邱 悅，趙永紅，曹雅明*

(1.中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 心血管超聲科，遼寧 沈陽 110001；2.中國醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 免疫學(xué)教研室，遼寧 沈陽 110122)

瘧疾是熱帶和亞熱帶地區(qū)最常見的寄生原蟲感染性疾病。多項研究表明，宿主抗瘧保護(hù)性免疫應(yīng)答的水平和強(qiáng)度與瘧疾預(yù)后顯著相關(guān)，因此免疫細(xì)胞的數(shù)量和活化強(qiáng)度在其中發(fā)揮重要作用[1-2]。樹突狀細(xì)胞(Dendritic Cell，DC)是唯一能夠活化初始T細(xì)胞的專職抗原提呈細(xì)胞，也是連接固有和適應(yīng)性免疫應(yīng)答的橋梁[3-4]。瘧原蟲感染宿主后，DC依賴TLRs(Toll-like receptors)、MyD88和NF-κB的系列信號傳導(dǎo)過程而活化[5]。其中，TLRs受體在免疫應(yīng)答中可調(diào)控細(xì)胞因子、趨化因子、防御素等效應(yīng)分子產(chǎn)生、調(diào)節(jié)抗原提呈細(xì)胞的抗原提呈能力，進(jìn)而調(diào)控獲得性免疫應(yīng)答的強(qiáng)度和時程。當(dāng)瘧原蟲侵襲宿主時，TLRs向機(jī)體傳達(dá)病原體入侵信息，激活免疫系統(tǒng)。在瘧疾感染過程中，TLR7識別瘧原蟲RNA[6]，繼而通過MyD88傳遞活化信號，激活轉(zhuǎn)錄因子NF-κB，促進(jìn)多種促炎性細(xì)胞分化，激活體液和/或細(xì)胞免疫應(yīng)答[7]。同時，TLR7的激活可活化DCs，上調(diào)其表面共刺激分子和MHC-II類分子的表達(dá)水平，并抑制DC凋亡[8]。目前已明確證實，DC實現(xiàn)對T細(xì)胞的激活效應(yīng)主要取決于TLRs的存在[3]。同時，DC是決定輔助性T細(xì)胞(T helper cells，Th)應(yīng)答形式、強(qiáng)度和效應(yīng)的關(guān)鍵因素[4]。Th1、Th2、Tfh細(xì)胞能夠有效遏制瘧原蟲感染,它們分別在瘧疾感染不同階段發(fā)揮效應(yīng)。其中，感染早期建立的Th1型細(xì)胞免疫應(yīng)答可顯著提高吞噬細(xì)胞的吞噬能力和殺傷活性[9]，控制瘧原蟲的指數(shù)性增殖，隨后活化的Tfh和Th2細(xì)胞可以輔助B細(xì)胞活化、成熟增殖并產(chǎn)生特異性抗體，并有效清除瘧原蟲感染[10]，Treg在平衡Th1/Th2免疫應(yīng)答過程中發(fā)揮重要作用[11]。本研究采用約氏瘧原蟲(Plasmodiumyoelii17XNL，P.y17XNL)感染BALB/c小鼠，觀察TLR7激動劑對瘧疾感染早期DCs亞群，CD4+T細(xì)胞及其亞群的活化狀況、應(yīng)答模式，明確TLR7介導(dǎo)DC調(diào)控免疫的作用機(jī)制，以期為研制開發(fā)有效的瘧疾疫苗提供新的靶點和思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物和鼠瘧原蟲株來源 雌性6～8周齡SPF級BALB/c小鼠，購自中國醫(yī)科大學(xué)實驗動物部；非致死型約氏瘧原蟲P.y17XNL，為本實驗室長期傳代保存。

1.1.2 主要試劑 FcγⅢ/Ⅱ封閉抗體(clone 2.4G2);FITC-anti-CD11c(clone HL3)；PE-anti-CD11b(clone H1.2F3)；PE-anti-CD86(clone GL1)；PerCP-anti-CD45R/B220(clone RA3-6B2)；FITC-anti-CD4(clone GK1.5)；PE-anti-TLR7(Clone A94B10)；APC-anti-MHC II(clone M5/114.15.2)；APC-anti-T-bet(clone 39D)；FITC-anti-IFN-γ(clone XMG1.2)；PE-anti-GATA3(clone L50-823)；PE-anti-CXCR5(Clone 51505)；PE-anti-CD25(clone 7D4)；PerCP-CyTM5.5 anti-Foxp3(clone 17-5773-80)。以上試劑均購自BD Biosciences公司；ELISA試劑盒購自R&D；TLR7激動劑Loxoribine(Sigma，USA)；PMA、Ionomycin和BFA購自Sigma公司。

1.1.3 主要儀器與設(shè)備 iMark microplate Reader 酶標(biāo)儀(BIO-RAD，美國)；FACSCaliburTM流式細(xì)胞儀(BD Biosciences，美國)。

1.2 方法

1.2.1 實驗?zāi)Ｐ徒⒓疤幚?雌性6～8周齡BALB/c小鼠隨機(jī)分為2組：P.y17XNL正常感染組(Control)和TLR7激動劑處理組(Loxoribine)。兩組小鼠均通過腹腔注射1×106個非致死型約氏瘧原蟲P.y17XNL感染的紅細(xì)胞，構(gòu)建鼠瘧模型。Loxoribine 組P.y17XNL感染前24 h，腹腔注射TLR7激動劑Loxoribine(1 mg/(0.1 mL·只))，對照組小鼠注射同等劑量的PBS。

1.2.2 觀察小鼠的感染率 感染后不同時間點，尾靜脈采血并制備單層血細(xì)胞薄片。在感染后不同時間點小鼠尾靜脈采血，吉姆薩染色計數(shù)感染率。

1.2.3 脾細(xì)胞流式細(xì)胞術(shù) 參照文獻(xiàn)的檢測方法[12]，分別于感染后第5天和第10天取小鼠脾臟，常規(guī)方法制備脾細(xì)胞懸液，取1×106裂解紅細(xì)胞后的脾細(xì)胞加入流式管中，采用100 μL PBS重懸細(xì)胞。分別采用以下熒光抗體標(biāo)記不同免疫細(xì)胞亞群：DC亞群(CD11c+CD11b+/CD45R/B220+)、TLR7及活化的DC(CD11c+MHC-II+TLR7+)、Tfh/Treg(CD4+CXCR5+/CD4+CD25+FoxP3+)。為檢測Th1和Th2細(xì)胞，取1×106脾細(xì)胞懸于400 μL RPMI-1640中。加入刺激物PMA(50 ng/mL)、Ionomycin(1 μg/mL)和BFA(10 μg/mL)，并在37 ℃、5% CO2條件下刺激培養(yǎng)4.5 h后，采用PBS洗滌細(xì)胞2次，使用單克隆抗體標(biāo)記Th1(CD4+T-bet+IFN-γ+)和Th2(CD4+GATA-3+IL-4+)。采用FACSCaliburTM細(xì)胞分析儀(BD Biosciences)進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測，F(xiàn)lowJo軟件分析檢測結(jié)果。

1.2.4 ELISA檢測 ELISA檢測脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中IFN-γ、IL-4、IL-21和IL-10的細(xì)胞因子水平，酶標(biāo)儀測定450 nm處OD值。實驗操作按照試劑盒說明書進(jìn)行，結(jié)果以試劑盒提供的標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，應(yīng)用SoftMax Pro 4.3.1Ls軟件分析，計算細(xì)胞因子含量(pg/mL)。

1.2.5 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用GraphPad Prism 6.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，標(biāo)本采用獨立樣本t檢驗比較分析組內(nèi)和組間均值差異。P<0.05為顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 TLR7激動劑對瘧原蟲血癥水平的影響

如圖1所示，正常P.y17XNL感染組(Control)和TLR7激動劑(Loxoribine)組小鼠均于感染后第3天在外周血中出現(xiàn)感染的紅細(xì)胞，隨后持續(xù)升高，對照組小鼠的原蟲血癥于感染后第13天達(dá)到峰值(16.8%)，然后開始逐步下降，于第21天左右自然自愈；Loxoribine組于感染后第9天達(dá)到峰值(7%)，之后開始逐漸下降，于感染后第17天左右自然自愈。結(jié)果表明，外源性給予Loxoribine可顯著降低小鼠蟲血癥水平。

圖1 TLR7激動劑處理對P.y 17XNL感染BALB/c小鼠的原蟲血癥水平的影響Fig.1 The effect of TLR7 agonist treatment on the parasitemia of BALB/c mice infected with P.y 17XNL * P<0.05，** P<0.01

2.2 TLR7激動劑對感染小鼠DC亞群及其活化的影響

在P.y17XNL感染后第0、5和10天，通過FACS檢測了兩組小鼠脾細(xì)胞中DC亞群及相關(guān)功能分子的表達(dá)情況。結(jié)果表明，感染后第5、10天，Control組與Loxoribine處理組TLR7+DC(CD11c+TLR7+)的百分比較感染后第0天明顯增加(P<0.05)(圖2A)。P.y17XNL感染后第5天，與Control組相比，Loxoribine處理組總DC(CD11c+DCs+)、髓樣DC(mDC，CD11c+CD11b+)漿樣DC(pDC，CD11c+CD45R/B220+)的表達(dá)量均顯著高于感染后第0天(P<0.05，圖2B-D)。而感染后第10天，各組細(xì)胞亞群數(shù)目雖有所增高但無統(tǒng)計學(xué)差異(圖2B-D)。P.y17XNL感染后第5天和第10天，對照組與實驗組DC細(xì)胞亞群MHC-II+DC(CD11c+MHCII+)和CD86+DC(CD11c+CD86+)的表達(dá)量均高于感染后第0天，具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.01或P<0.05)，但實驗組與對照組之間無明顯差異(圖2E和2F)。結(jié)果提示，Loxoribine處理會顯著促進(jìn)DC及其亞群的分化和活化。

2.3 TLR7激動劑對小鼠脾細(xì)胞中T細(xì)胞亞群分化的影響

通過FACS檢測了TLR7激動劑對T細(xì)胞亞群(Th1、Th2、Tfh、Treg)的影響，結(jié)果如圖3所示：在感染后第5天，P.y17XNL感染促進(jìn)4種T細(xì)胞亞群的分化，與Control組相比，Loxoribine處理組的Th1細(xì)胞和Tfh細(xì)胞數(shù)量顯著高于Control組(P<0.05，圖3A和C)，但兩組之間Th2細(xì)胞和Treg的數(shù)量無顯著性差異。在感染后第10天，Loxoribine處理會促進(jìn)Th1細(xì)胞、Th2細(xì)胞和Tfh細(xì)胞的升高(圖3A～C)，但兩組之間只有Th2細(xì)胞數(shù)量存在顯著性差異(P<0.05)，Treg未見有顯著變化。上述結(jié)果提示，TLR7激動劑促進(jìn)宿主Th1、Th2和Tfh細(xì)胞的分化。

2.4 TLR7激動劑對小鼠脾細(xì)胞中T細(xì)胞活化的影響

為探討TLR7激動劑對T細(xì)胞免疫功能的影響，通過ELISA檢測脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中各細(xì)胞亞群特異性細(xì)胞因子的表達(dá)水平。如圖4所示，P.y17XNL感染促進(jìn)IFN-γ、IL-4、IL-21和IL-10的升高。在感染后第5天，TLR7激動劑處理能夠顯著提高脾細(xì)胞上清中IFN-γ的水平(P<0.01，圖4A)，同時也顯著抑制IL-10的水平(P<0.01，圖4D)，兩組之間IL-4和IL-21未見顯著性差異。在感染后第10天，兩組之間的IFN-γ、IL-4和IL-10存在顯著性差異(P<0.05或P<0.01，圖4A、B、D)，IL-21未見有顯著性差異。這些結(jié)果提示TLR7激動劑可促進(jìn)Th1細(xì)胞活化，抑制Th2細(xì)胞和Treg的功能，但對Tfh細(xì)胞功能沒有顯著影響。

圖2 TLR7激動劑對感染小鼠脾臟中DC亞群及其功能分子的影響Fig.2 The effect of TLR7 agonist on the DC subsets and related functional molecules in the spleen of infected mice A：表達(dá)TLR7的DC數(shù)量；B：DC總數(shù)；C：髓樣DC數(shù)量；D：漿樣DC數(shù)量；E：表達(dá)MHC II類分子的DC數(shù)量；F：表達(dá)CD86分子的DC數(shù)量；* P<0.05，** P<0.01，# P<0.05A:DCs expressing TLR7;B:total DCs;C:myeloid DCs;D:plasmacytoid DCs;E:DCs expressing MHC II;F:DCs expressing CD86

圖3 TLR7激動劑對感染小鼠脾臟中T細(xì)胞亞群分化的影響Fig.3 The effect of TLR7 agonist on the T cells subpopulations differentiation in the spleen of infected mice A：Th1細(xì)胞數(shù)量；B：Th2細(xì)胞數(shù)量；C：濾泡輔助性T細(xì)胞數(shù)量；D：調(diào)節(jié)性T細(xì)胞數(shù)量；* P<0.05，** P<0.01，# P<0.05A:Th1 cells;B:Th2 cells;C:Follicular helper T cell;D:Regulatory T cells

圖4 TLR7激動劑對感染小鼠脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中T細(xì)胞細(xì)胞因子的影響Fig.4 The effect of TLR7 agonist on the cytokine's levels of T cells in the cultured supernatant of spleen cells from the infected mice A：IFN-γ水平；B：IL-4水平；C：IL-21水平；D：IL-10水平；* P<0.05，** P<0.01，# P<0.05，## P<0.01A:The level of IFN-γ;B:The level of IL-4;C:The level of IL-21;D：The level of IL-10

3 討 論

固有免疫系統(tǒng)是機(jī)體抵御外來感染的第一道屏障。TLRs是固有免疫啟動免疫效應(yīng)的識別受體。既往研究證明TLRs受體參與瘧疾感染的過程。其中，TLR7識別瘧原蟲RNA，主要表達(dá)于pDC[4，13]。TLR7被其配體激活后，通過下游接頭蛋白分子MyD88將激活信號向下游傳遞，最終激活轉(zhuǎn)錄因子NF-κB，從而產(chǎn)生多種細(xì)胞因子，參與體液免疫或細(xì)胞免疫應(yīng)答。目前TLRs激動劑可能成為理想的疫苗佐劑，比如TLR9、TLR4激動劑已開始應(yīng)用[14-15]。本研究通過建立約氏瘧原蟲感染BALB/c小鼠模型，并給予TLR7激動劑，觀察其如何啟動并影響免疫應(yīng)答，這將為研究新的疫苗提供參考。

DC作為固有免疫細(xì)胞之一，是目前研究發(fā)現(xiàn)的功能最強(qiáng)、也是唯一能夠活化初始型T細(xì)胞的專職抗原提呈細(xì)胞。在連接固有免疫和適應(yīng)性免疫中起到關(guān)鍵作用。通過表面相關(guān)模式識別受體(pattern recognition receptor，PRR)識別并處理病原體抗原是DC發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)的前提[16]。本研究結(jié)果顯示，TLR7激動劑可以活化DC，尤其是表達(dá)TLR7的 DC，從而促進(jìn)DC亞群的分化。

DC活化后會啟動宿主適應(yīng)性免疫應(yīng)答來控制瘧疾感染，其中Th1細(xì)胞免疫應(yīng)答的強(qiáng)度對瘧疾感染預(yù)后至關(guān)重要[17-18]。本研究結(jié)果顯示，TLR7激動劑Loxoribine能夠顯著促進(jìn)感染早期Th1和Tfh細(xì)胞分化，同時Th1細(xì)胞因子IFN-γ的表達(dá)水平也顯著升高，Treg的數(shù)量未受影響，但其特異性的IL-10水平顯著降低，這些結(jié)果表明TLR7激動劑促進(jìn)感染早期Th1免疫應(yīng)答來控制瘧原蟲感染，從而縮短宿主自愈時間。

在P.y17XNL感染的BALB/c小鼠模型中，TLR7激動劑Loxoribine可通過誘導(dǎo)DC的活化，促進(jìn)Th1型免疫應(yīng)答，在感染早期發(fā)揮保護(hù)性免疫作用，降低原蟲血癥水平。本研究為有效的瘧疾疫苗的研發(fā)和發(fā)明提供了參考。