尹雄章，肖珊，馬郁文，方春香，張曉雪

(1.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院藥學(xué)部，武漢 430030；2.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬武漢市中心醫(yī)院藥學(xué)部，武漢 430014；3.武漢市第四醫(yī)院、華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬普愛(ài)醫(yī)院檢驗(yàn)科，武漢 430034)

兒茶素是茶多酚中主要活性物質(zhì)，具有抗菌、抗氧化以及抗腫瘤等多種生物活性[1]。兒茶素主要包括4種單體，包括表兒茶素(epicatechin, EC)、表兒茶素沒(méi)食子酸酯(epicabechin gallate, ECG)、表沒(méi)食子兒茶素(epigallocatechin, EGC)、表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯(epigallocatechin gallate，EGCG)。近年來(lái)，兒茶素在腦缺血損傷中保護(hù)作用備受關(guān)注。研究表明：EC可通過(guò)作用于轉(zhuǎn)錄因子NF-E2相關(guān)因子2(NF-E2-related factor 2, Nrf2)通路減輕小鼠腦梗死后氧化應(yīng)激損傷，保護(hù)腦組織[2-3]；EGCG可作用于 PI3K/AKT/eNOS信號(hào)通路、抑制炎癥反應(yīng)以及抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等從而減輕缺血-再灌注所致的腦組織損傷[4-6]。在人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的缺血復(fù)灌模型中，ECG也被證實(shí)能促進(jìn)新血管形成，減輕細(xì)胞凋亡和自噬，促進(jìn)細(xì)胞增殖[7]。然而，EGC在腦缺血損傷中作用研究甚少，其對(duì)腦缺血的保護(hù)作用尚不清楚。為了更好地闡明兒茶素的生物活性和藥理作用，筆者利用小鼠離體腦片及海馬神經(jīng)元HT-22細(xì)胞培養(yǎng)模型，研究EGC對(duì)缺血損傷的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康清潔級(jí)雄性昆明小鼠，體質(zhì)量20～25 g，由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。動(dòng)物合格證號(hào)：00020736；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(鄂)2010-0009。小鼠隨機(jī)分籠飼養(yǎng)，室溫保持在20～22 ℃，自由飲水與進(jìn)食，光照遵循自然節(jié)律。本實(shí)驗(yàn)方案在華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物倫理委員會(huì)審批后實(shí)施。

1.2細(xì)胞系 實(shí)驗(yàn)用小鼠海馬神經(jīng)元HT-22細(xì)胞系購(gòu)自廣州吉妮歐生物科技有限公司。用含10%胎牛血清(fetal bovine serum ，F(xiàn)BS)的達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基(DMEM)培養(yǎng)，置于37 ℃含5%二氧化碳(CO2)的培養(yǎng)箱中。培養(yǎng)基每2 d換液一次，細(xì)胞系每3 d進(jìn)行一次傳代。

1.3主要藥品和試劑 表沒(méi)食子兒茶素(上海源葉生物科技有限公司,批號(hào)：970-74-1,含量：98%)；烏拉坦(醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司,批號(hào)：07032)。乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒(批號(hào)：20140107),超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒(批號(hào)：20140115),考馬斯亮藍(lán)試劑盒(批號(hào)：20110303)均購(gòu)于南京建成生物工程研究所。CCK-8試劑盒(日本同仁公司，貨號(hào)：CK04)。2，3，5-三苯基氯化四氮唑(2, 3, 5 -triphenyltetrazolium chloride，TTC)購(gòu)自Sigma公司(批號(hào)：BE 090326)，用雙蒸水配成20 g·L-1的溶液，常溫避光保存。其他試劑均為市售分析純。人工腦脊液(artificial cerebrospinal fluid, ACSF)由實(shí)驗(yàn)人員配制，其組成為(mmol·L-1)：氯化鈉(NaCl )126, 氯化鉀(KCl)3.5, 磷酸二氫鈉(NaH2PO4)1.2, 氯化鎂(MgCl2)1.3, 氯化鈣(CaCl2)2.0, 葡萄糖[D-(+)-glucose]11, 碳酸氫鈉(NaHCO3)25。孵育腦片時(shí)預(yù)先以含95% 氧氣(O2)和5% CO2的混合氣飽和。無(wú)糖ACSF以10 mmol·L-1蔗糖代替葡萄糖。

1.4腦片及細(xì)胞OGD損傷模型的制備 小鼠腹腔注射20%烏拉坦0.1 mL·(10 g)-1，迅速處死取腦，浸入4 ℃預(yù)飽和95%O2+5% CO2的ACSF中。分離雙側(cè)皮質(zhì)和海馬，沿冠狀面于組織切片機(jī)上將皮層，海馬分別切成厚400 μm的腦片。沖洗后，采用簡(jiǎn)單隨機(jī)法將腦片分為正常對(duì)照組及模型對(duì)照組，并分別置于3 mL ACSF的孵育瓶中(持續(xù)通95%O2+5%CO2的混合氣體)，每瓶含腦片6片(腦片不重疊)。在35 ℃水浴槽中孵育30 min,模型對(duì)照組迅速換成無(wú)葡萄糖并預(yù)飽和95%氮?dú)?N2)+5% CO2的ACSF孵育。皮層腦片孵育15 min，海馬腦片孵育10 min。正常對(duì)照組進(jìn)行換液操作，但不做OGD處理。EGC小、中、大劑量組在進(jìn)行OGD處理時(shí)，分別給予1，3和10 mg·L-1EGC共同孵育。

HT-22細(xì)胞OGD：將培養(yǎng)液換成不含F(xiàn)BS的無(wú)糖DMEM，置于含5%CO2、95% N2的培養(yǎng)箱中，連續(xù)培養(yǎng)3 h?？瞻讓?duì)照組進(jìn)行換液操作但不做OGD處理。藥物干預(yù)組在進(jìn)行OGD處理時(shí)，給予濃度為3 mg·L-1EGC共孵育。

1.5腦片TTC染色法 參照文獻(xiàn)[8]。培養(yǎng)結(jié)束后分別將皮質(zhì)和海馬腦片與TTC溶液在37 ℃條件下避光孵育30 min，隨后取出，0.9%氯化鈉溶液漂洗，吸去表面水分，稱濕重，以腦片1 g加入抽提液(乙醇：二甲亞砜=1：1)20 mL中,避光24 h后按每孔皮質(zhì)200 μL、海馬100 μL加至96孔板,酶標(biāo)儀測(cè)定各孔在490 nm波長(zhǎng)處吸光度值(A490)。

1.6LDH釋放量的測(cè)定 培養(yǎng)結(jié)束后，收集各組孵育液，按照LDH試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行測(cè)定。通過(guò)酶標(biāo)儀測(cè)定其在440 nm處A值，求出每毫克腦片組織LDH含量。每次實(shí)驗(yàn)前，通過(guò)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線確定樣本的取樣量。

1.7SOD活力的測(cè)定 培養(yǎng)的皮層及海馬組織用0.9%氯化鈉溶液勻漿，培養(yǎng)的細(xì)胞系用磷酸鹽緩沖液(PBS)勻漿，4 ℃，3000 r·min-1離心20 min。收集上清液保存于-70 ℃冰箱中。參照SOD試劑盒說(shuō)明書(shū)，測(cè)定SOD活力。通過(guò)酶標(biāo)儀測(cè)定其在550 nm波長(zhǎng)處A值，求出每毫克總蛋白的SOD活力。在每次實(shí)驗(yàn)前，利用考馬斯亮藍(lán)試劑盒繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線確定樣本的取樣量。

1.8CCK-8檢測(cè)細(xì)胞活力 將1×105·mL-1細(xì)胞懸液接種于96孔培養(yǎng)板中(每孔100 μL)。實(shí)驗(yàn)分為3組：正常對(duì)照組，模型對(duì)照組，EGC組。OGD結(jié)束后，每孔加入CCK-8溶液10 μL，在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1 h后,于全自動(dòng)酶標(biāo)儀在450 nm處檢測(cè)各組A值。取4孔A值的平均數(shù)，按公式計(jì)算細(xì)胞活力：細(xì)胞活力(%)=處理組A值/對(duì)照組A值×100%，重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1EGC對(duì)小鼠皮質(zhì)及海馬腦片OGD損傷TTC染色的影響 腦片TTC染色A490值顯示：小鼠皮質(zhì)和海馬經(jīng)OGD后腦組織均受到明顯損傷，與正常對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(皮質(zhì)：t=7.77，P<0.01；海馬t=5.75，P<0.01)。與模型對(duì)照組比較，EGC小、中、大劑量組損傷明顯改善，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(皮質(zhì)：t=1.84，2.55，3.47，P<0.01；海馬：t=1.96，2.16，4.21，P<0.01)。見(jiàn)圖1，表1。

A.正常對(duì)照組；B.模型對(duì)照組；C.EGC小劑量組；D.EGC中劑量組；E.EGC大劑量組。

表1 5組小鼠皮質(zhì)及海馬腦片TTC染色后A490檢測(cè)值

2.2EGC對(duì)小鼠皮質(zhì)及海馬腦片OGD損傷組織LDH釋放量的影響 與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組LDH的釋放量顯著增加(皮質(zhì)：t=4.68，P<0.01；海馬：t=5.09，P<0.01)。與模型對(duì)照組比較，EGC小、中、大劑量組皮質(zhì)及海馬腦片組織中LDH的釋放量顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(皮質(zhì)：t=3.62，4.70，6.06，P<0.01；海馬：t=2.09，2.83，5.48,P<0.05或P<0.01)。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 5組小鼠皮質(zhì)及海馬腦片組織LDH釋放量

2.3EGC對(duì)小鼠皮質(zhì)及海馬腦片OGD損傷組織SOD活力的影響 與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組皮質(zhì)及海馬組織SOD活力明顯下降(皮質(zhì)：t=3.48，P<0.01；海馬：t=8.58，P<0.01)。與模型對(duì)照組比較，EGC小、中、大劑量組皮質(zhì)及海馬腦片組織中SOD活力明顯升高(皮質(zhì)：t=2.06，2.56，7.83，P<0.01；海馬：t=4.71，6.08，11.03，P<0.01)。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 5組小鼠皮質(zhì)及海馬腦片組織SOD活力檢測(cè)值

2.4EGC對(duì)HT-22細(xì)胞系OGD損傷后細(xì)胞活力及SOD活力的影響 與正常對(duì)照組比較，HT-22細(xì)胞系經(jīng)OGD處理后細(xì)胞活力明顯下降(t=11.03，P<0.01)，SOD活力明顯降低(t=8.55，P<0.01)。給予3 mg·L-1EGC處理后HT-22細(xì)胞系的細(xì)胞活力及SOD活力明顯升高(t=7.76，t=5.04，均P<0.01)。結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 EGC對(duì)HT-22細(xì)胞系OGD損傷后細(xì)胞活力及SOD活力的影響

3 討論

離體腦片及細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)是神經(jīng)科學(xué)研究領(lǐng)域中常用的一種技術(shù)手段。對(duì)離體培養(yǎng)的腦片或細(xì)胞進(jìn)行氧糖剝奪處理，可模擬腦缺血的病理模型，從而評(píng)價(jià)藥物對(duì)腦缺血損傷的保護(hù)作用。在本實(shí)驗(yàn)中，離體培養(yǎng)的小鼠腦片及海馬神經(jīng)元HT-22細(xì)胞經(jīng)氧糖剝奪處理后可出現(xiàn)明顯損傷。在氧糖剝奪的同時(shí)給予EGC共孵育，發(fā)現(xiàn)EGC可逆轉(zhuǎn)OGD對(duì)小鼠離體腦片及HT-22細(xì)胞的損傷作用。

腦缺血損傷與自由基的產(chǎn)生及其引發(fā)的氧化、過(guò)氧化病理反應(yīng)密切相關(guān)，因此，應(yīng)用抗氧化劑對(duì)其進(jìn)行有效防治已經(jīng)成為近年來(lái)研究熱點(diǎn)[9]。正常生理下，體內(nèi)氧自由基的產(chǎn)生和清除處于平衡。一旦自由基代謝失衡，即可導(dǎo)致細(xì)胞損傷。EGC屬多酚類化合物，有強(qiáng)效的抗氧化作用和自由基清除能力。研究表明，EGC能抑制脂質(zhì)過(guò)氧化[10]，猝滅單線態(tài)氧[11]，以及清除一氧化氮和超氧化物[12]等，從而發(fā)揮強(qiáng)大的抗氧化作用。本研究發(fā)現(xiàn)，給予EGC可逆轉(zhuǎn)OGD所致的SOD活力下降。SOD是生物體內(nèi)清除自由基的首要物質(zhì)，可把有害的超氧自由基轉(zhuǎn)化為過(guò)氧化氫，繼而被過(guò)氧化氫酶和過(guò)氧化物酶分解為完全無(wú)害的水。所以，此結(jié)果提示EGC可以抑制腦缺血所致的氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而發(fā)揮保護(hù)作用。筆者目前還未見(jiàn)有研究報(bào)道指出EGC對(duì)腦缺血損傷有保護(hù)作用。但結(jié)果顯示兒茶素能夠通過(guò)抑制缺氧/復(fù)灌所致的氧化應(yīng)激而發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用[13]；并且兒茶素對(duì)大鼠腦缺血復(fù)灌也具有很好的保護(hù)作用[14]。EGC是兒茶素中的主要成分之一，這可以從側(cè)面上佐證EGC對(duì)腦缺血的保護(hù)作用，與本研究的結(jié)果相對(duì)應(yīng)。

綜上所述，EGC對(duì)小鼠離體腦片及HT-22細(xì)胞OGD損傷具有明顯的保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能與提高組織SOD活力有關(guān)。但其更詳細(xì)的作用機(jī)制，尚有待進(jìn)一步深入研究。