楊洋，鮑媛，吳新華，朱嶺，劉楊安

（1.華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬武漢中心醫(yī)院 網(wǎng)絡醫(yī)療部，湖北 武漢 430014；2.華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬武漢中心醫(yī)院后湖院區(qū) 肝膽胰外科，湖北 武漢 430021）

胰腺癌是致死率極高的惡性腫瘤，病死率預計將在2030年位居西方國家所有惡性腫瘤的第二位[1-2]。中國男性胰腺癌年發(fā)病率從2000年的約6/10萬上升到2011年的約7/10萬，相應的病死率從約7/10萬上升到約8/10萬[3]。胰腺癌確診時大多已屬晚期，手術切除率僅10%～20%，預后較差[4]。早期診斷困難、易轉(zhuǎn)移和多藥耐藥性是導致預后不良的重要原因[5-6]。微小RNA（microRNA，miRNA）是一類長約22個核苷酸的非編碼RNA[7]。miRNA異常表達與腫瘤進展密切相關[8-9]。miRNA可與信使RNA 的3'非翻譯區(qū)（3'-U T R）結(jié)合而抑制基因轉(zhuǎn)錄后表達[10]。miR-526b是最新鑒定的miRNA，在神經(jīng)膠質(zhì)瘤[11]和乳腺癌[12]中下調(diào)表達，發(fā)揮腫瘤抑制作用。盡管如此，胰腺癌中miR-526b表達水平及功能尚未見報道。本研究探討miR-526b在胰腺癌中的表達，并探討其作用。

1 材料與方法

1.1 組織樣本收集

收集2013年1月—2015年1月間在華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬武漢中心醫(yī)院肝膽胰外科收治的52例胰腺癌患者臨床病理標本。納入標準：⑴ 經(jīng)病理診斷為胰腺癌且行手術治療的患者；⑵ 患者具有完整的臨床及隨訪資料。排除標準：臨床或病理資料不全者?；颊咝g后立即將胰腺癌和癌旁組織凍存于-80 ℃冰箱。醫(yī)院倫理委員會同意并批準該研究實施。

1.2 細胞及主要試劑和儀器

人胰腺癌細胞系（BxPC-3、SW1990、PANC-1 和As PC-1）和胰腺導管上皮細胞系（HPDE6-C7）購自美國ATCC細胞庫。One Step Prime script miRNA cDNA合成試劑盒、細胞計數(shù)試劑盒-8（CCK8）、微孔板分光光度計、膜聯(lián)蛋白V-熒光素異硫氰酸酯（FITC）/碘化丙啶（PI）檢測試劑盒購于北京生物試劑有限公司。基質(zhì)膠Matrigel及Transwell小室購于美國Invitrogen公司、miR-526b過表達序列miR-526b模擬物及下調(diào)表達序列miR-526b抑制物和陰性對照序列購自北京生物試劑有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染和分組 將4 種胰腺癌細胞系和正常胰腺導管上皮細胞系置于有10% 胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)基，并在37 ℃和5%CO2下培養(yǎng)，取對數(shù)生長期且生長良好的細胞用于后續(xù)實驗和轉(zhuǎn)染。用lipofectamineTM2000 按說明書方案轉(zhuǎn)染：其中包括上調(diào)miR-526b 表達的miR-526b模擬物、下調(diào)miR-526b 表達的miR-526b 抑制物和陰性對照序列分別轉(zhuǎn)染AsPC-1 細胞，并分為miR-526b 模擬物組、miR-526b 抑制物組和空白對照組，通過qRT-PCR 檢測轉(zhuǎn)染效率。

1.3.2 qRT-PCR 按RNA 提取說明書步驟提取組織總RNA 后，測定總RNA 濃度，再依據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書行逆轉(zhuǎn)錄反應，生成cDNA，XRCC5 和miR-526b 引物序列由上海生工生物工程股份有限公司合成。XRCC5 上游引物：ACA TCG GCA TGA TGG CAG AA； 下游引物：TCA CAA AAG GCG GGA CCA C；miR-526b 上游引物：ACATCGGCATGATGGCAGAA；下游引物：TCA CAA AAG GCG GGA CCAC，GAPDH 上游引物：GTA ACC CGT TGA ACC CCA TT；下游引物為：CCA TCC AAT CGG TAG TAG CG，其中GAPDH為內(nèi)參，結(jié)果分析采用2-ΔΔCT法定量。

1.3.3 細胞侵襲試驗 將1×105/100 μL 細胞懸液接種到上室，按1:8 比例對50 mg/L 的Matrigel稀釋后，將Transwell 小室底部膜包被。DMEM 培養(yǎng)液500 μL 加于小室的下室，48 h 后取出小室，采用4% 多聚甲醛固定細胞，時間15 min，采用結(jié)晶紫染色，染色時長10 min，PBS 漂洗后200 倍視野下鏡檢并計數(shù)侵襲細胞數(shù)目。

1.3.4 細胞增殖和凋亡實驗 用細胞計數(shù)試劑盒-8（CCK-8）測定細胞增殖。將96 孔板用轉(zhuǎn)染的細胞（5×103細胞/ 孔）接種96 h，每24 h，每孔接受10 μL CCK-8 溶液孵育4 h。然后用微孔板分光光度計在每個時間點測量450 nm 處的吸光度。流式細胞術使用膜聯(lián)蛋白V- 熒光素異硫氰酸酯（FITC）/ 碘化丙啶（PI）檢測試劑盒評估凋亡程度。將總共約5×104AsPC-1 細胞接種到6 孔板中用于細胞凋亡測定，使用膜聯(lián)蛋白V-FITC 凋亡檢測試劑盒,按說明書進行染色程序，使用Cell-Quest 軟件分析細胞凋亡率。

1.3.5 熒光素酶報告基因測定 將含有預測miR-526b 結(jié)合位點的X- 射線修復交叉互補蛋白5（X-ray repair cross-complementing protein 5，XRCC5）突變型3'UTR 和XRCC5野生型3'UTR 插入pmiRGLO 載體（Promega，美國）中。將AsPC-1細胞接種于96 孔板中，用XRCC5 野生型3'UTR或XRCC5 突變體3'UTR 熒光素酶報告基因和陰性對照序列或miR-526b 模擬物與Lipofectamine 2000 共轉(zhuǎn)染。在轉(zhuǎn)染48 h 后，采用雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測熒光素酶活性并以海腎活性標準化。

1.3.6 Western blot 分析 使用RIPA 緩沖液提取轉(zhuǎn)染細胞的總蛋白質(zhì)。用10%-12%SDS-PAGE 凝膠分離蛋白質(zhì)并轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。隨后，用5% 無脂牛奶封閉2 h，并與包括XRCC5（Santa Cruz，美國）和GAPDH（Santa Cruz，美國）一抗孵育。在4 ℃下過夜。根據(jù)制造商的說明，用ECL 試劑盒（Beyotime，南京）檢測蛋白印跡。

1.4 統(tǒng)計學處理

用SPSS 19.0 統(tǒng)計學軟件對數(shù)據(jù)行統(tǒng)計分析。計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。胰腺癌組織中miR-526b表達水平與患者臨床病理參數(shù)采用卡方檢驗；Kaplan-Meier生存分析和對數(shù)秩檢驗比較miR-526b高低表達患者生存率差異；胰腺癌組織中miR-526b和XRCC5mRNA表達間關系采用Pearson相關性分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 miR-526b 在胰腺癌中表達水平下調(diào)

胰腺癌組織中miR-526b 表達量明顯低于癌旁組織[（3.2±1.3）vs.（8.5±2.6），P＜0.001]（圖1A）；4種胰腺癌細胞系（BxPC-3、SW1990、PANC-1和AsPC-1）中miR-526b表達水平均明顯低于人正常胰腺導管上皮細胞系HPDE6-C7（均P＜0.001）（圖1B）。

2.2 轉(zhuǎn)染效果檢測

與對陰性照組比較，AsPC-1細胞轉(zhuǎn)染miR-526b 模擬物后，miR-526b 表達水平明顯升高（P＜0.01），而轉(zhuǎn)染miR-526b抑制物后，miR-526b表達水平明顯降低（P＜0.01）（圖2）。

2.3 miR-526b 對胰腺癌細胞增殖的影響

CCK8結(jié)果顯示，miR-526b模擬物組增殖能力明顯低于陰性對照組（P＜0.01）；miR-526b抑制物組增殖能力明顯高于陰性對照組（P＜0.01）（圖3）。

圖1 qRT-PCR 檢測miR-526b 表達 Figure 1 Expressions of imiR-526b detected by qRT-PCR and normal pancreatic ductal epithelial cells

圖2 miR-526b 轉(zhuǎn)染效率測定Figure 2 Determination of the transfection efficiency of miR-526b

2.4 miR-526b 對胰腺癌細胞凋亡的影響

流式細胞檢測結(jié)果顯示，miR-526b模擬物組凋亡率明顯高于陰性對照組[（15.1±2.4）% vs.（8.2± 0.7）%，P＜0.05]；miR-526b抑制物組細胞凋亡率明顯低于陰性對照組[（4.6±0.4）% vs.（8.2± 0.7）%，P＜0.05]（圖4）。

圖4 miR-526b 表達對胰腺癌細胞凋亡的影響 Figure 4 Infl uence of miR-526b expression on apoptosis of pancreatic cancer cells

2.5 miR-526b 對胰腺癌細胞侵襲的影響

Trans well結(jié)果顯示（200 倍視野下），miR-526b模擬物組侵襲細胞 數(shù)明顯少于陰性對照組[（40±5）個vs.（70±12）個，P＜0.01]；miR-526b inhibitor 組侵襲細胞數(shù)明顯多于陰性對照組[（215±26）個vs.（70±12個），P＜0.01]（圖5）。

圖5 miR-526b 表達對胰腺癌細胞侵襲的影響 Figure 5 Infl uence of miR-526b expression on invasion of pancreatic cancer cells

2.6 miR-526b 上調(diào)抑制XRCC5 的表達

檢索miRanda數(shù)據(jù)庫（www.miroRNA.org）發(fā)現(xiàn)XRCC5是miR-526b潛在靶基因。miR-526b模擬物和XRCC5 野生型3'UTR（XRCC5-WT-3'UTR）共轉(zhuǎn)染，熒光素酶報告基因活性顯著性降低，miR-526b模擬物和突變型XRCC5的3'UTR（XRCC5-MUT的3'UTR）共轉(zhuǎn)染后，熒光素酶報告基因活性無改變。進一步研究顯示，當AsPC-1細胞轉(zhuǎn)染miR-526b模擬物后，細胞系中XRCC5的mRNA和蛋白質(zhì)表達均較空白對照組（轉(zhuǎn)染陰性對照組序列）明顯下調(diào)（均P＜0.05），當AsPC-1細胞轉(zhuǎn)染miR-526b抑制物后，XRCC5的mRNA和蛋白質(zhì)表達均較空白對照組明顯上調(diào)（均P＜0.05）（圖6）。

2.7 胰腺癌組織中miR-526b 和XRCC5 mRNA表達的相關性

Pearson相關顯示：胰腺癌組織中miR-526b 和XRCC5mRNA 表達水平呈顯著負相關（r=-0.456,P＜0.001）（圖7）。

圖6 miR-526b 靶基因分析Figure 6 Analysis of the target gene for miR-526b

圖7 胰腺癌組織中miR-526b 和XRCC5 mRNA 表達的相關性Figure 7 Correlation between the expression of miR-526b and XRCC5 mRNA in pancreatic cancer tissue

3 討 論

胰腺癌是常見的高致死性腫瘤[13]。胰腺癌診斷時常處于晚期，即胰腺癌切除術后5年生存率仍低于20%[14-15]。研究胰腺癌的發(fā)病機制對改善胰腺癌預后尤為重要[16]。

本研究發(fā)現(xiàn)在胰腺癌患者病理標本中，癌組織中miR-526b表達顯著低于癌旁組織；4種胰腺癌細胞系中miR-526b表達均較胰腺正常導管上皮細胞系下調(diào)，顯示miR-526b在胰腺癌組織和細胞系中表達下調(diào)，此結(jié)果與目前文獻報道存在一致性：文獻[17]報道在非小細胞肺癌患者中，無論病理類型是鱗狀細胞癌還是腺癌，手術切除病理標本中均可發(fā)現(xiàn)癌組織miR-526b表達水平顯著低于癌旁組織，同時在神經(jīng)膠質(zhì)瘤[11]、乳腺癌[12]和結(jié)腸癌[18]患者中，癌組織中miR-526b表達水平也低于癌旁組織，綜合上述結(jié)果提示在多種不同類型的癌癥中均可發(fā)現(xiàn)癌組織中miR-526b表達水平受到抑制。

miR-526b在其他腫瘤中的表達及與預后的關系已有相關報道。在肝細胞癌中，癌組織中miR-526b低表達與低分化、TNM分期、轉(zhuǎn)移和門靜脈癌栓相關，且是影響預后的獨立危險因素[19]；在宮頸癌體外細胞實驗中，miR-526b 低表達可促進宮頸癌細胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程而發(fā)揮促癌作用[20]。在體外胰腺癌細胞系AsPC-1中，通過上調(diào)miR-526b表達后，發(fā)現(xiàn)AsPC-1細胞增殖和侵襲能力受到明顯抑制，細胞凋亡比率顯著增加；而下調(diào)miR-526b表達后發(fā)現(xiàn)AsPC-1細胞增殖和侵襲能力顯著增強，細胞凋亡比率顯著下降，提示miR-526b表達可影響胰腺癌細胞增殖、侵襲和凋亡。

XRCC5是參與DNA雙鏈斷裂（DNA doublestrand breaks，DSBs）修復的主要基因，可編碼Ku80 蛋白[21]。在細胞生命活動中，錯誤修復的DSB是主要的DNA損傷，可導致染色體畸變、突變或癌變，是各種癌癥發(fā)生的重要機制之一[22]。臨床研究已經(jīng)證實XRCC5是重要的癌基因之一，XRCC5高表達導致Ku80蛋白過表達，Ku80蛋白高表達與膀胱癌[23]、宮頸癌[24]和結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移[25]進展呈正相關，XRCC5高表達是上述癌癥發(fā)生和進展的重要因素。在結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移的患者中，癌組織中XRCC5高表達與淋巴結(jié)和肝轉(zhuǎn)移顯著相關[25]；在乳腺癌中研究者也發(fā)現(xiàn)XRCC5高表達是預測患者接受放射治療后不良預后的獨立危險因素[26]。通過生物信息檢索和雙熒光素酶報告基因結(jié)果顯示XRCC5是miR-526b潛在靶基因，同時文獻[17]報道在非小細胞肺癌中也證實miR-526b靶基因為XRCC5，且miR-526b低表達直接靶向調(diào)節(jié)XRCC5基因高表達而促進NSCLC進展。

本研究結(jié)果顯示，在胰腺癌細胞系（AsPC-1）中，miR-526b表達可調(diào)節(jié)XRCC5基因表達；且在胰腺癌患者病理標本中發(fā)現(xiàn)胰腺癌組織中miR-526b表達與XRCC5 mRNA表達呈負相關。在非小細胞肺癌細胞系A5490中，miR-526b上調(diào)可導致XRCC5基因表達水平降低、p53基因表達水平增加且促進A549細胞凋亡[17]；同時在肺腺癌中miR-526b 可能調(diào)節(jié)XRCC5基因表達而影響肺腺癌患者化療敏感性[27]；結(jié)合本研究結(jié)果，提示miR-526b可能通過調(diào)節(jié)XRCC5基因表達而影響胰腺癌細胞增殖、侵襲和凋亡。

本研究存在如下不足：本研究并未在動物實驗中探討miR-526b和XRCC5表達變化對腫瘤進展的影響，值得進一步探究。

總之，胰腺癌患者miR-526b 表達下調(diào)，miR-526b 下調(diào)表達促進癌細胞增殖、侵襲并抑制凋亡，機制可能與上調(diào)XRCC5 表達有關。