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        環(huán)狀RNA FBLIM1在肝細(xì)胞癌中生物學(xué)功能的初步研究

        2019-10-12 06:01:48彭婀敏夏發(fā)達(dá)王文龍姚磊梁婕白寧
        中國普通外科雜志 2019年9期
        關(guān)鍵詞:實驗研究

        彭婀敏,夏發(fā)達(dá),王文龍,姚磊,梁婕,白寧

        (中南大學(xué)湘雅醫(yī)院 1.國際醫(yī)療部 2.普通外科 3.急診科,湖南 長沙 410008)

        原發(fā)性肝癌是世界范圍內(nèi)最為常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一,至今仍沒有得到充分有效的控制,呈現(xiàn)較高的病死率[1-3]。原發(fā)性肝癌病理類型包括肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)(75%~85%)、膽管細(xì)胞癌(10%~15%)、混合型肝癌以及其他罕見類型。目前,針對HCC的治療方法主要是以外科手術(shù)為主的包括:肝移植、經(jīng)皮穿刺射頻消融、介入治療和分子靶向藥物、免疫治療藥物等為輔的綜合治療[4-6]。然而,盡管手術(shù)技術(shù)和與之相配套的綜合治療方案在過去幾十年不斷改善,但HCC的預(yù)后仍然很差[7-9]。大部分HCC患者在初診的時候已經(jīng)處于晚期,失去了手術(shù)治療的機(jī)會,并且即使接受了系統(tǒng)的治療,HCC患者5年復(fù)發(fā)率也高達(dá)70%[10]。因此,對HCC發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制進(jìn)行深入研究,尋找新的分子靶點以發(fā)掘更有效的HCC治療策略成為需迫切解決的問題。

        環(huán)狀RNA(circular RNA,circRNA)是內(nèi)源性非編碼RNA的一類,其結(jié)構(gòu)為共價環(huán)狀閉合的單鏈RNA。近年來,隨著生物信息學(xué)以及RNA測序技術(shù)的發(fā)展,研究者逐漸認(rèn)識到circRNA在生命科學(xué)當(dāng)中的重要作用。Sand 等[11]發(fā)現(xiàn)23 個circRNA在基底細(xì)胞癌中上調(diào),48個下調(diào)。另有研究[12]發(fā)現(xiàn)hsa_circ_002059在胃癌的表達(dá)明顯比癌旁組織低,可作為胃癌的生物標(biāo)志物。與mRNA和lncRNA相比,HCC中circRNA的研究仍處于初步階段,在HCC中circRNA的作用及分子機(jī)制仍然不明。到 目前為止,在HCC 中僅鑒定和表征了少量功能性circRNA。筆者前期對HCC患者的腫瘤組織及其癌旁肝組織進(jìn)行了高通量的circRNA芯片篩選,發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0010090是在HCC 細(xì)胞系當(dāng)中上調(diào)最為明顯的環(huán)狀RNA,根據(jù)人類參考基因組(GRCh37/hg19),發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0010090(chr1:16084668-16113084)是源自于位于染色體1p36.21上的FBLIM1基因,故將其命名為“circFBLIM1”。本研究將進(jìn)一步探討circFBLIM1在HCC中的功能,為發(fā)現(xiàn)circRNA在HCC中的診斷、治療及預(yù)后評估方面的潛在價值提供基礎(chǔ)。

        1 材料與方法

        1.1 細(xì)胞株及培養(yǎng)

        HCC細(xì)胞系HepG2、7402、97H均購買自美國ATCC,并且嚴(yán)格按照美國模式培養(yǎng)物保藏所的要求進(jìn)行培養(yǎng)。所有細(xì)胞系在使用后每6個月通過短串聯(lián)重復(fù)DNA分析重新鑒定,并且排除支原體感染。所有細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%FBS(巴西GIBCO)的DMEM(美國Invitrogen)中,于37 ℃,5%CO2條件下細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

        1.2 實驗動物

        4周齡,BALB/c雌性裸鼠,30只,(20±2)g,由上海斯萊克實驗動物有限公司提供。在無特定病原體條件下飼養(yǎng),飼養(yǎng)地點:中南大學(xué)實驗動物部。所有動物研究均經(jīng)中南大學(xué)湘雅醫(yī)院的機(jī)構(gòu)動物護(hù)理和使用委員會(IACUC)批準(zhǔn)。根據(jù)IACUC方案遵循標(biāo)準(zhǔn)動物護(hù)理和實驗室指南。

        1.3 主要試劑及儀器

        RNAiso plus、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及qRT-PCR試劑盒均購自日本Takara公司;Transwell小室、基質(zhì)膠Matrigel(BD);ThermoND2000C超微量分光光度計(Thermo)、GeneAmp PCR system 9700擴(kuò)增儀(PerkinElmer)、Ligh tCycler?480 II System(Roche)。circFBLIM1干擾序列(sicircFBLIM1):GCA AUA CAC AAG UGC AUA CTT;陰性對照序列:UUC UCC GAA CGU GUC ACG UTT(廣州銳博生物科技有限公司合成)。

        1.4 方法

        1.4.1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 取對數(shù)生長期的HCC 細(xì)胞株接種于6 孔板(5×105/ 孔)中待生長至匯合度為50% 時,按照Lipofectamine2000 說明書要求分別轉(zhuǎn)染si-circFBLIM1 與陰性對照序列。

        1.4.2 qRT-PCR 提取好的RNA 進(jìn)行濃度測定,各取1 μg RNA 參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。將cDNA 進(jìn)行一定的稀釋,作為RT-PCR 的模板,參照熒光定量PCR 試劑盒(SYBR染料法)說明書進(jìn)行PCR。mRNA 相對表達(dá)水平的定量采用比較Ct 法來計算相對定量,內(nèi)參選擇GAPDH。

        1.4.3 CCK-8 實驗 HCC 細(xì)胞株轉(zhuǎn)染后24 h 后,以100 μL 細(xì)胞懸液(約1×103細(xì)胞)接種到96 孔板,分別在0、1、2、3、5 d 后加入10 μL/孔CCK-8 溶液,避光37 ℃培養(yǎng)2 h,用Bio-Tek EPOCH2 檢測450 nm 波長處的吸光度。

        1.4.4 Transwell 試驗 HCC 細(xì)胞株轉(zhuǎn)染后24 h后,采用胰酶消化細(xì)胞并離心棄上清,用無血清的培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,按照1:8 比例稀釋50 mg/L的Matrigel 后,加50 μL稀釋后的Matrigel 包被Transwell 小室底部膜,將1×105/100 μL 細(xì)胞懸液接種到上室,下室加500μL 含10%FBS 的DMEM 培養(yǎng)液,48 h 后取出小室,棄上室培養(yǎng)基,用棉簽拭掉頂部的未侵入細(xì)胞,在光學(xué)顯微鏡下計數(shù)入侵細(xì)胞。

        1.4.5 裸鼠皮下成瘤實驗 將HepG2 細(xì)胞懸浮于無血清培養(yǎng)液中,調(diào)整濃度至5×107/mL,將細(xì)胞接種于裸鼠一側(cè)腋部皮下后為2 組,每組5 只裸鼠,以40 μL 陰性對照序列或si-circFBLIM1 進(jìn)行接種部位原位多點注射,1 次/4 d;記錄觀察裸鼠的一般情況、移植瘤形成的時間及大小;每4 天用游標(biāo)卡尺測移植瘤最長徑(L)和最短徑(W),連續(xù)測量28 d,繪制移植瘤生長曲線;實驗結(jié)束后,將腫瘤完整剝離并進(jìn)行大體照相,測量腫瘤體積及質(zhì)量。

        1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

        采用SPSS21.0 統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。分別使用t檢驗、One-way ANOVA進(jìn)行各組之間的差異分析。所有數(shù)據(jù)顯示為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s),P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

        2 結(jié) 果

        2.1 干擾效果檢測

        qRT-PCR檢測結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染si-circFBLIM1后,HepG2、7402和97H細(xì)胞中的circFBLIM1的表達(dá)水平均明顯下調(diào),與各自轉(zhuǎn)染陰性對照序列的同種細(xì)胞比較,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.01)(圖1)。

        圖1 si-circFBLIM 在3 種HCC 細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染效率檢測Figure 1 Determination of the transfection efficiency of sicircFBLIM in the three different HCC cells

        2.2 下調(diào)circFBLIM1 對HCC 細(xì)胞增殖的影響

        CCK8實驗結(jié)果顯示,在轉(zhuǎn)染si-circFBLIM1后,3種HCC細(xì)胞的增殖能力均明顯減弱,在450 nm處的OD值在轉(zhuǎn)染后3、4、5 d明顯均較各自陰性對照組明顯降低(均P<0.01)(圖2)。

        2.3 下調(diào)circFBLIM1 對HCC 細(xì)胞侵襲能力的影響

        Transwell實驗結(jié)果顯示,3種HCC細(xì)胞轉(zhuǎn)染si-circFBLIM1后,細(xì)胞穿過Transwell膜的數(shù)目與各自陰性對照組比較均明顯減少(均P<0.01)(圖3)。

        2.4 下調(diào)circFBLIM1 對HCC 細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)生長的影響

        皮下注射裸鼠成瘤實驗中,通過連續(xù)28 d的觀察,結(jié)果發(fā)現(xiàn)利用si-circFBLIM1下調(diào)HepG2細(xì)胞中circFBLIM1的表達(dá)水平之后,HCC在裸鼠體內(nèi)的生長速度明顯減慢,腫瘤體積與質(zhì)量明顯降低,與陰性對照組有明顯差異(均P<0.01)(圖4)。

        圖2 CCK-8 實驗檢測HCC 細(xì)胞增殖Figure 2 Proliferation of HCC cells detected by CCK-8 assay

        圖3 Transwell 實驗檢測HCC 細(xì)胞的侵襲能力(×200)Figure 3 Invasion ability measured by Transwell assay (×200)

        圖4 裸鼠移植瘤實驗 Figure 4 Nude mouse tumor transplantation mode

        3 討 論

        circFBLIM1即hsa_circ_0010090(chr1:16084668-16113084),其來源于FBLIM1基因(1p36.21)。通過調(diào)研文獻(xiàn),circFBLIM1的生物學(xué)功能到目前為止尚未見報道。為了初步評估circFBLIM1在HCC中的生物學(xué)功能,本研究通過轉(zhuǎn)染si-circFBLIM1的方式來下調(diào)HCC細(xì)胞系(HepG2、7402和97H)中circFBLIM1的表達(dá)。通過CCK-8細(xì)胞增殖實驗發(fā)現(xiàn),在HCC細(xì)胞中下調(diào)circFBLIM1的表達(dá),能夠顯著抑制HCC細(xì)胞的增殖能力。后續(xù)的Transwell實驗結(jié)果顯示,通過抑制circFBLIM1的表達(dá)能夠使得HCC細(xì)胞系穿過Transwell膜的能力大大下降,提示侵襲能力受到抑制。在皮下注射裸鼠成瘤實驗當(dāng)中,通過向10只BALB/c裸鼠皮下注射HepG2細(xì)胞,并瘤內(nèi)注射陰性對照序列或si-circFBLIM1進(jìn)行處理,結(jié)果發(fā)現(xiàn),瘤內(nèi)注射si-circFBLIM1后,腫瘤體積顯著縮小,此項結(jié)果提示,下調(diào)circFBLIM1能顯著減慢HCC體內(nèi)腫瘤生長速度。以上實驗結(jié)果表明,下調(diào)circFBLIM1能抑制HCC細(xì)胞增殖、侵襲、促進(jìn)凋亡,在體內(nèi)抑制腫瘤生長,進(jìn)一步從反向證明了中circFBLIM1在HCC中發(fā)揮促進(jìn)細(xì)胞增殖、侵襲的作用。

        文獻(xiàn)[13-14]報道,HCC組織中circMTO1的減少可以作為患者生存率低的預(yù)后預(yù)測因子。Lin等[15]報道在各種HCC 細(xì)胞系和HCC 患者的組織樣品中,circCDK13表達(dá)受到抑制。在HCC細(xì)胞中誘導(dǎo)的circCDK13過表達(dá)顯著抑制了它們的遷移速率,改變了細(xì)胞周期進(jìn)程,并抑制了細(xì)胞遷移和侵襲能力。微陣列分析還鑒定了由circCDK13調(diào)節(jié)的許多下游基因,特別JAK/STAT以及PI3K/Akt信號通路。致瘤性測定的結(jié)果顯示,circCDK 13過表達(dá)顯著抑制裸鼠的HCC進(jìn)展。Qin等[16]研究發(fā)現(xiàn),基于89對HCC組織和鄰近肝組織樣本的分析,hsa_circ_0001649表達(dá)在HCC組織中顯著下調(diào)(P=0.0014),并且ROC曲線下面積(AUC)為0.63。此外,hsa_circ_0001649表達(dá)與HCC中腫瘤大?。≒=0.045)和瘤栓的發(fā)生(P=0.017)密切相關(guān)。

        近來,隨著生物信息學(xué)以及RNA 測序技術(shù)的發(fā)展,研究者逐漸認(rèn)識到circRNA在生命科學(xué)當(dāng)中的重要作用。據(jù)報道,RNA 可以作為競爭性內(nèi)源性RNA(competing endogenous RNA,ce RNA),通過競爭共有的miRNA 而互相調(diào)節(jié)[17-18]。circ RNA 主要存在于細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi),具有比一般的ce RNA 更多更穩(wěn)定的miRNA 應(yīng)答元件(MRE),因此circ RNA 能夠更有效的結(jié)合miRNA,成為miRNA海綿,作為ceRNA發(fā)揮作用,通過自身的MRE 競爭結(jié)合miRNA,調(diào)控靶基因的表達(dá)水平,最終影響其功能[19]。譬如過表達(dá)CDR1as能夠有效地“吸附”miR-7,從而下調(diào)miR-7,導(dǎo)致miR-7靶標(biāo)的表達(dá)水平升高[20-21]。Zheng 等[22]證實circ HIPK3 通過充當(dāng)海綿“吸附”miR-124等miRNA,從而抑制腫瘤的增殖。Hansen等[23]發(fā)現(xiàn)circRNA Sry可充當(dāng)miR-138的海綿。Yang等[24]研究發(fā)現(xiàn)來自FOXO3的cir cRNA hsa_circR NA_104170,通過吸附miR-22等一系列miRNA,抑制乳腺癌的細(xì)胞增殖及腫瘤血管生成。這些研究結(jié)果表明:circRNA在多種腫瘤中差異表達(dá),可作為關(guān)鍵調(diào)節(jié)分子,通過miRNA海綿的作用,影響腫瘤的多種生物學(xué)行為,發(fā)揮重要的調(diào)控功能。

        目前,circRNA在HCC中研究仍處于起步階段,對其在HCC的功能了解甚少,而機(jī)制的研究更為缺乏。本研究雖然初步觀察了circFBLIM1在HCC中的基本生物學(xué)作用,但對其作用機(jī)制仍未做深入研究。筆者推測circFBLIM1也可能通過充當(dāng)海綿“吸附”miRNA,進(jìn)而通過ceRNA機(jī)制調(diào)節(jié)miRNA靶基因的表達(dá)參與HCC的發(fā)生與發(fā)展。因此,本研究后續(xù)將通過各種生物信息學(xué)方法與不同分子生物學(xué)手段預(yù)測并查明circFBLIM1的靶miRNA,并進(jìn)一步構(gòu)建全面的circFBLIM1相關(guān)ceRNA網(wǎng)絡(luò),系統(tǒng)探明circFBLIM1在HCC中的功能及作用機(jī)制。

        總之,本研究基于前期發(fā)現(xiàn)circ FBLIM1 在HCC 中的高表達(dá),初步證明circ FBLIM1 能促進(jìn)HCC 細(xì)胞的增殖與侵襲,在HCC 中發(fā)揮促瘤作用。circFBLIM1可能作為HCC診斷治療中的新的生物標(biāo)志物和潛在靶點。

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