譚大為， 鄭丹， 陳秀萍

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬白云醫(yī)院 血液內(nèi)科， 貴州 貴陽 550014； 2.貴陽護(hù)理職業(yè)學(xué)院， 貴州 貴陽 550081； 3.畢節(jié)市七星關(guān)區(qū)人民醫(yī)院， 貴州 畢節(jié) 551700)

淋巴瘤是起源于淋巴造血系統(tǒng)的惡性腫瘤，發(fā)病原因不明，通常認(rèn)為與病毒感染有直接關(guān)系，最為常見是EB病毒(EBV)感染[1]。研究表明，EBV感染與淋巴瘤的關(guān)系密切[1-2]，EBV感染相關(guān)淋巴瘤主要包括Burkitt淋巴瘤、B細(xì)胞增殖性疾病、霍奇金淋巴瘤、T細(xì)胞淋巴瘤等[3-5]。現(xiàn)行淋巴瘤的治療方案仍然以化療為主[4]。臨床上EBV陽性與EBV陰性淋巴瘤的治療和預(yù)后有較大的區(qū)別[5]，研究發(fā)現(xiàn)，通過常規(guī)化療，85%的EBV陰性淋巴瘤病例可達(dá)到5年無病生存，EBV陽性淋巴瘤病例中可達(dá)到5年無病生存的病例僅為60%[6-9]，提示EBV陽性淋巴瘤患者的治療較為困難。在常規(guī)化療過程中聯(lián)合抗病毒治療EBV，以期達(dá)到更好的療效及預(yù)后，是探尋EBV陽性淋巴瘤治療方案的一個(gè)研究方向。干擾素是廣譜抗病毒藥，對EBV感染有一定的治療作用[10-11]。本研究采用干擾素處理EBV陽性人Burkitt's淋巴瘤細(xì)胞株Raji細(xì)胞，觀察其對Raji細(xì)胞增殖的影響及可能機(jī)制，為EBV陽性淋巴瘤的臨床治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞及主要試劑

人Burkitt's淋巴瘤細(xì)胞Raji(編號TCHu 44)購于上海中國科學(xué)院細(xì)胞庫，RPMI l640培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國GIBCO公司產(chǎn)品，CCK8試劑盒購自美國Sigma公司產(chǎn)品，干擾素購自北京三元基因工程有限公司生產(chǎn)(母液為3 000 000 U/mL)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自日本takara公司產(chǎn)品，RT試劑、QPCR試劑、sybr green I購自重慶威斯騰生物醫(yī)藥科技有限責(zé)任公司，BRLF1、BZLF1引物由重慶威斯騰生物醫(yī)藥科技有限責(zé)任公司合成。BRLF1引物序列：上游為GAAGAAACCAGTCAGGCCGT，下游為TGTTGTGGTCAGTTCGTCCA，產(chǎn)物大小為141 bp。BZLF1引物序列：上游為GGGGCTAACCAAGGACAACA，下游為 ATTCCTCCAGCGATTCTGGC，產(chǎn)物大小為112 bp。內(nèi)對照GAPDH引物序列：上游為AGATCCCTCCAAAATCAAGTGG，下游為GGCAGAGATGATGACCCTTTT，產(chǎn)物大小為130 bp。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) Raji細(xì)胞用含10%胎牛血清RPMI l640培養(yǎng)基，在37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，1～2 d換液1次，取對數(shù)生長期細(xì)胞用于后續(xù)研究。

1.2.2細(xì)胞處理 取對數(shù)生長期Raji細(xì)胞，分別用100、500、1 000、2 000及5 000 U/mL干擾素處理12、24及48 h，分別檢測細(xì)胞增殖活性。根據(jù)結(jié)果選擇最佳檢測時(shí)間，收集細(xì)胞，提取DNA，檢測其BZLFl、BRLFl基因的表達(dá)水平。研究設(shè)立對照，Raji細(xì)胞不用干擾素處理。

1.2.3細(xì)胞增殖活性 采用CCK-8法，分別取不同濃度干擾素處理12、24及48 h的Raji細(xì)胞，加入CCK-8溶液10 μL，繼續(xù)孵育4 h，用酶標(biāo)儀測定450 nm處的吸光度值(OD450)。計(jì)算細(xì)胞活力及抑制率：細(xì)胞活力(%)=[(實(shí)驗(yàn)組OD450-空白組OD450)/(對照組OD450)-空白組OD450)]×100%，細(xì)胞抑制率(%)=(對照組OD450-實(shí)驗(yàn)組OD450)/(對照組OD450)。

1.2.4BZLFl及BRLFlmRNA表達(dá) 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR (QPCR)檢測，(1)cDNA合成：收集不同濃度干擾素處理48 h的Raji細(xì)胞，Trizol提取總RNA，配制10 μL反應(yīng)液[包括Random 6mers(50 μmol/L)1 μL、dNTP mixture(10 mmol/L)1 μL、總RNA 5 μL及ddH2O 3 μL]進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，先將反應(yīng)液在65 ℃保溫5 min后冰上迅速冷卻，配制反轉(zhuǎn)錄體系，包括變性后反應(yīng)液10 μL、5×PrimeScript 2 Buffer 4 μL、40 U/μL RNase lnhibitor 0.5 μL、200 U/μL PrimeScript 2 RTase 1 μL、ddH2O補(bǔ)足體積至20 μL；反應(yīng)條件為30 ℃ 10 min、42 ℃ 60 min、95 ℃ 5 min，冰上冷卻。(2)QPCR擴(kuò)增反應(yīng)體系：2×PowerUp SYBR Green Master Mix 5 μL、BZLFl或BRLFl基因上下游引物各0.5 μL、反轉(zhuǎn)率產(chǎn)物1 μL、ddH2O補(bǔ)足體積至10 μL，反應(yīng)條件為50 ℃預(yù)變性2 min，95 ℃變性2 min、60 ℃退火1 min、95 ℃延伸15 s，40次循環(huán)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 Raji 細(xì)胞增殖活性

CCK-8法結(jié)果顯示，100、500、1 000、2 000及5 000 U/mL干擾素分別處理 Raji細(xì)胞12、24及48 h后， 5個(gè)濃度的干擾素對Raji細(xì)胞增殖均有一定抑制作用，且隨著濃度增加及作用時(shí)間延長，抑制作用增強(qiáng)，各組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖1、表1。

圖1 不同濃度干擾素對Raji細(xì)胞增殖的影響Fig.1 Interferon inhibit proliferation of Raji cells

2.2 Raji細(xì)胞BZLFl、BRLFlmRNA的表達(dá)

根據(jù)CCK-8的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇干擾素處理Raji細(xì)胞48 h后檢測細(xì)胞BZLFl、BRLFlmRNA表達(dá)水平。BZLFl、BRLFlQPCR結(jié)果顯示，其CT值為單一曲線，其溶解曲線為單一峰值，說明結(jié)果可信；統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，不同濃度干擾素分別處理Raji細(xì)胞48 h后，Raji細(xì)胞BZLFl、BRLFlmRNA的表達(dá)水平均顯著上調(diào)，且隨著藥物濃度的增加而增加，各組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖2、表2。

表1 干擾素抑制 Raji 細(xì)胞增殖Tab.1 Interferon inhibit proliferation of Raji cells

注：(1)與對應(yīng)時(shí)間點(diǎn)其他濃度組比較，P<0.05；(2)與相同濃度其他時(shí)間點(diǎn)比較，P<0.05。

圖2 BZLFl、BRLFlmRNA表達(dá)QPCR結(jié)果及溶解曲線Fig.2 QPCR results and dissolution curves of BZLFl and BRLFl mRNA expression

表2 干擾素上調(diào)Raji細(xì)胞BZLFl及BRLFl mRNA表達(dá)Tab.2 Interferon upregulate the expression of BZLFl mRNA and BRLFl mRNA in Raji cells

注：(1)與對照組比較，P<0.05；(2)與100 U/mL干擾素組比較，P<0.05；(3)與500 U/mL干擾素組比較，P<0.05；(4)與1 000 U/mL干擾素組比較，P<0.05；(5)與2 000 U/mL干擾素組比較，P<0.05。

3 討論

大量研究結(jié)果表明，EBV與多種人類腫瘤疾病有關(guān)，如傳染性單核細(xì)胞增多癥、淋巴瘤、鼻咽癌等[12-15]。有文獻(xiàn)報(bào)道，EBV陽性的淋巴瘤患者較EBV陰性的淋巴瘤患者預(yù)后差[16-19]，因此，去除EBV感染的B細(xì)胞是目前預(yù)防和治療EBV相關(guān)淋巴瘤的一大策略。EBV感染人體包括潛伏感染或增殖感染兩種形式，其中以潛伏感染最為常見，EBV感染者中90%以上的人終身潛伏感染[20-22]。EBV感染首選的治療方法是抗病毒治療。目前常用的抗病毒藥物主要是阿昔洛韋和更昔洛韋等嘌呤核苷類似物。這些藥物進(jìn)入細(xì)胞后需要在病毒編碼的激酶作用下三磷酸化，形成有活性的形式。但是，EBV潛伏感染的淋巴瘤細(xì)胞不表達(dá)病毒編碼的激酶，因此這類抗病毒藥物不能取得很好的治療效果。所以治療EBV陽性淋巴瘤中的EBV需要誘導(dǎo)EBV從潛伏感染轉(zhuǎn)化為增殖感染[23-24]。EBV潛伏感染時(shí)，基因組環(huán)化成游離體并持續(xù)存在于細(xì)胞內(nèi)，宿主細(xì)胞基因復(fù)制時(shí)，病毒基因也隨之復(fù)制，病毒此時(shí)只表達(dá)一部分基因。EBV增殖感染時(shí)，基因組是線性的，表達(dá)大量的病毒結(jié)構(gòu)基因和調(diào)節(jié)基因，如BZLFl、BRLFl等，復(fù)制出新的病毒，并感染新的宿主細(xì)胞。BZLFl、BRLFl是EBV的即早基因，EBV進(jìn)入增殖感染的起始很大程度上依賴于BZLFl、BRLFl兩個(gè)基因的表達(dá)。干擾素具有抗病毒、抑制細(xì)胞增殖、調(diào)節(jié)免疫及抗腫瘤作用，廣泛用于治療惡性腫瘤、急慢性丙型病毒性肝炎、慢性活動(dòng)性乙型肝炎、肝纖維化(早期肝硬化)、感染與損傷性疾病、骨髓增生異常綜合癥、病毒性疾病、系統(tǒng)性硬皮病、異位性皮炎、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等；在EBV感染中，亦有較好的治療效果[25-28]。但干擾素臨床用于淋巴瘤的治療目前存在爭議。本研究采用不同濃度干擾素作用Raji細(xì)胞，于不同時(shí)間點(diǎn)觀測其對Raji細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果表明干擾素100 U/mL作用12 h即可抑制Raji細(xì)胞的增殖，且隨著干擾素濃度的增加及作用時(shí)間延長，抑制作用增強(qiáng)，干擾素作用12、24、48 h的IC50分別為10 346.6、6 726.2、4 991.7 U/mL。另外，干擾素100～5 000 U/mL的濃度均能上調(diào)Raji細(xì)胞BZLFl、BRLFlmRNA的表達(dá)。而BZLFl、BRLFl是誘導(dǎo)EBV進(jìn)入增殖感染的始動(dòng)基因，EBV進(jìn)入增殖感染，能夠激發(fā)宿主免疫系統(tǒng)來殺傷EBV和被感染的細(xì)胞。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)干擾素能夠有效地抑制Raji細(xì)胞增殖，并且通過上調(diào)BZLFl、BRLFlmRNA的表達(dá)誘導(dǎo)其進(jìn)入增殖感染，這為干擾素臨床應(yīng)用于淋巴瘤的治療，特別是EBV陽性淋巴瘤的治療提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，從而為淋巴瘤臨床治療提供了新的治療方案。