楊洋，鮑媛，吳新華，朱嶺，劉楊安

（1.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬武漢中心醫(yī)院 網(wǎng)絡(luò)醫(yī)療部，湖北 武漢 430014；2.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬武漢中心醫(yī)院后湖院區(qū) 肝膽胰外科，湖北 武漢 430021）

胰腺癌是致死率極高的惡性腫瘤，病死率預(yù)計(jì)將在2030年位居西方國(guó)家所有惡性腫瘤的第二位[1-2]。中國(guó)男性胰腺癌年發(fā)病率從2000年的約6/10萬(wàn)上升到2011年的約7/10萬(wàn)，相應(yīng)的病死率從約7/10萬(wàn)上升到約8/10萬(wàn)[3]。胰腺癌確診時(shí)大多已屬晚期，手術(shù)切除率僅10%～20%，預(yù)后較差[4]。早期診斷困難、易轉(zhuǎn)移和多藥耐藥性是導(dǎo)致預(yù)后不良的重要原因[5-6]。微小RNA（microRNA，miRNA）是一類(lèi)長(zhǎng)約22個(gè)核苷酸的非編碼RNA[7]。miRNA異常表達(dá)與腫瘤進(jìn)展密切相關(guān)[8-9]。miRNA可與信使RNA 的3'非翻譯區(qū)（3'-U T R）結(jié)合而抑制基因轉(zhuǎn)錄后表達(dá)[10]。miR-526b是最新鑒定的miRNA，在神經(jīng)膠質(zhì)瘤[11]和乳腺癌[12]中下調(diào)表達(dá)，發(fā)揮腫瘤抑制作用。盡管如此，胰腺癌中miR-526b表達(dá)水平及功能尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究探討miR-526b在胰腺癌中的表達(dá)，并探討其作用。

1 材料與方法

1.1 組織樣本收集

收集2013年1月—2015年1月間在華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬武漢中心醫(yī)院肝膽胰外科收治的52例胰腺癌患者臨床病理標(biāo)本。納入標(biāo)準(zhǔn)：⑴ 經(jīng)病理診斷為胰腺癌且行手術(shù)治療的患者；⑵ 患者具有完整的臨床及隨訪資料。排除標(biāo)準(zhǔn)：臨床或病理資料不全者?；颊咝g(shù)后立即將胰腺癌和癌旁組織凍存于-80 ℃冰箱。醫(yī)院倫理委員會(huì)同意并批準(zhǔn)該研究實(shí)施。

1.2 細(xì)胞及主要試劑和儀器

人胰腺癌細(xì)胞系（BxPC-3、SW1990、PANC-1 和As PC-1）和胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞系（HPDE6-C7）購(gòu)自美國(guó)ATCC細(xì)胞庫(kù)。One Step Prime script miRNA cDNA合成試劑盒、細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8（CCK8）、微孔板分光光度計(jì)、膜聯(lián)蛋白V-熒光素異硫氰酸酯（FITC）/碘化丙啶（PI）檢測(cè)試劑盒購(gòu)于北京生物試劑有限公司?；|(zhì)膠Matrigel及Transwell小室購(gòu)于美國(guó)Invitrogen公司、miR-526b過(guò)表達(dá)序列miR-526b模擬物及下調(diào)表達(dá)序列miR-526b抑制物和陰性對(duì)照序列購(gòu)自北京生物試劑有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染和分組 將4 種胰腺癌細(xì)胞系和正常胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞系置于有10% 胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)基，并在37 ℃和5%CO2下培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期且生長(zhǎng)良好的細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)和轉(zhuǎn)染。用lipofectamineTM2000 按說(shuō)明書(shū)方案轉(zhuǎn)染：其中包括上調(diào)miR-526b 表達(dá)的miR-526b模擬物、下調(diào)miR-526b 表達(dá)的miR-526b 抑制物和陰性對(duì)照序列分別轉(zhuǎn)染AsPC-1 細(xì)胞，并分為miR-526b 模擬物組、miR-526b 抑制物組和空白對(duì)照組，通過(guò)qRT-PCR 檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。

1.3.2 qRT-PCR 按RNA 提取說(shuō)明書(shū)步驟提取組織總RNA 后，測(cè)定總RNA 濃度，再依據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，生成cDNA，XRCC5 和miR-526b 引物序列由上海生工生物工程股份有限公司合成。XRCC5 上游引物：ACA TCG GCA TGA TGG CAG AA； 下游引物：TCA CAA AAG GCG GGA CCA C；miR-526b 上游引物：ACATCGGCATGATGGCAGAA；下游引物：TCA CAA AAG GCG GGA CCAC，GAPDH 上游引物：GTA ACC CGT TGA ACC CCA TT；下游引物為：CCA TCC AAT CGG TAG TAG CG，其中GAPDH為內(nèi)參，結(jié)果分析采用2-ΔΔCT法定量。

1.3.3 細(xì)胞侵襲試驗(yàn) 將1×105/100 μL 細(xì)胞懸液接種到上室，按1:8 比例對(duì)50 mg/L 的Matrigel稀釋后，將Transwell 小室底部膜包被。DMEM 培養(yǎng)液500 μL 加于小室的下室，48 h 后取出小室，采用4% 多聚甲醛固定細(xì)胞，時(shí)間15 min，采用結(jié)晶紫染色，染色時(shí)長(zhǎng)10 min，PBS 漂洗后200 倍視野下鏡檢并計(jì)數(shù)侵襲細(xì)胞數(shù)目。

1.3.4 細(xì)胞增殖和凋亡實(shí)驗(yàn) 用細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8（CCK-8）測(cè)定細(xì)胞增殖。將96 孔板用轉(zhuǎn)染的細(xì)胞（5×103細(xì)胞/ 孔）接種96 h，每24 h，每孔接受10 μL CCK-8 溶液孵育4 h。然后用微孔板分光光度計(jì)在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)測(cè)量450 nm 處的吸光度。流式細(xì)胞術(shù)使用膜聯(lián)蛋白V- 熒光素異硫氰酸酯（FITC）/ 碘化丙啶（PI）檢測(cè)試劑盒評(píng)估凋亡程度。將總共約5×104AsPC-1 細(xì)胞接種到6 孔板中用于細(xì)胞凋亡測(cè)定，使用膜聯(lián)蛋白V-FITC 凋亡檢測(cè)試劑盒,按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行染色程序，使用Cell-Quest 軟件分析細(xì)胞凋亡率。

1.3.5 熒光素酶報(bào)告基因測(cè)定 將含有預(yù)測(cè)miR-526b 結(jié)合位點(diǎn)的X- 射線修復(fù)交叉互補(bǔ)蛋白5（X-ray repair cross-complementing protein 5，XRCC5）突變型3'UTR 和XRCC5野生型3'UTR 插入pmiRGLO 載體（Promega，美國(guó)）中。將AsPC-1細(xì)胞接種于96 孔板中，用XRCC5 野生型3'UTR或XRCC5 突變體3'UTR 熒光素酶報(bào)告基因和陰性對(duì)照序列或miR-526b 模擬物與Lipofectamine 2000 共轉(zhuǎn)染。在轉(zhuǎn)染48 h 后，采用雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)熒光素酶活性并以海腎活性標(biāo)準(zhǔn)化。

1.3.6 Western blot 分析 使用RIPA 緩沖液提取轉(zhuǎn)染細(xì)胞的總蛋白質(zhì)。用10%-12%SDS-PAGE 凝膠分離蛋白質(zhì)并轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。隨后，用5% 無(wú)脂牛奶封閉2 h，并與包括XRCC5（Santa Cruz，美國(guó)）和GAPDH（Santa Cruz，美國(guó)）一抗孵育。在4 ℃下過(guò)夜。根據(jù)制造商的說(shuō)明，用ECL 試劑盒（Beyotime，南京）檢測(cè)蛋白印跡。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析。胰腺癌組織中miR-526b表達(dá)水平與患者臨床病理參數(shù)采用卡方檢驗(yàn)；Kaplan-Meier生存分析和對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn)比較miR-526b高低表達(dá)患者生存率差異；胰腺癌組織中miR-526b和XRCC5mRNA表達(dá)間關(guān)系采用Pearson相關(guān)性分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 miR-526b 在胰腺癌中表達(dá)水平下調(diào)

胰腺癌組織中miR-526b 表達(dá)量明顯低于癌旁組織[（3.2±1.3）vs.（8.5±2.6），P＜0.001]（圖1A）；4種胰腺癌細(xì)胞系（BxPC-3、SW1990、PANC-1和AsPC-1）中miR-526b表達(dá)水平均明顯低于人正常胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞系HPDE6-C7（均P＜0.001）（圖1B）。

2.2 轉(zhuǎn)染效果檢測(cè)

與對(duì)陰性照組比較，AsPC-1細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-526b 模擬物后，miR-526b 表達(dá)水平明顯升高（P＜0.01），而轉(zhuǎn)染miR-526b抑制物后，miR-526b表達(dá)水平明顯降低（P＜0.01）（圖2）。

2.3 miR-526b 對(duì)胰腺癌細(xì)胞增殖的影響

CCK8結(jié)果顯示，miR-526b模擬物組增殖能力明顯低于陰性對(duì)照組（P＜0.01）；miR-526b抑制物組增殖能力明顯高于陰性對(duì)照組（P＜0.01）（圖3）。

圖1 qRT-PCR 檢測(cè)miR-526b 表達(dá) Figure 1 Expressions of imiR-526b detected by qRT-PCR and normal pancreatic ductal epithelial cells

圖2 miR-526b 轉(zhuǎn)染效率測(cè)定Figure 2 Determination of the transfection efficiency of miR-526b

2.4 miR-526b 對(duì)胰腺癌細(xì)胞凋亡的影響

流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果顯示，miR-526b模擬物組凋亡率明顯高于陰性對(duì)照組[（15.1±2.4）% vs.（8.2± 0.7）%，P＜0.05]；miR-526b抑制物組細(xì)胞凋亡率明顯低于陰性對(duì)照組[（4.6±0.4）% vs.（8.2± 0.7）%，P＜0.05]（圖4）。

圖4 miR-526b 表達(dá)對(duì)胰腺癌細(xì)胞凋亡的影響 Figure 4 Infl uence of miR-526b expression on apoptosis of pancreatic cancer cells

2.5 miR-526b 對(duì)胰腺癌細(xì)胞侵襲的影響

Trans well結(jié)果顯示（200 倍視野下），miR-526b模擬物組侵襲細(xì)胞 數(shù)明顯少于陰性對(duì)照組[（40±5）個(gè)vs.（70±12）個(gè)，P＜0.01]；miR-526b inhibitor 組侵襲細(xì)胞數(shù)明顯多于陰性對(duì)照組[（215±26）個(gè)vs.（70±12個(gè)），P＜0.01]（圖5）。

圖5 miR-526b 表達(dá)對(duì)胰腺癌細(xì)胞侵襲的影響 Figure 5 Infl uence of miR-526b expression on invasion of pancreatic cancer cells

2.6 miR-526b 上調(diào)抑制XRCC5 的表達(dá)

檢索miRanda數(shù)據(jù)庫(kù)（www.miroRNA.org）發(fā)現(xiàn)XRCC5是miR-526b潛在靶基因。miR-526b模擬物和XRCC5 野生型3'UTR（XRCC5-WT-3'UTR）共轉(zhuǎn)染，熒光素酶報(bào)告基因活性顯著性降低，miR-526b模擬物和突變型XRCC5的3'UTR（XRCC5-MUT的3'UTR）共轉(zhuǎn)染后，熒光素酶報(bào)告基因活性無(wú)改變。進(jìn)一步研究顯示，當(dāng)AsPC-1細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-526b模擬物后，細(xì)胞系中XRCC5的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)均較空白對(duì)照組（轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照組序列）明顯下調(diào)（均P＜0.05），當(dāng)AsPC-1細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-526b抑制物后，XRCC5的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)均較空白對(duì)照組明顯上調(diào)（均P＜0.05）（圖6）。

2.7 胰腺癌組織中miR-526b 和XRCC5 mRNA表達(dá)的相關(guān)性

Pearson相關(guān)顯示：胰腺癌組織中miR-526b 和XRCC5mRNA 表達(dá)水平呈顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.456,P＜0.001）（圖7）。

圖6 miR-526b 靶基因分析Figure 6 Analysis of the target gene for miR-526b

圖7 胰腺癌組織中miR-526b 和XRCC5 mRNA 表達(dá)的相關(guān)性Figure 7 Correlation between the expression of miR-526b and XRCC5 mRNA in pancreatic cancer tissue

3 討 論

胰腺癌是常見(jiàn)的高致死性腫瘤[13]。胰腺癌診斷時(shí)常處于晚期，即胰腺癌切除術(shù)后5年生存率仍低于20%[14-15]。研究胰腺癌的發(fā)病機(jī)制對(duì)改善胰腺癌預(yù)后尤為重要[16]。

本研究發(fā)現(xiàn)在胰腺癌患者病理標(biāo)本中，癌組織中miR-526b表達(dá)顯著低于癌旁組織；4種胰腺癌細(xì)胞系中miR-526b表達(dá)均較胰腺正常導(dǎo)管上皮細(xì)胞系下調(diào)，顯示miR-526b在胰腺癌組織和細(xì)胞系中表達(dá)下調(diào)，此結(jié)果與目前文獻(xiàn)報(bào)道存在一致性：文獻(xiàn)[17]報(bào)道在非小細(xì)胞肺癌患者中，無(wú)論病理類(lèi)型是鱗狀細(xì)胞癌還是腺癌，手術(shù)切除病理標(biāo)本中均可發(fā)現(xiàn)癌組織miR-526b表達(dá)水平顯著低于癌旁組織，同時(shí)在神經(jīng)膠質(zhì)瘤[11]、乳腺癌[12]和結(jié)腸癌[18]患者中，癌組織中miR-526b表達(dá)水平也低于癌旁組織，綜合上述結(jié)果提示在多種不同類(lèi)型的癌癥中均可發(fā)現(xiàn)癌組織中miR-526b表達(dá)水平受到抑制。

miR-526b在其他腫瘤中的表達(dá)及與預(yù)后的關(guān)系已有相關(guān)報(bào)道。在肝細(xì)胞癌中，癌組織中miR-526b低表達(dá)與低分化、TNM分期、轉(zhuǎn)移和門(mén)靜脈癌栓相關(guān)，且是影響預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[19]；在宮頸癌體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，miR-526b 低表達(dá)可促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過(guò)程而發(fā)揮促癌作用[20]。在體外胰腺癌細(xì)胞系A(chǔ)sPC-1中，通過(guò)上調(diào)miR-526b表達(dá)后，發(fā)現(xiàn)AsPC-1細(xì)胞增殖和侵襲能力受到明顯抑制，細(xì)胞凋亡比率顯著增加；而下調(diào)miR-526b表達(dá)后發(fā)現(xiàn)AsPC-1細(xì)胞增殖和侵襲能力顯著增強(qiáng)，細(xì)胞凋亡比率顯著下降，提示miR-526b表達(dá)可影響胰腺癌細(xì)胞增殖、侵襲和凋亡。

XRCC5是參與DNA雙鏈斷裂（DNA doublestrand breaks，DSBs）修復(fù)的主要基因，可編碼Ku80 蛋白[21]。在細(xì)胞生命活動(dòng)中，錯(cuò)誤修復(fù)的DSB是主要的DNA損傷，可導(dǎo)致染色體畸變、突變或癌變，是各種癌癥發(fā)生的重要機(jī)制之一[22]。臨床研究已經(jīng)證實(shí)XRCC5是重要的癌基因之一，XRCC5高表達(dá)導(dǎo)致Ku80蛋白過(guò)表達(dá)，Ku80蛋白高表達(dá)與膀胱癌[23]、宮頸癌[24]和結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移[25]進(jìn)展呈正相關(guān)，XRCC5高表達(dá)是上述癌癥發(fā)生和進(jìn)展的重要因素。在結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移的患者中，癌組織中XRCC5高表達(dá)與淋巴結(jié)和肝轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)[25]；在乳腺癌中研究者也發(fā)現(xiàn)XRCC5高表達(dá)是預(yù)測(cè)患者接受放射治療后不良預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[26]。通過(guò)生物信息檢索和雙熒光素酶報(bào)告基因結(jié)果顯示XRCC5是miR-526b潛在靶基因，同時(shí)文獻(xiàn)[17]報(bào)道在非小細(xì)胞肺癌中也證實(shí)miR-526b靶基因?yàn)閄RCC5，且miR-526b低表達(dá)直接靶向調(diào)節(jié)XRCC5基因高表達(dá)而促進(jìn)NSCLC進(jìn)展。

本研究結(jié)果顯示，在胰腺癌細(xì)胞系（AsPC-1）中，miR-526b表達(dá)可調(diào)節(jié)XRCC5基因表達(dá)；且在胰腺癌患者病理標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)胰腺癌組織中miR-526b表達(dá)與XRCC5 mRNA表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系A(chǔ)5490中，miR-526b上調(diào)可導(dǎo)致XRCC5基因表達(dá)水平降低、p53基因表達(dá)水平增加且促進(jìn)A549細(xì)胞凋亡[17]；同時(shí)在肺腺癌中miR-526b 可能調(diào)節(jié)XRCC5基因表達(dá)而影響肺腺癌患者化療敏感性[27]；結(jié)合本研究結(jié)果，提示miR-526b可能通過(guò)調(diào)節(jié)XRCC5基因表達(dá)而影響胰腺癌細(xì)胞增殖、侵襲和凋亡。

本研究存在如下不足：本研究并未在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中探討miR-526b和XRCC5表達(dá)變化對(duì)腫瘤進(jìn)展的影響，值得進(jìn)一步探究。

總之，胰腺癌患者miR-526b 表達(dá)下調(diào)，miR-526b 下調(diào)表達(dá)促進(jìn)癌細(xì)胞增殖、侵襲并抑制凋亡，機(jī)制可能與上調(diào)XRCC5 表達(dá)有關(guān)。