

1.1 材料

菌種：植物乳桿菌WT，購自中國工業(yè)微生物菌種保藏中心；植物乳桿菌SNB，本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建保存的基因yesN缺陷植物乳桿菌。

1.2 方法

1.2.1 發(fā)酵劑準(zhǔn)備 100 mL過夜培養(yǎng)的植物乳桿菌菌液倒入滅菌大離心管中，5 000 r/min 5 min離心后棄上清。用滅菌生理鹽水重懸菌體，再次離心棄上清，重復(fù)2次。獲得的菌泥加入少量滅菌的生理鹽水重懸菌體后加入香腸中。

1.2.2 香腸制備[13-14]將瘦肉、肥肉切丁后按3∶1的比例混合，并加入大曲酒、鹽、味精、醬油、白糖等輔料充分?jǐn)嚢杌靹蚝蠓殖?等份。不添加植物乳桿菌直接填充腸衣的香腸樣品為空白對(duì)照（CK）；添加植物乳桿菌野生菌株后填充腸衣的香腸樣品記為（SEB）；添加蔗糖利用缺陷植物乳桿菌菌株后填充腸衣的香腸樣品記為（SNB）。制備的香腸置于恒溫恒濕培養(yǎng)箱內(nèi)發(fā)酵，發(fā)酵工藝參數(shù)為發(fā)酵溫度 24℃，濕度90%～95%，發(fā)酵48 h后將溫度調(diào)至20℃，濕度降至70%～80%，發(fā)酵120 h后，濕度降至60%～70%進(jìn)行干燥240 h后即為成品，真空包裝后貯藏于室溫。

1.2.3 揮發(fā)性成分的提取[15]準(zhǔn)確稱取30.0 g剪碎的發(fā)酵成熟香腸裝入100 mL樣品瓶中密封。80℃水浴30 min。插入涂層為聚二甲基硅氧烷、厚度75 μm，先在GC進(jìn)樣口220℃解吸5 min的萃取頭并推出探頭，平衡30 min完成吸附。后將萃取頭插入GC/MS進(jìn)樣器中解析5 min。

1.2.4 儀器及試驗(yàn)條件[13-14]氣/質(zhì)聯(lián)用儀（GC/MS）為 Agilent 5957C-7980A。色譜柱為 DB-5（60 m×0.25 mm×0.25 μm）；載氣：He，流量 1 mL/min，不分流；程序升溫為：初始35℃，維持5 min；升溫至 100℃（升溫速率 1.5℃/min），維持 5 min；升溫至 200℃（升溫速率 2.5℃/min），保持 5 min；最后溫度升至240℃（升溫速率 10℃/min），保持5 min。EI電離源，電子能量為70 eV，離子阱溫度220℃；傳輸線溫度 280℃，掃描范圍：43～500 m/z，方式全掃描（Full Scan）。結(jié)果通過NIST08譜圖庫進(jìn)行譜圖成分解析；按峰面積歸一化法確定發(fā)酵香腸揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的相對(duì)百分含量。

1.2.5 可滴定酸含量測(cè)定 取300 g剪碎后的香腸與300 mL蒸餾水置于拍打式均質(zhì)袋中拍打2 min。取40 mL勻漿轉(zhuǎn)移容量瓶中，70℃水浴保溫45 min后定容至200 mL，過濾。取20 mL濾液加入30 mL蒸餾水，以酚酞作為指示劑，用0.1 mol/L NaOH滴定。每個(gè)樣3次平行，3次重復(fù)。

1.2.6 總游離氨基酸的測(cè)定 取300 g剪碎后的香腸與300 mL蒸餾水置于拍打式均質(zhì)袋中拍打2 min。取0.8 g勻漿，加入10%乙酸1 mL和6.2 mL水，混勻，冷凍離心。吸取0.5 mL上清，采用茚三酮顯色法測(cè)定總游離氨基酸的含量。

1.2.7 熒光定量PCR 總RNA的提取和cDNA的合成方法分別見promega相關(guān)試劑盒使用說明書，構(gòu)建16 μL RT-qPCR總反應(yīng)體系包括100 ng cDNA，32 μL 引物對(duì)混合液，8 μL PCR 混合液，1.25 μL SYBR溶液，反應(yīng)步驟為 95℃ 3 min；95 ℃ 10 s，58 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，45 個(gè)循環(huán)。檢測(cè)基因scrA、sacK1和scrR的引物對(duì)分別為scrAF（TCAGCCTACATCAGGTTTG）、scrAR（GTCGGCAGTACGGACATT），sacK1F（TCGCTTCAACATCCCACTCTAC）、sacK1R（CTTTCCCCGTTCGTTTTCC）和scrRF（GTGATTTTATGTAATAGTGCGGATGA）、scrRR（CGTTGGCGAACCAGCGT）。

2 結(jié)果與討論

2.1 蔗糖利用缺陷植物乳桿菌特性

蔗糖利用缺陷植物乳桿菌SNB是通過基因工程技術(shù)缺失植物乳桿菌ATCC14917內(nèi)調(diào)控糖代謝的應(yīng)答調(diào)控子基因yesN獲得的突變菌株。為揭示基因yesN突變對(duì)植物乳桿菌蔗糖利用的影響，以蔗糖為唯一碳源的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中培養(yǎng)植物乳桿菌，其生長特性見圖1。如圖1所示，接種16 h后，植物乳桿菌野生菌株OD600值為0.69，而突變菌株在同樣條件下OD600值僅為0.3左右。由此可見突變菌株利用蔗糖生長能力顯著低于野生菌株。為確定基因yesN缺失對(duì)植物乳桿菌蔗糖利用基因座基因表達(dá)的影響，采用RT-qPCR技術(shù)檢測(cè)植物乳桿菌中蔗糖代謝基因座基因scrA、scrR和sacK1的表達(dá)。結(jié)果如圖2所示，相對(duì)于野生菌株，突變菌株蔗糖代謝基因座基因scrA、scrR和sacK1的表達(dá)量下降82.0%到87.0%，表明突變菌株利用蔗糖生長能力大大下降。

2.2 發(fā)酵香腸中細(xì)菌生長、總可滴定酸

中式發(fā)酵香腸發(fā)酵及其后熟均與香腸中微生物特別是乳酸菌的生長、代謝密切相關(guān)。香腸制備期間微生物指標(biāo)變化見圖3：第0天，樣品CK和添加發(fā)酵劑的樣品SEB和SNB中總細(xì)菌數(shù)大約為3.85到 4.70 lg CFU/g；到第3天，所有樣品中總細(xì)菌數(shù)均達(dá)到最大水平（見圖3）。乳酸菌對(duì)發(fā)酵香腸的成熟起著至關(guān)重要的作用。乳酸菌計(jì)數(shù)（見圖4）顯示：前3天，乳酸菌數(shù)量快速增加，從第 0天的 3.59～5.98 lg CFU/g增加到第 3天的4.95～8.65 lg CFU/g。發(fā)酵香腸中乳酸菌的生長伴隨著各種有機(jī)酸特別是乳酸的生成。因此，發(fā)酵香腸中乳酸菌的快速生長常伴隨著香腸酸度的增加，這樣有利于快速降低香腸pH值而抑制有害微生物如腸桿菌等的生長[16]。

圖1 植物乳桿菌野生菌株和突變菌株利用蔗糖生長特性Fig.1 The growth curve of L.plantarum WT and ΔyesN mutant strains

圖2 植物乳桿菌野生菌株和突變菌株蔗糖利用基因座基因表達(dá)Fig.2 The expression profiles of sucrose utilization locus gens in L.plantarum WT and L.plantarum ΔyesN

圖3 不同發(fā)酵劑對(duì)發(fā)酵香腸菌落總數(shù)的影響Fig.3 The total plate count profiles of fermented sausage with different starter culture

圖4 不同發(fā)酵劑對(duì)發(fā)酵香腸乳酸菌總數(shù)的影響Fig.4 The total plate count of lactic acid bacterium profiles of fermented sausage with different starter culture

發(fā)酵香腸有機(jī)酸的生成可以通過檢測(cè)總可滴定酸的量來分析。試驗(yàn)結(jié)果表明總可滴定酸的含量在發(fā)酵期間快速增加（見圖5），第3天時(shí)達(dá)到0.35～0.50 mg/100 g，其中樣品SNB與樣品CK總可滴定酸的含量比較接近，與樣品SEB中總可滴定酸含量差異顯著。發(fā)酵香腸由于乳酸菌產(chǎn)生大量乳酸等有機(jī)酸一般口感偏酸，需要大量添加蔗糖等作為微生物的碳源和甜味劑。蔗糖等甜味劑的使用既可以促進(jìn)乳酸菌等有益微生物的快速生長，也可以改善香腸的口感。但蔗糖的大量使用已經(jīng)不符合現(xiàn)代食品低糖、低脂的發(fā)展方向。因此，相對(duì)于使用野生菌株作為發(fā)酵劑，使用模型菌株更有利于降低蔗糖的使用。

中式發(fā)酵香腸的總游離氨基酸含量見圖6，發(fā)酵香腸總游離氨基酸含量從第1天的19.80 mg/100 g快速增長到第3天的66.75～84.67 mg/100 g，到第 15 天增加至 79.89～120.69 mg/100 g之間。發(fā)酵香腸的生產(chǎn)工藝對(duì)發(fā)酵香腸的總游離氨基酸含量有著一定的影響，如有些學(xué)者報(bào)道總游離氨基酸的含量在發(fā)酵階段快速增加，而有些研究則報(bào)道總游離氨基酸在后熟階段快速增加[16]。肉類蛋白的水解能力主要來源于內(nèi)源性或微生物蛋白酶，不同的乳酸菌擁有不同的蛋白裂解能力[17-18]，在發(fā)酵階段總游離氨基酸的快速增加意味著在這個(gè)階段相關(guān)酶活性最高。在本研究中，樣品SNB和SEB中蛋白裂解能力顯著低于樣品CK（P＜0.01）。而樣品SNB中總游離氨基酸的含量也顯著高于樣品 SEB（P＜0.01）。

圖5 不同發(fā)酵劑對(duì)發(fā)酵香腸總可滴定酸的影響Fig.5 The total titratable acid profiles of fermented sausage with different starter culture

2.3 風(fēng)味成分

通過頂空固相微萃取技術(shù)從香腸中提取的揮發(fā)性風(fēng)味成分見表1，共檢測(cè)到包括7種酸、18種醛、3種酮、7種醇、10種酯等46種揮發(fā)性風(fēng)味成分，其中醛和乙酯類成分占主導(dǎo)地位。脂肪氧化產(chǎn)生的各種揮發(fā)性成分如各種飽和脂肪醛（己醛、庚醛、壬醛），不飽和脂肪醛（2-己醛、2，4-庚二醛、2-辛烯醛、2-壬烯醛、2，4-壬二烯醛、2-癸烯醛等），酮（4-羥基丁酮、3-羥基丁酮），醇（1-辛烯-3-醇、3-甲基丁醇）等是發(fā)酵香腸風(fēng)味形成的重要基礎(chǔ)，這些物質(zhì)對(duì)發(fā)酵香腸揮發(fā)性風(fēng)味特征的形成具有重要意義，也是發(fā)酵香腸不良風(fēng)味的重要來源[11，19-20]。一般而言，添加植物乳桿菌發(fā)酵香腸與傳統(tǒng)發(fā)酵香腸在揮發(fā)性風(fēng)味成分上存在顯著差異，特別是產(chǎn)生的不良風(fēng)味物質(zhì)相對(duì)于傳統(tǒng)工藝發(fā)酵香腸顯著減少[21]。

圖6 不同發(fā)酵劑對(duì)發(fā)酵香腸總游離氨基酸的影響Fig.6 The profiles of total free amino acid in fermented sausage with different starter culture

2.3.1 來源于氧化作用的風(fēng)味成分 醛類成分能夠形成廣泛的風(fēng)味且具有較低的感覺閾值，是發(fā)酵香腸中來源于脂肪氧化的最受關(guān)注的一類風(fēng)味成分[22-24]。不同生產(chǎn)工藝制備的發(fā)酵香腸中，醛類的種類和占總揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的含量有所不同[25-27]，含有6～8個(gè)碳原子的脂肪醛，如庚醛、壬醛和己醛常作為脂質(zhì)氧化的標(biāo)志，是發(fā)酵香腸中重要的揮發(fā)性醛類[25]。苯甲醛和苯乙醛是亮氨酸和苯丙氨酸代謝的標(biāo)志性產(chǎn)物。苯甲醛有烤花生的香味，苯乙醛產(chǎn)生的香味與山楂相似[27-29]。己醛具有一種難聞的青草味，由不飽和脂肪酸氧化降解形成醛類[26]，庚醛擁有典型的土豆味而壬醛則擁有典型的水果香味。

酸類在3種樣品中大約占到總離子峰的2.98%～6.32%。長鏈（C14-C18）和中鏈（C6-C12）脂肪酸在3種發(fā)酵香腸中均有分布，它們主要是從甘油三酯、磷脂或油脂降解形成[20]。長鏈或中鏈脂肪酸本身對(duì)提高發(fā)酵香腸風(fēng)味沒有作用，主要是作為風(fēng)味成分的前體物質(zhì)，通過進(jìn)一步降解形成不同風(fēng)味物質(zhì)影響發(fā)酵香腸的口感或香味[30]。短鏈脂肪酸（C＜6）一般檢測(cè)閾值較低且具有濃郁的干酪味，是影響中式發(fā)酵香腸的主要成分之一。在本研究中，樣品SEB中短鏈脂肪酸的含量顯著高于（P＜0.01）樣品CK和SNB。有些研究者發(fā)現(xiàn)在發(fā)酵香腸中存在乙酸[30]，但本研究樣品中沒有發(fā)現(xiàn)。

表1 發(fā)酵香腸風(fēng)味成分分析Table 1 Volatile component of Chinese fermented sausage

2.3.2 來源于氨基酸降解的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì) 醛類（苯甲醛、苯乙醛）、醇類（3-甲基丁醇，苯乙醇）、酸類（3-甲基丁酸）、酯類（3-甲基丁酸乙酯、苯酸乙酯）均檢測(cè)到。3-甲基丁醛、3-甲基丁醇、3-甲基丁酸、3-甲基丁酸乙酯均來源于支鏈氨基酸降解。本研究在樣品SNB中，來源于支鏈氨基酸降解的風(fēng)味成分的相對(duì)含量顯著高于樣品SEB和CK，其機(jī)理可能與在植物乳桿菌中蔗糖能夠抑制支鏈氨基酸攝取和降解代謝基因表達(dá)有關(guān)[8，31]。發(fā)酵香腸中添加氨基酸并不能顯著增加發(fā)酵香腸的典型風(fēng)味，氨基酸特別是支鏈氨基酸、芳香族氨基酸和含硫氨基酸通過微生物的降解代謝，才能夠形成發(fā)酵香腸中濃郁香味[16]。

2.3.3 來源于微生物代謝的揮發(fā)性成分 微生物代謝活性在發(fā)酵香腸中與氨基酸降解、碳源發(fā)酵、酯類的β-氧化和酯酶活性有關(guān)[32]。本研究檢測(cè)發(fā)酵香腸中來源于微生物代謝碳源的成分主要有4-羥基丁酮和3-羥基丁酮。微生物代謝形成的揮發(fā)性風(fēng)味成分的濃度受微生物的顯著影響[27，33]，在樣品CK和SNB中，碳源代謝產(chǎn)物的離子峰面積顯著高于樣品SEB。酮類成分主要來源于微生物的β-氧化，樣品SNB中酮類的相對(duì)含量顯著高于樣品 SEB（P＜0.01）。

酯類是發(fā)酵香腸中第二豐富的揮發(fā)性風(fēng)味成分[20]。由于酯類具有較低的檢測(cè)閾值和水果香味，酯類被認(rèn)為是中式發(fā)酵香腸揮發(fā)性風(fēng)味的重要組成成分[25-27]。許多乙酯類成分如己酸乙酯、辛酸乙酯在3種樣品中均有分布，且在其它發(fā)酵香腸中也有發(fā)現(xiàn)[12，30，34-35]。而來源于氨基酸代謝的 3-甲基丁酸乙酯則僅在樣品SNB和SEB中發(fā)現(xiàn)。

3 總結(jié)

總之，添加植物乳桿菌基因yesN缺陷菌株制備香腸在檢測(cè)到的揮發(fā)性風(fēng)味成分，特別是典型揮發(fā)性風(fēng)味成分方面，明顯優(yōu)于傳統(tǒng)發(fā)酵工藝生產(chǎn)的發(fā)酵香腸，而在總可滴定酸、總游離氨基酸等指標(biāo)方面則明顯優(yōu)于添加野生菌株的植物乳桿菌菌株。雖然突變菌株涉及基因修飾微生物而未進(jìn)行品評(píng)試驗(yàn)，但研究表明蔗糖利用缺陷植物乳桿菌具有作為改良中式發(fā)酵香腸發(fā)酵工藝的模式菌株，應(yīng)用于篩選中式發(fā)酵香腸發(fā)酵菌株的潛力。