王 茜，張一昕，石 鋮，郝 蕾，韓 雪，郭秋紅，張曉棟

河北中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，河北省高校中藥組方制劑應(yīng)用技術(shù)研發(fā)中心，石家莊 050200

藥物性肝損傷(drug-induced liver injury，DILI)是指藥物或其代謝產(chǎn)物引起的肝細(xì)胞毒性損害或肝臟對(duì)藥物及代謝產(chǎn)物的變態(tài)反應(yīng)所致的疾病。據(jù)報(bào)道，DILI已成為國(guó)內(nèi)外常見(jiàn)且較嚴(yán)重的藥源性疾病之一[1]。研究表明，氧化應(yīng)激在藥物性肝損傷的發(fā)病中具有重要作用，而過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體(PPARS)與氧化應(yīng)激關(guān)系密切。過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體a(peroxisome proliferators activated receptor alpha，PPAR-a)和過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferators activated receptor gamma，PPAR-γ)屬于細(xì)胞核受體家族，其功能狀態(tài)與肝臟相關(guān)疾病(如脂肪肝、肝炎、肝硬化和肝癌)的發(fā)生密切相關(guān)[2]。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，藥物性肝損傷是藥毒侵犯機(jī)體，濕熱毒邪蘊(yùn)結(jié)體內(nèi)，影響肝膽的正常疏泄功能，從而導(dǎo)致脅痛、黃疸等癥狀。楮實(shí)子(Broussonetiae Fructus)為?？浦参飿?gòu)樹(shù)Broussonetiapapyrifera(L．)Vent．的干燥成熟果實(shí)，主入肝經(jīng)，味甘性寒無(wú)毒，具有益陰清肝、利水消腫的功效。根據(jù)DILI濕熱毒邪的病機(jī)，楮實(shí)子通過(guò)清肝，利水消腫的作用能有效去除濕熱邪毒，且現(xiàn)代研究報(bào)道，楮實(shí)子具有保肝及較強(qiáng)的體外抗氧化作用[3,4]。因此，本文擬通過(guò)觀察肝功能指標(biāo)，揭示楮實(shí)子對(duì)藥物性肝損傷的保護(hù)作用，通過(guò)檢測(cè)氧化應(yīng)激指標(biāo)及PPAR-a和PPAR-γ的基因表達(dá)情況，初步探討楮實(shí)子可能的作用途徑，為保肝新藥的研發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

動(dòng)物：清潔級(jí)SD大鼠50只，雌雄各半，體質(zhì)量180 ～ 220 g，購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物合格證號(hào)：11400700181914，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(京)2012-0001。

主要試劑與試劑盒：谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT，批號(hào)AUZ3689)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST，批號(hào)AUZ3645)測(cè)定試劑盒均購(gòu)自貝克曼庫(kù)爾特實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)有限公司；總膽紅素(TBIL，批號(hào)A005)和直接膽紅素(DBIL，批號(hào)A006)試劑盒均購(gòu)自長(zhǎng)春匯力生物技術(shù)有限公司；超氧化物歧化酶(SOD，批號(hào)A001-1)，谷胱甘肽(GSH，批號(hào)A006-1)，丙二醛(MDA，批號(hào)A003-2)，谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px，批號(hào)A005)，過(guò)氧化氫酶(CAT，批號(hào)A007-1)試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所；Trizol(批號(hào)：139603)，購(gòu)自invitrogen公司；TIANScriptcDNA第一鏈合成試劑盒(批號(hào)：P5011)，SuperRealPreMix Plus(SYBR Green，批號(hào)：Q5922)均購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司；Anti-ROS1 Rabbit Polyclonal Antibody(批號(hào)：D829AA0353)，購(gòu)自O(shè)RIGENE公司。

主要儀器：Humalyzer2000 半自動(dòng)生化分析儀(德國(guó)豪邁公司)、HMIAS-2000顯微圖像分析系統(tǒng)(武漢同濟(jì)大學(xué))、熒光定量PCR儀ABI7500(Applied Biosystems)、DP73數(shù)碼顯微鏡(日本 Olympus)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 楮實(shí)子藥液制備

楮實(shí)子(CSZ)選用廣東一方制藥有限公司生產(chǎn)的中藥配方顆粒(批號(hào)為:11080711，當(dāng)量比為7∶1)，實(shí)驗(yàn)時(shí)將楮實(shí)子的實(shí)驗(yàn)用生藥劑量按照當(dāng)量比換算為配方顆粒的劑量，用100 ℃ 蒸餾水充分溶解，冷貯備用。

1.2.2 動(dòng)物分組與造模

將 50只 SD 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng) 1 周后，按體重隨機(jī)分為5組，每組 10只，即:正常組、模型組、水飛薊賓組、楮實(shí)子低、高劑量組 (簡(jiǎn)稱(chēng)低劑量組、高劑量組)。除正常組給予蒸餾水灌胃以外，其余各組用對(duì)乙酰氨基酚溶液1 200 mg/kg(用40 ℃生理鹽水配制)每日灌胃1次，連續(xù)30天。

1.2.3 給藥方法

從造模第 1 天起，上午造模，下午正常組和模型組給予蒸餾水灌胃，陽(yáng)性藥和楮實(shí)子各劑量組均給予相應(yīng)藥物。結(jié)合臨床應(yīng)用，選擇臨床成人1日常用劑量10 g作為楮實(shí)子低劑量，40 g作為楮實(shí)子高劑量，按照人與大鼠體表系數(shù)法轉(zhuǎn)換為實(shí)驗(yàn)用量，低、高劑量組大鼠每日用藥劑量分別為1.05、4.2 g生藥/kg；水飛薊賓組為44 mg/kg。每次用藥體積均為1 mL/100 g，連續(xù)給藥30 天，自由進(jìn)食水，每5 天稱(chēng)體重一次，根據(jù)體重更換灌胃體積。

1.2.4 樣本制備及相關(guān)生理生化指標(biāo)檢測(cè)

最后一次灌胃給藥后，各組大鼠禁食不禁水16 h，3.5% 水合氯醛麻醉后腹主動(dòng)脈取血，分別置于潔凈試管和肝素抗凝管中，4 000 rpm，離心20 min，分離血清和血漿，采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)ALT和AST活性、DBIL和TBIL含量；采用紫外分光光度儀按照南京建成試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定血清中SOD、GSH-PX 和CAT的活性，GSH和MDA的含量。各組大鼠取血后，迅速剖腹取出肝臟，分成若干小塊，取一部分置于4% 多聚甲醛溶液中固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋，連續(xù)切片，HE 染色，光鏡觀察肝組織的形態(tài)學(xué)變化，運(yùn)用免疫組化法檢測(cè)ROS1的蛋白表達(dá)；再取一部分置于凍存管中液氮凍存，-80 ℃冰箱保存，RT-PCR技術(shù)檢測(cè)肝組織中PPAR-γmRNA、PPAR-αmRNA的表達(dá)。

1.2.5 RT-PCR

稱(chēng)取100 mg肝臟組織，磨碎，加入Trizol 1 mL，冰上勻漿，提取總RNA。參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，獲得cDNA。取5μL RNA用1% 瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，以檢測(cè)其完整性。將完整的cDNA 進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 反應(yīng)，分別用目的基因引物和內(nèi)參基因引物進(jìn)行擴(kuò)增，同時(shí)在60～95 ℃進(jìn)行溶解曲線分析，檢測(cè)PPAR-γ、PPAR-α的基因表達(dá)，采用2-△△CT法進(jìn)行數(shù)據(jù)的相對(duì)定量分析。β-actin上游引物5′-CCTCCTGAACTTGAGGCAGTTTA-3′，下游引物5′-CTCTGGGGCTGTCAGTCTTG-3′，PPAR-α上游引物為5′-GAAAGATTCGGAAACTGC-3′，下游引物為5′-TCCTGCGAGTATGACCC-3′；PPAR-γ上游引物為5′-TGGGCGAATGCCACAGG-3′，下游引物為5′-TTTGGTCAGCGGGAAGG-3′。

1.2.6 免疫組化

將多聚甲醛固定的肝組織制作成病理蠟塊，切片后按照試劑盒說(shuō)明用免疫組化法觀察ROS1的陽(yáng)性表達(dá)，通過(guò)軟件分析所測(cè)陽(yáng)性反應(yīng)物相對(duì)含量的灰度值及面積，由積分光密度值(IOD)和平均光密度值(MOD)來(lái)表示。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS13.5軟件進(jìn)行處理，計(jì)量資料多組間比較采用方差分析，方差齊選用LSD，方差不齊選用非參數(shù)檢驗(yàn)方法；以P<0.05 有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 楮實(shí)子對(duì)APAP肝損傷大鼠血清肝功能指標(biāo)的影響

與正常組比較，模型組大鼠血清中ALT 和AST活性、DBIL含量均明顯升高(P<0.05或P<0.01)、TBIL含量有升高趨勢(shì)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。藥物干預(yù)后，各用藥組ALT和AST活性，DBIL和TBIL的含量均較模型組降低。其中水飛薊賓組和低劑量組ALT、AST活性降低明顯(P<0.05或P<0.01)，高劑量組AST活性及DBIL含量顯著降低(P<0.05或P<0.01)；與高劑量組比較，楮實(shí)子低劑量組AST活性的降低更明顯(P<0.05)(見(jiàn)表1)。

表1 楮實(shí)子對(duì)APAP肝損傷大鼠血清ALT、AST、DBIL、TBIL的影響

注：與正常組比較，△P<0.05，△△P<0.01；與模型組比較，▲P<0.05，▲▲P<0.01；與高劑量組比較，※P<0.05。

Note:Compared with normal group,△P<0.05，△△P<0.01;Compared with model group,▲P<0.05，▲▲P<0.01;Compared with high dose group,※P<0.05.

2.2 楮實(shí)子對(duì)APAP肝損傷大鼠肝組織病理形態(tài)學(xué)的影響

正常組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝索以中央靜脈為中心呈放射狀排列整齊，肝細(xì)胞形態(tài)正常，未見(jiàn)明顯病理改變。模型組肝小葉結(jié)構(gòu)破環(huán),肝索排列紊亂，廣泛性肝細(xì)胞氣球樣變并伴有壞死。水飛薊賓對(duì)照組和楮實(shí)子各給藥組大鼠僅在中央靜脈周?chē)霈F(xiàn)局部的肝細(xì)胞氣球樣變。尤其是水飛薊賓對(duì)照組和低劑量楮實(shí)子組肝損傷程度最輕，僅出現(xiàn)個(gè)別肝細(xì)胞氣球樣變情況(見(jiàn)圖1)。

圖1 楮實(shí)子對(duì)APAP肝損傷大鼠肝組織病理形態(tài)學(xué)的影響(HE,100×)Fig.1 Effects of CSZ on the morphology of mouse liver tissues(HE,100×)注：1.正常組；2.模型組；3.水飛薊賓組；4.楮實(shí)子低劑量組；5.楮實(shí)子高劑量組。Note:1.Normal;2.APAP;3.APAP+silymarin;4.APAP+CSZ (1.05 g/kg);5.APAP+CSZ (4.2 g/kg).

2.3 楮實(shí)子對(duì)APAP肝損傷大鼠氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響

與正常組比較，模型組大鼠血清中MDA含量顯著升高(P<0.01)，GSH含量、SOD和GSH-PX活性顯著降低(P<0.05或P<0.01)。與模型組比較，水飛薊賓組MDA含量降低(P<0.05)，SOD活性顯著升高(P<0.01)；高、低劑量楮實(shí)子組GSH含量、SOD和GSH-PX活性均顯著升高(P<0.05或P<0.01)。與水飛薊賓組比較，低劑量組GSH含量顯著升高(P<0.01)。各組CAT活性無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。見(jiàn)表2和表3。

表2 楮實(shí)子對(duì)APAP肝損傷大鼠血清MDA、GSH含量的影響

注：與正常組比較，△P<0.05，△△P<0.01；與模型組比較，▲P<0.05，▲▲P<0.01；與水飛薊賓組比較，☆☆P<0.01。

Note:Compared with normal group,△P<0.05，△△P<0.01;Compared with model group,▲P<0.05，▲▲P<0.01;Compared with silymarin group,☆☆P<0.01.

表3 楮實(shí)子對(duì)APAP肝損傷大鼠血清SOD、 GSH-PX、CAT活性的影響

注：與正常組比較，△P<0.05，△△P<0.01；與模型組比較，▲P<0.05，▲▲P<0.01。

Note:Compared with normal group，△P<0.05;Compared with model group,▲P<0.05，▲▲P<0.01.

2.4 楮實(shí)子對(duì)APAP肝損傷大鼠肝組織中PPAR-α、PPAR-γ mRNA表達(dá)的影響

與正常組比較，模型組、水飛薊賓組、高、低劑量楮實(shí)子組PPAR-αmRNA表達(dá)水平均顯著降低(P<0.01)，PPAR-γmRNA表達(dá)水平升高，其中模型組、水飛薊賓組、低劑量組表達(dá)升高有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01或P<0.05)；與模型組比較，水飛薊賓組、高、低劑量組PPAR-αmRNA表達(dá)水平均升高，PPAR-γmRNA表達(dá)水平均降低，其中高、低劑量組的調(diào)控作用尤為明顯(P<0.01)；與水飛薊賓組比較，高、低劑量組PPAR-αmRNA表達(dá)水平均顯著提高(P<0.01)、PPAR-γmRNA表達(dá)水平均降低(P<0.01)；與高劑量組比較，低劑量組PPAR-αmRNA表達(dá)水平降低(P<0.05)(見(jiàn)表4)。

表4 楮實(shí)子對(duì)APAP肝損傷大鼠肝組織中PPAR-α、PPAR-γ mRNA表達(dá)的影響

注：與正常組比較，△△P<0.01；與模型組比較，▲P<0.05，▲▲P<0.01；與水飛薊賓組比較，☆☆P<0.01；與高劑量組比較，※P<0.05。

Note:Compared with normal group,△△P<0.01;Compared with model group,▲P<0.05，▲▲P<0.01;Compared with silymarin group,☆☆P<0.01;Compared with high dose group,※P<0.05.

2.5 楮實(shí)子對(duì)APAP肝損傷大鼠肝組織中ROS1表達(dá)的影響

正常組陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)相對(duì)較少，著色較淺，模型組大鼠肝組織的細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)相對(duì)較多，著色較深。對(duì)照組、低、高劑量楮實(shí)子組陽(yáng)性細(xì)胞的表達(dá)及著色程度降低。模型組大鼠肝組織中IOD和MOD較正常組升高(P<0.01或P<0.05)；各用藥組IOD和MOD均低于模型組(P<0.01或P<0.05)，其中，IOD高、低劑量組高于對(duì)照組(P<0.01)，高劑量組低于低劑量組(P<0.01);MOD高、低劑量均高于對(duì)照組，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見(jiàn)表5，圖2)。

表5 楮實(shí)子對(duì)APAP肝損傷大鼠肝組織中ROS1蛋白表達(dá)的影響

注：與正常組比較，△P<0.05，△△P<0.01；與模型組比較，▲P<0.05，▲▲P<0.01與水飛薊賓組比較，☆☆P<0.01；與高劑量組比較，※※P<0.01。Note:Compared with normal group,△△P<0.01;Compared with model group,▲P<0.05，▲▲P<0.01;Compared with silymarin group,☆☆P<0.01;Compared with high dose group,※※P<0.01.

3 結(jié)論

ALT 和 AST 是臨床應(yīng)用最廣泛的反映肝細(xì)胞損傷的生化指標(biāo)，但在藥物性肝損傷的早期診斷及識(shí)別方面具有一定的局限性[5]。有文獻(xiàn)報(bào)道，膽紅素增高是藥物性肝炎死亡及肝衰竭的最佳預(yù)測(cè)指標(biāo)。TBIL和DBIL的正常代謝依賴(lài)于肝細(xì)胞,當(dāng)肝臟發(fā)生炎癥、壞死、中毒等損害時(shí)，一方面肝臟無(wú)法完全攝取和結(jié)合 TBIL，另一方面肝細(xì)胞內(nèi)的 DBIL會(huì)從受損的肝細(xì)胞釋出，因此導(dǎo)致血液中 DBIL和 TBIL 均升高[6]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組AST、ALT活性和DBIL含量顯著升高，肝細(xì)胞變性、壞死，提示藥物性肝損傷模型成功。采用不同劑量的楮實(shí)子給藥，結(jié)果顯示楮實(shí)子各劑量組血清 ALT、AST活性和DBIL、TBIL含量降低，肝細(xì)胞變性程度較模型組減輕，表明楮實(shí)子對(duì)藥物性肝損傷有良好的修復(fù)作用。

圖2 楮實(shí)子對(duì)APAP肝損傷大鼠肝組織中ROS1蛋白表達(dá)的變化(免疫組化，200×)Fig.2 Effects of CSZ on the expression of ROS1 protein in the liver of rats(SP,200×)注：1.正常組；2.模型組；3.水飛薊賓組；4.楮實(shí)子低劑量組；5.楮實(shí)子高劑量組。Note:1.Normal;2.APAP;3.APAP+silymarin;4.APAP+CSZ (1.05 g/kg);5.APAP+CSZ (4.2 g/kg).

文獻(xiàn)報(bào)道氧化應(yīng)激是對(duì)乙酰氨基酚導(dǎo)致肝損傷的重要機(jī)制[7]，對(duì)乙酰氨基酚 (APAP)過(guò)量可引起線粒體氧化損傷、肝細(xì)胞壞死，從而導(dǎo)致急性肝衰竭。而作為脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的終產(chǎn)物之一，MDA是機(jī)體內(nèi)反映氧化損傷程度的經(jīng)典指標(biāo)之一。同時(shí)肝臟還有多種抗氧化物酶，可抵抗自由基損傷，如SOD、CAT和GSH-Px共同形成抗氧化物酶體系[8]。GSH是一種低分子自由基清除劑，又是GSH-Px的底物，能防止細(xì)胞因子受氧化損傷。脂質(zhì)過(guò)氧化作用將活性氧轉(zhuǎn)化為活性化學(xué)劑，通過(guò)鏈?zhǔn)交蜴準(zhǔn)街ф湻磻?yīng)放大活性氧的作用，同時(shí)由于活性氧積聚，使肝組織的抗氧化物質(zhì)消耗增加，使SOD 、CAT、 GSH-Px、GSH表達(dá)量下降[9]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，模型組大鼠肝組織 MDA 含量高于正常組，SOD 、GSH-Px和GSH水平明顯低于正常組，提示肝損傷大鼠有脂質(zhì)過(guò)氧化損傷及抗氧化物酶體系的減弱。而楮實(shí)子各劑量組的肝組織 MDA 含量低于模型組，SOD 、GSH-Px和GSH水平高于模型組，提示其具有抗氧化，清除自由基的作用。

ROS1是Ⅱ類(lèi)受體酪氨酸激酶的胰島素受體基因，被認(rèn)為是多種信號(hào)通路的啟動(dòng)因子，在正常的機(jī)體狀態(tài)下其被嚴(yán)格控制不發(fā)揮作用，一旦受到致病因子的刺激，則可誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)[10]。因此，ROS1可認(rèn)為是氧化應(yīng)激發(fā)生的一個(gè)啟動(dòng)因子，如果能抑制ROS1的表達(dá)，則可延緩或抑制氧化應(yīng)激的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。PPAR-α和PPAR-γ均是配體活化的轉(zhuǎn)錄因子，屬于核激素受體超家族成員。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，PPAR-α及其配體對(duì)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的藥物性肝損傷有良好的調(diào)控作用，激活 PPAR-α可抑制肝細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷的脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，減輕大鼠肝細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷的氧化應(yīng)激損傷，保護(hù)肝功能。PPAR-γ可被特異性配體激活而在細(xì)胞增殖分化、炎癥調(diào)控、凋亡、抑制肝臟氧化應(yīng)激過(guò)程中發(fā)揮重要作用[11-13]。劉芳等研究發(fā)現(xiàn)，PPAR-γ的表達(dá)在 LPS/D-GalN誘導(dǎo)的急性肝損傷模型組中顯著增高，與以往研究結(jié)果相反，認(rèn)為在急性肝損傷中PPAR-γ的表達(dá)升高可能是一種應(yīng)激性反應(yīng)[14]。另有文獻(xiàn)報(bào)道，肝細(xì)胞中PPAR-γ的表達(dá)可抑制脂代謝，促進(jìn)肝臟脂肪變性[15]。本文結(jié)果顯示，模型組大鼠ROS1蛋白表達(dá)以及PPAR-γ基因表達(dá)高于正常組，而PPAR-α基因表達(dá)低于正常組，楮實(shí)子各劑量組ROS1蛋白的表達(dá)和PPAR-γ基因表達(dá)均有不同程度的降低，PPAR-α基因表達(dá)基因表達(dá)有不同程度的升高，以高劑量組效果較好。

綜上所述，楮實(shí)子能有效防治對(duì)乙酰氨基酚所致肝損傷，其機(jī)制可能與ROS1蛋白控制了氧化應(yīng)激的啟動(dòng)，轉(zhuǎn)錄因子PPAR-α對(duì)藥物性肝損傷所發(fā)生的氧化應(yīng)激起到正向調(diào)控的作用，PPAR-γ則為反向調(diào)控的作用，結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道分析PPAR-γ是否對(duì)氧化應(yīng)激性損傷發(fā)揮保護(hù)作用有爭(zhēng)議，一方面認(rèn)為PPAR-γ過(guò)表達(dá)為機(jī)體抗炎的應(yīng)激性反應(yīng)。另一方面，PPAR-γ過(guò)度表達(dá)通過(guò)抑制脂代謝，促進(jìn)肝臟脂肪變性。因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)會(huì)選擇加入PPAR-γ的激動(dòng)劑或抑制劑，設(shè)置不同的對(duì)乙酰氨基酚給藥時(shí)間、給藥劑量，觀察氧化應(yīng)激、炎性因子、脂質(zhì)代謝、PPAR-γ等指標(biāo)的變化，以期最終揭示楮實(shí)子對(duì)PPAR-γ的反向調(diào)控是否為保肝作用的機(jī)制。