朱 璟,王崢鑒，張佐然,李金婷,梁雅靜,金 一,何曉青

(北京林業(yè)大學(xué) 生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京 100083)

進(jìn)化理論一般認(rèn)為，相同的基因型在不同環(huán)境條件下表現(xiàn)出不同表型的現(xiàn)象稱(chēng)為表型可塑性[1]。生物有機(jī)體能夠通過(guò)表型可塑性這一機(jī)制，產(chǎn)生選擇性的表型變化或反應(yīng)，以應(yīng)對(duì)環(huán)境的改變。生物體的這種表型反應(yīng)往往具有明顯的選擇優(yōu)勢(shì)，能夠在物理性狀或生理反應(yīng)上產(chǎn)生一定的變化，以促進(jìn)生物體的發(fā)展。表型可塑性在生物界普遍存在，在植物與動(dòng)物領(lǐng)域均有報(bào)道[2-3]，但在微生物領(lǐng)域尤其是細(xì)菌表型可塑性方面的研究相對(duì)較少[4-5]，利用分子標(biāo)記技術(shù)來(lái)研究微生物表型可塑性的方法鮮有報(bào)道。金黃色葡萄球菌廣泛存在于自然界，是人類(lèi)的一種重要的病原菌，隸屬于葡萄球菌屬，是革蘭陽(yáng)性菌的代表[6]。通常金黃色葡萄球菌對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的要求不高，在普通培養(yǎng)基上生長(zhǎng)情況良好，但研究表明其與大腸埃希菌混合培養(yǎng)時(shí)，表現(xiàn)出明顯的競(jìng)爭(zhēng)劣勢(shì)。本研究在金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)環(huán)境中引入大腸埃希菌與其混合培養(yǎng)，并與單獨(dú)培養(yǎng)的金黃色葡萄球菌對(duì)比，欲探究?jī)煞N培養(yǎng)條件下金黃色葡萄球菌的表型變化規(guī)律。全基因組關(guān)聯(lián)分析法(Genome-wide association study，GWAS)是Risch等[7]在1996年提出的在全基因水平上對(duì)復(fù)雜的表型形狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析的方法，它以連鎖不平衡(Linkage disequilibrium，LD)為基礎(chǔ)[8-9]，通常以上萬(wàn)個(gè)單核苷酸多態(tài)性(Single nucleotide polymorphism，SNP)作為標(biāo)記，篩選出其中與表型相關(guān)聯(lián)的標(biāo)記，并分析其遺傳效應(yīng)[10]。雙變量GWAS分析是GWAS分析的一種，其能夠同時(shí)考慮兩種表型，在統(tǒng)計(jì)效力和參數(shù)估計(jì)精確性方面優(yōu)于單變量分析[11]。相比于單變量GWAS，通過(guò)對(duì)雙變量GWAS合并培養(yǎng)時(shí)間及培養(yǎng)環(huán)境的關(guān)聯(lián)信息進(jìn)行分析，可以獲得更高的統(tǒng)計(jì)效率。因此，雙變量GWAS能夠檢測(cè)出單變量GWAS無(wú)法發(fā)現(xiàn)的少數(shù)顯著SNP位點(diǎn)。在效率方面，雙變量GWAS的計(jì)算量?jī)H為單變量GWAS的一半，從而減少了SNP的檢測(cè)周期，提高了檢測(cè)效率。雙變量GWAS法能夠快速有效地識(shí)別調(diào)節(jié)表型變異的遺傳因素，便于鑒定出致使某種表型變化的遺傳基礎(chǔ)[12]，且適用于細(xì)菌等微生物[13]。金黃色葡萄球菌是全基因組研究合適的模式生物，以金黃色葡萄球菌表型可塑性為研究對(duì)象的GWAS分析在微生物領(lǐng)域具有代表性。本研究以45株金黃色葡萄球菌為研究對(duì)象，設(shè)置兩種不同的培養(yǎng)環(huán)境，觀察并記錄了連續(xù)培養(yǎng)過(guò)程中金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)量的變化，采用雙變量GWAS法，結(jié)合金黃色葡萄球菌在兩種不同培養(yǎng)環(huán)境下的生長(zhǎng)差異及基因組測(cè)序結(jié)果，得到顯著SNP位點(diǎn)。同時(shí)找到與金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)變化顯著相關(guān)的SNP，分析顯著SNP與金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)的關(guān)系及對(duì)應(yīng)基因mRNA相對(duì)表達(dá)量，進(jìn)一步分析其表型可塑性的表現(xiàn)形式及規(guī)律，為表型可塑性在微觀水平的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來(lái)源 根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有條件，選擇45株金黃色葡萄球菌及1株大腸埃希菌作為實(shí)驗(yàn)的研究對(duì)象。40株金黃色葡萄球菌菌株購(gòu)自中國(guó)普通微生物菌種保藏中心(CGMCC)、中國(guó)林業(yè)微生物菌種保藏管理中心(CFCC)、中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏中心(CICC)、中國(guó)醫(yī)學(xué)微生物菌種保藏管理中心(CMCC)、中國(guó)農(nóng)業(yè)菌種保藏中心(ACCC)、中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)、中國(guó)藥學(xué)微生物菌種保藏管理中心(CPCC))，另外5株由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院贈(zèng)與。1株大腸埃希菌購(gòu)自中國(guó)普通微生物菌種保藏中心(CGMCC)。所有菌株保存于-80 ℃。

1.1.2 培養(yǎng)基及試劑 腦心浸出液肉湯(Brain Heart Infusion,BHI)培養(yǎng)基(OXIOD，英國(guó))；胰蛋白酶大豆瓊脂培養(yǎng)基(OXIOD，英國(guó))；細(xì)菌基因組提取試劑盒(天根，中國(guó))；細(xì)菌總RNA提取試劑盒(天根，中國(guó))；FastQuant cDNA第一鏈合成試劑盒(去基因組)(天根，中國(guó))；SuperReal 熒光定量預(yù)混試劑增強(qiáng)版(天根，中國(guó))；溶菌酶(Amresco，美國(guó))；溶葡萄球菌酶(Sigma，美國(guó))。

1.1.3 儀器與設(shè)備 超凈工作臺(tái)(ESCO Class II，新加坡)；電子天平(METTER，瑞士)；H2O3程控金屬浴(Gingko Bio，中國(guó))；離心機(jī)(Beckman Coulter，美國(guó))；HYG-A全溫?fù)u瓶柜(培英，中國(guó))；冰箱(SANYO，日本)；高壓滅菌鍋(SANYO，日本)；移液槍(Eppendorf，德國(guó))；瓶口分液器(SOCOREX，瑞士)；Thermo Scientific NanoDrop 2000(Thermo Fisher Scientific，美國(guó))；Mx3000P 熒光定量PCR 儀(Stratagene，美國(guó))；流式細(xì)胞儀(BD FACS Calibur，美國(guó))等。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌的活化和連續(xù)培養(yǎng) 設(shè)定金黃色葡萄球菌單獨(dú)培養(yǎng)及金黃色葡萄球菌與大腸埃希菌混合培養(yǎng)兩種培養(yǎng)模式，分別用45株金黃色葡萄球菌與1株大腸埃希菌進(jìn)行配對(duì)。45株金黃色葡萄球菌編號(hào)為J1～J45，1株大腸埃希菌編號(hào)為D1。將所有菌株從-80 ℃冰箱中取出并將各菌株接種于稀釋2倍的BHI培養(yǎng)基并置于30 ℃、130 r/min搖床中過(guò)夜培養(yǎng)，以活化菌株。利用流式細(xì)胞儀確定從各瓶中取出的菌液量，轉(zhuǎn)接到新的稀釋2倍的BHI培養(yǎng)基中，將起始濃度定為5×103cells/mL，置于30 ℃、130 r/min搖床中培養(yǎng)。24 h后每個(gè)菌種培養(yǎng)液取出兩管1 mL菌液凍存(一管作為重復(fù))，用于后續(xù)基因組的提取和qPCR實(shí)驗(yàn)，并將其定位為第一個(gè)細(xì)菌拷貝數(shù)測(cè)量點(diǎn)。同時(shí)，迅速?gòu)呐囵B(yǎng)液中轉(zhuǎn)接1 mL菌液至新的稀釋2倍的BHI培養(yǎng)基中，以保證兩種細(xì)菌享有足夠的營(yíng)養(yǎng)物。24 h后繼續(xù)按照上述步驟轉(zhuǎn)接，轉(zhuǎn)接至第12天時(shí)兩種細(xì)菌的拷貝數(shù)基本保持穩(wěn)定，故轉(zhuǎn)接至第12個(gè)測(cè)量點(diǎn)時(shí)結(jié)束培養(yǎng)。

1.2.2 細(xì)菌全基因組提取 將12次轉(zhuǎn)接保存的菌液各取出1 mL，使用細(xì)菌基因組提取試劑盒并在破壁步驟中結(jié)合使用溶菌酶和溶葡萄球菌素，分別提取1 mL菌液中的基因組，最后將提取得到的基因組溶解在200 μL洗脫緩沖液TE中。

1.2.3 qPCR測(cè)定細(xì)菌的生長(zhǎng)量(絕對(duì)定量) 熒光定量PCR能準(zhǔn)確定量出樣本DNA的拷貝數(shù)，本研究使用SuperReal 熒光定量預(yù)混試劑增強(qiáng)版(TIANGEN，北京)在Mx3005P 熒光定量PCR儀內(nèi)完成熒光定量PCR。絕對(duì)定量所需的標(biāo)品由質(zhì)粒pBM19S-nuc耐熱核酸酶基因(nuc)與pBM19-B Simple 載體構(gòu)建而成，質(zhì)粒均由實(shí)驗(yàn)室提供。根據(jù)靶基因的選擇原則，以耐熱核酸酶基因nuc)為目的基因，設(shè)計(jì)目的片段為226 bp的引物，引物的序列如下：nuc-F(AGATAACGGCGTAAATAGA)，nuc-R(ACTTGCTTCAGGACCATA)。從提取的基因組溶液中取出2 μL構(gòu)建反應(yīng)體系，反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性30 s，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共40 個(gè)循環(huán)，退火延伸時(shí)檢測(cè)、收集熒光信號(hào)。每個(gè)樣品的拷貝數(shù)由軟件Stratagene MxPro計(jì)算得出，再換算成1 mL基因組樣品中的拷貝數(shù)，作為金黃色葡萄球菌在該生長(zhǎng)點(diǎn)的生長(zhǎng)量數(shù)據(jù)。

1.2.4 雙變量全基因組關(guān)聯(lián)分析 將提取所得的基因組樣品進(jìn)行全基因組測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與實(shí)時(shí)熒光定量PCR得到的生長(zhǎng)量數(shù)據(jù)結(jié)合比對(duì)，使用GWAS法對(duì)45株金黃色葡萄球菌和1株大腸埃希菌混合培養(yǎng)的12個(gè)取樣點(diǎn)的基因組與表型多態(tài)性之間進(jìn)行了雙變量連鎖分析，篩選了與生長(zhǎng)量變化顯著相關(guān)的全基因組SNP位點(diǎn)，并繪制曼哈頓圖(Manhattanplots)。

1.2.5 檢測(cè)scdA基因的相對(duì)表達(dá)量 取出1 mL連續(xù)培養(yǎng)保存的菌液，用細(xì)菌總RNA提取試劑盒提取RNA，立即使用FastQuant cDNA第一鏈合成試劑盒(去基因組)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。根據(jù)T檢驗(yàn)篩選結(jié)果，選擇其中最具代表性的SNP進(jìn)行功能驗(yàn)證。在GenBank上查找該SNP所位于的基因，并以該基因序列為模板設(shè)計(jì)引物，使用SuperReal 熒光定量預(yù)混試劑增強(qiáng)版(TIANGEN，中國(guó))進(jìn)行qPCR，其中目的片段的引物序列：F1(CAGACCACATTGCAACGGGAGAA)、R1(CGTGATTCTCTAAATGTACGTGTTC)，內(nèi)參為16S rRNA，其擴(kuò)增的引物序列：16S-F(TGTCGTGAGATGTTGGG)、16S-R(CGATTCCAGCTCATGT)。熒光定量PCR得到的CT值用2^-△△T相對(duì)定量法換算，得到該基因的相對(duì)表達(dá)量，作為對(duì)應(yīng)的表型數(shù)據(jù)。

1.2.6 相對(duì)表達(dá)量差異性檢測(cè) 檢驗(yàn)法能夠檢測(cè)兩組獨(dú)立樣本的差異性，利用T檢驗(yàn)法分析金黃色葡萄球菌在單獨(dú)培養(yǎng)和混合培養(yǎng)下scdA的表達(dá)量差異及SNP251050兩種核苷酸下scdA的表達(dá)量差異。P<0.05 為顯著，P<0.01為極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 兩種培養(yǎng)方式的生長(zhǎng)量結(jié)果

圖1展示了所有取樣點(diǎn)金黃色葡萄球菌1號(hào)菌株單獨(dú)培養(yǎng)(mono-S)及與大腸埃希菌混合培養(yǎng)(co-S)的拷貝數(shù)結(jié)果，混合培養(yǎng)中的大腸埃希菌(co-E)作為參考。結(jié)果顯示在營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)充足的條件下，單獨(dú)培養(yǎng)的金黃色葡萄球菌拷貝數(shù)明顯高于混合培養(yǎng)中的拷貝數(shù)，達(dá)2～4個(gè)數(shù)量級(jí)，說(shuō)明金黃色葡萄球菌在混合培養(yǎng)中的生長(zhǎng)受到了大腸埃希菌的抑制。本研究中的45株金黃色葡萄球菌均表現(xiàn)出以上生長(zhǎng)規(guī)律。

圖1 qPCR法測(cè)量金黃色葡萄球菌單獨(dú)培養(yǎng)及混合培養(yǎng)生長(zhǎng)量結(jié)果Fig.1 Growth data of S. aureus in mono-culture and co-culture by qPCR

2.2 GWAS檢測(cè)顯著SNP位點(diǎn)結(jié)果

雙變量GWAS法一共檢測(cè)出了415個(gè)顯著單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)，隨著培養(yǎng)的進(jìn)行，各取樣點(diǎn)的最大-log10(P)值整體呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。其中取樣點(diǎn)1未檢測(cè)出顯著SNP位點(diǎn)，取樣點(diǎn)10檢出最多，達(dá)61個(gè)。取樣點(diǎn)4、6、7、8、9、10、11、12的顯著SNP數(shù)量均超過(guò)了30個(gè)，P值最大的SNP(-log10(P)= 11)出現(xiàn)在取樣點(diǎn)12。對(duì)檢出的SNP，選擇重復(fù)性高的進(jìn)行基因功能注釋。根據(jù)注釋結(jié)果，選取導(dǎo)致非同義突變并表達(dá)已報(bào)道對(duì)應(yīng)蛋白功能的SNP展開(kāi)研究，分別是251050、797150、1043869、212837、73965、870315、73916、785111。這些SNP的最大P值點(diǎn)分別在圖2曼哈頓圖中標(biāo)出(紅線以上表示顯著，縱坐標(biāo)表示每個(gè)取樣點(diǎn)SNP的-log10(P)值)，具體數(shù)值參見(jiàn)表1。

表1 8個(gè)SNP位點(diǎn)對(duì)應(yīng)基因和蛋白質(zhì)功能表Table 1 Summary of candidate genes and proteins of the 8 selected SNPs

注：SNP對(duì)應(yīng)基因的ID從GWAS的分析結(jié)果中查詢(xún)獲得，基因的名稱(chēng)從NCBI官網(wǎng)上查詢(xún)獲得

2.3 非同義突變顯著SNP的基因類(lèi)型與蛋白功能匯總

8個(gè)金黃色葡萄球菌顯著SNP均導(dǎo)致非同義突變，對(duì)應(yīng)基因所表達(dá)的蛋白均有文獻(xiàn)報(bào)道(表1)。其中SNP251050在第8個(gè)取樣點(diǎn)中的-log10(P)值達(dá)較高水平的7.43，其在單獨(dú)培養(yǎng)(P=6.16×10-3)和混合培養(yǎng)(P=1.49×10-5)兩種培養(yǎng)環(huán)境下的T檢驗(yàn)差異檢測(cè)結(jié)果都極顯著。并且SNP251050對(duì)應(yīng)基因表達(dá)的scdA蛋白是一種肽聚糖交聯(lián)的細(xì)胞壁生物合成蛋白質(zhì)，參與細(xì)胞壁合成、周轉(zhuǎn)等生命活動(dòng)，與金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)量關(guān)系緊密。故將SNP251050所位于的基因scdA作為驗(yàn)證金黃色葡萄球菌表型可塑性的擴(kuò)增對(duì)象，并測(cè)定mRNA相對(duì)表達(dá)量。

圖2 GWAS檢測(cè)顯著SNP位點(diǎn)曼哈頓圖Fig.2 Manhattan plots of the significant SNPs by the genome-wide association analysis

2.4 兩種培養(yǎng)模式下scdA基因相對(duì)表達(dá)量的對(duì)比

SNP位點(diǎn)具有二態(tài)性，故將45株菌按照SNP251050的A型或G型結(jié)果進(jìn)行分類(lèi)比較，兩種類(lèi)型下單獨(dú)培養(yǎng)和混合培養(yǎng)第8個(gè)轉(zhuǎn)接點(diǎn)的相對(duì)表達(dá)量結(jié)果如圖3所示：黑色“+”為對(duì)應(yīng)培養(yǎng)模式下的相對(duì)表達(dá)量平均值。T檢驗(yàn)結(jié)果表明，SNP251050表現(xiàn)為G型時(shí)，對(duì)應(yīng)基因在混合培養(yǎng)環(huán)境中相對(duì)表達(dá)量顯著高于在單獨(dú)培養(yǎng)環(huán)境中的相對(duì)表達(dá)量(P=3.15×10-11)，同樣表現(xiàn)為A型時(shí)，對(duì)應(yīng)基因在混合培養(yǎng)環(huán)境中相對(duì)表達(dá)量顯著高于在單獨(dú)培養(yǎng)環(huán)境中的相對(duì)表達(dá)量(P=4.55×10-8)。

圖3 兩種培養(yǎng)模式下scdA基因相對(duì)表達(dá)量結(jié)果Fig.3 Relative expression of gene scdA in two culture modes

3 討 論

傳統(tǒng)的進(jìn)化學(xué)說(shuō)中，生物體適應(yīng)環(huán)境的基本單位是基因型，而表型可塑性的研究帶來(lái)了不同的觀點(diǎn)：表型可塑性是指某一特定的基因型處于不同的環(huán)境條件時(shí)能夠表現(xiàn)出不同的表現(xiàn)型，生物體利用其可塑性來(lái)響應(yīng)并適應(yīng)環(huán)境的變化。生物體的表型可塑性不單指形態(tài)學(xué)上的可塑性，更多表現(xiàn)為生理行為、活動(dòng)的可塑性，其反映了生物與環(huán)境之間的關(guān)系。

本研究以45株金黃色葡萄球菌為研究對(duì)象，設(shè)置兩種不同的培養(yǎng)環(huán)境，利用與大腸埃希菌混合培養(yǎng)的方式給予金黃色葡萄球菌一定的競(jìng)爭(zhēng)壓力，用qPCR法測(cè)定不同培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)的金黃色葡萄球菌在兩種生長(zhǎng)環(huán)境下的生長(zhǎng)量拷貝數(shù)。又結(jié)合雙變量GWAS的方法，得到了415個(gè)與生長(zhǎng)量表型顯著相關(guān)的SNP位點(diǎn)。這些顯著SNP中，大部分表達(dá)的是假定蛋白，假定蛋白是一類(lèi)無(wú)實(shí)際蛋白信息的開(kāi)放閱讀框[20]，因此在本研究中不予深究。此外，編碼區(qū)的SNP存在同義和非同義兩種多態(tài)類(lèi)型，SNP的同義突變并不影響蛋白質(zhì)序列，而SNP的非同義突變則會(huì)改變蛋白質(zhì)的氨基酸序列[21]。本研究在剔除相關(guān)基因表達(dá)假定蛋白的SNP以及同義單核苷酸多態(tài)性SNP后，得到了8個(gè)與生長(zhǎng)量改變顯著相關(guān)的SNP，測(cè)定其中最具代表性的SNP251050相關(guān)基因mRNA表達(dá)量變化，研究了金黃色葡萄球菌生理水平的表型可塑性，展現(xiàn)了細(xì)菌在環(huán)境改變過(guò)程中產(chǎn)生的表型可塑性效應(yīng)[22]。

SNP251050對(duì)應(yīng)的基因表達(dá)細(xì)胞壁生物合成蛋白scdA，該蛋白參與細(xì)胞壁生物合成、細(xì)胞分裂和細(xì)胞壁周轉(zhuǎn)等生命活動(dòng)[23]。金黃色葡萄球菌能夠合成順烏頭酸酶(Aconitase)，順烏頭酸酶的活性受到scdA的影響，在不含scdA或scdA表達(dá)量較低的金黃色葡萄球菌中，順烏頭酸酶的活性顯著降低[24]。研究表明，順烏頭酸酶的減少會(huì)使TCA循環(huán)活性降低，而TCA循環(huán)又是為生物體提供能量，降低潛力和生物合成中間體的重要中樞代謝途徑[25]。因此可以推測(cè)，scdA蛋白的表達(dá)與否、表達(dá)的量多量少，影響了順烏頭酸酶的TCA循環(huán)過(guò)程，導(dǎo)致金黃色葡萄球菌機(jī)體代謝產(chǎn)生異常，因而影響了金黃色葡萄球菌在不同環(huán)境中的生長(zhǎng)量。

兩種培養(yǎng)模式下scdA基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量結(jié)果對(duì)比表明，無(wú)論SNP251050的核苷酸類(lèi)型是G或A，其單獨(dú)培養(yǎng)與混合培養(yǎng)下的相對(duì)表達(dá)量差異都極其顯著，且兩種培養(yǎng)模式下不同基因型的檢測(cè)結(jié)果不顯著。因此對(duì)于該顯著SNP對(duì)應(yīng)的基因及表達(dá)的蛋白，表型可塑性引起的適應(yīng)變化要明顯強(qiáng)于基因型不同引起的變化。另外，在G和A兩種情況中，混合培養(yǎng)下的scdA表達(dá)量都要明顯高于單獨(dú)培養(yǎng)下的表達(dá)量。生長(zhǎng)量統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明金黃色葡萄球菌在混合培養(yǎng)下拷貝數(shù)顯著降低，在混合培養(yǎng)生長(zhǎng)中處于劣勢(shì)，而mRNA相對(duì)表達(dá)量結(jié)果顯示金黃色葡萄球菌菌株為保證自身存活，產(chǎn)生了一些生理反應(yīng)，促使scdA基因的表達(dá)水平顯著上升。scdA表達(dá)量的增加及其他相關(guān)基因表達(dá)量的增加，幫助金黃色葡萄球菌產(chǎn)生了更多相關(guān)功能蛋白，并得以維持其在培養(yǎng)體系中的穩(wěn)定性。

在近30年時(shí)間里，表型可塑性的研究將生命體表型適應(yīng)的生態(tài)學(xué)和生理學(xué)研究推進(jìn)到了新的水平，并且得到了大量的實(shí)質(zhì)性研究結(jié)果。本研究的表型可塑性實(shí)驗(yàn)比較了金黃色葡萄球菌微觀生理層次不同表型的轉(zhuǎn)化及其所對(duì)應(yīng)不同特征的環(huán)境條件的響應(yīng)，進(jìn)一步闡明了表型可塑性理論的合理性，同時(shí)為微生物領(lǐng)域表型可塑性的研究提供了參考依據(jù)。