萬(wàn)亞會(huì) 吳偉 張軒 孫曉倩 薛蓉

α7-nAChR是煙堿型乙酰膽堿受體（nicotinic acetylcholinereceptor，nAChR）的一種亞型，主要分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，參與介導(dǎo)學(xué)習(xí)、記憶鞏固、運(yùn)動(dòng)、注意力等過(guò)程[1]，研究表明α7-nAChR對(duì)鈣離子有較高的滲透性[2]，增強(qiáng)谷氨酸鹽的釋放，具有神經(jīng)保護(hù)、促進(jìn)突觸再生及神經(jīng)元生存的作用[3]，可能在認(rèn)知功能障礙的發(fā)展中起重要作用。目前的研究多關(guān)注α7-nAChR在卒中[4]、心肌缺血再灌注[5]、肺損傷[6]等動(dòng)物模型中的表達(dá)及作用機(jī)制。睡眠是人類(lèi)重要的生理過(guò)程，快速眼球運(yùn)動(dòng)（rapid eyes movement，REM）睡眠期對(duì)記憶形成、鞏固及突觸的可塑性具有重要作用[7]，睡眠不足會(huì)引起日間嗜睡、注意力不集中及學(xué)習(xí)工作效率的下降，長(zhǎng)期睡眠不足或睡眠剝奪可導(dǎo)致認(rèn)知功能下降[8]。因此本研究旨在觀察慢性睡眠剝奪對(duì)小鼠海馬組織α7-nAChR的影響，為今后深入探索α7-nAChR在睡眠剝奪后認(rèn)知功能下降的可能機(jī)制提供依據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象與分組雄性C57BL/6J小鼠，7～8周齡，體重在20 g～23 g之間，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供。C57BL/6J小鼠隨機(jī)分為3組，每組24只，對(duì)照（CC）組：適宜環(huán)境下飼養(yǎng)1周，對(duì)照組再同籠飼養(yǎng)7 d后處死；慢性睡眠剝奪（sleep deprivation，SD）組：適宜環(huán)境下飼養(yǎng) 1 周，利用改良多平臺(tái)水環(huán)境法進(jìn)行慢性睡眠剝奪7 d后處死；慢性睡眠剝奪后腹腔注射α7-nAChR激動(dòng)劑-PHA-543613（SD+PHA-543613）組：適宜環(huán)境下飼養(yǎng)1周，利用改良多平臺(tái)水環(huán)境法進(jìn)行睡眠剝奪7 d，睡眠剝奪結(jié)束后6 h腹腔注射α7-nAChR受體激動(dòng)劑PHA-543613（6 mg/kg，sigma公司，美國(guó)），連續(xù)腹腔注射3 d后處死，CC組于處死前3 d連續(xù)腹腔注射等量的生理鹽水，所有小鼠均嚴(yán)格遵循12 h光照，12 h黑暗的晝夜節(jié)律。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 慢性睡眠剝奪模型的建立 使用改良多平臺(tái)水環(huán)境法（modified multiple platform method，MMPM）對(duì)小鼠進(jìn)行慢性睡眠剝奪，剝奪箱內(nèi)均勻放有8個(gè)圓形平臺(tái)，造模前向剝奪箱內(nèi)加水至平臺(tái)下方約 1 cm處，水溫保持在（22±2）℃，剝奪箱頂部放置水和食物，小鼠可在平臺(tái)間自由活動(dòng)、攝食及飲水，每天定時(shí)更換水以保持清潔。睡眠剝奪過(guò)程保證 12 h 光照（9：00～21：00）、12 h 黑暗（21：00～9:00）的晝夜節(jié)律。造模開(kāi)始前3 d每天定時(shí)把SD組的小鼠放在睡眠剝奪水箱內(nèi)適應(yīng)環(huán)境，每天適應(yīng)2 h。睡眠剝奪過(guò)程從9：00開(kāi)始，每天17:00～21:00把小鼠從剝奪箱中拿出，放至原來(lái)的鼠籠中休息4 h，連續(xù)睡眠剝奪7 d。

1.2.2 免疫熒光染色檢測(cè)星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞表面α7-nAChR的表達(dá) 三組小鼠腹腔注射10%的水合氯醛進(jìn)行麻醉，麻醉成功后使用冰PBS灌注，直至肝臟變白、自右心耳流出為澄清液體，分離腦組織，先于4%多聚甲醛浸泡過(guò)夜固定，再先后置于15%和30%的蔗糖溶液中梯度脫水，脫水成功后切除額極和腦干，包埋腦組織，冰凍切片機(jī)下連續(xù)切片，取各組海馬組織切片，每只小鼠各取5片，切片厚度為8 μm。海馬組織切片經(jīng)固定、破膜，與大鼠抗小鼠 α7-nAChR抗體（1:100，Santa Cruz Biotechnology公司）、山羊抗小鼠IBA-1抗體 （1:500，Abcam公司，英國(guó)），兔抗小鼠GFAP 抗體（1:1000，Abcam 公司，英國(guó)）4℃孵育過(guò)夜，次日與山羊抗兔IgG（FITC）（1:1000，Abcam 公司，英國(guó)），驢抗大鼠IgG（Alexa Fluor 596）（1:500，Jackson 公司，美國(guó)），驢抗山羊 IgG（Alexa Fluor 488）（1:500，Jackson 公司，美國(guó)）室溫避光孵育 1h，DAPI封片，免疫熒光顯微鏡觀察，計(jì)數(shù)α7-nAChR與星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞的共表達(dá)的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。

1.2.3 Western印跡法檢測(cè)α7-nAChR蛋白表達(dá)分離三組小鼠海馬組織，加入裂解液，使用超聲粉碎，于4℃離心機(jī)14000 rpm，離心30 min，吸取上清，BCA蛋白試劑盒測(cè)定蛋白濃度。等量蛋白經(jīng)電泳轉(zhuǎn)到聚亞乙烯雙氧化物膜（PVDF）上，蛋白條帶加入大鼠抗小鼠α7-nAChR抗體（1：200，Santa Cruz Biotechnology公司）4℃慢搖孵育過(guò)夜，次日與HRP標(biāo)記的山羊抗大鼠IgG抗體（1：5000，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）室溫慢搖孵育1 h，ECL超敏發(fā)光混合液進(jìn)行凝膠成像拍照。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Rt-PCR）檢測(cè)α7-nAChR的mRNA表達(dá) 分離三組小鼠海馬組織，使用Trizol試劑提取RNA，紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA濃度。加入逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系，將RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一條鏈，再向cDNA模板中加入PCR預(yù)混液進(jìn)行PCR擴(kuò)增，Bio-Rad檢測(cè)目的基因的相對(duì)表達(dá)水平，通過(guò)比較CT值獲得目的基因的相對(duì)表達(dá)水平（見(jiàn)表1）。

表1 α7-nAChR和GAPDH的上下游引物

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 23.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，正態(tài)分布計(jì)量資料用x±s表示，偏態(tài)分布計(jì)量資料以中位數(shù)（四分位數(shù)）[M（QL，QU）]表示，正態(tài)分布計(jì)量資料兩樣本均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，偏態(tài)分布計(jì)量資料的組間比較使用兩獨(dú)立樣本秩和檢驗(yàn)，兩組以上樣本比較進(jìn)行單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)。α＝0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 小鼠海馬組織α7-nAChR蛋白檢測(cè)慢性睡眠剝奪7 d后，SD組小鼠海馬組織α7-nAChR蛋白表達(dá)量（0.813±0.055）較 CC 組（1.249±0.118）明顯減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.001）；慢性睡眠剝奪后腹腔注射PHA-543613后α7-nAChR蛋白表達(dá)量（1.065±0.047）較 SD 組（0.813±0.055）升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.037）（圖 1，表 2）。

表2 三組小鼠海馬組織α7-nAChR表達(dá)量比較（x±s）

圖1 三組小鼠海馬組織α7-nAChR檢測(cè)結(jié)果及量化比較（n=6） A：蛋白印跡法檢測(cè)各組小鼠海馬α7-nAChR蛋白表達(dá)；B：α7-nAChR/β-action灰度值的比較，β-action為內(nèi)參

2.2 小鼠海馬組織α7-nAChR mRNA表達(dá)的比較慢性睡眠剝奪 7 d后的海馬組織α7-nAChR mRNA 表達(dá)量（0.930±0.150）較 CC 組（1.318±0.045）降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.038）；與SD組比較，腹腔注射PHA-543613后α7-nAChR mRNA 表達(dá)量（1.524±0.134）升高，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.002）（圖 2，表 3）。

表3 三組小鼠海馬組織α7-nAChR的mRNA表達(dá)量比較

圖2 三組小鼠海馬組織α7-nAChR的mRNA表達(dá)的量化比較（n=6）

2.3 α7-nAChR免疫熒光檢測(cè)及其在星形膠質(zhì)細(xì)胞表面的表達(dá)慢性睡眠剝奪后海馬組織星形膠質(zhì)細(xì)胞 α7-nAChR 的表達(dá)（1.533±0.186）較 CC 組（3.142±0.218）顯著減少，SD+腹腔注射 PHA-543613組海馬組織星形膠質(zhì)細(xì)胞α7-nAChR的表達(dá)（2.650±0.479）較 SD 組（1.533±0.186）增多，SD組與CC組、SD+PHA組與SD組比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01、P=0.027）。

圖3 免疫熒光染色法檢測(cè)小鼠海馬組織α7-nAChR陽(yáng)性細(xì)胞及星形膠質(zhì)細(xì)胞表面α7-nAChR的表達(dá) A、B、C為CC組，D、E、F為 SD 組，G、H、I為 SD+PHA-543613組；A 為 B、C 融合圖，D為 E、F 融合圖，G 為 H、I融合圖；B、E、H 為紅色熒光標(biāo)記的α7-nAChR，C、F、I為綠色熒光標(biāo)記的星形膠質(zhì)細(xì)胞

2.4 小鼠海馬組織小膠質(zhì)細(xì)胞表面α7-nAChR表達(dá)的檢測(cè)慢性睡眠剝奪后海馬組織小膠質(zhì)細(xì)胞 α7-nAChR 的表達(dá)（1.536±0.337）較 CC 組（1.714±0.236） 減少，SD+腹腔注射 PHA-543613組海馬組織小膠質(zhì)細(xì)胞α7-nAChR的表達(dá)（2.340±0.189）較 SD 組（1.536±0.337）增多，SD 組與 CC組、SD+PHA組與SD組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（見(jiàn)圖 4）。

圖4 免疫熒光染色法檢測(cè)小鼠海馬組織小膠質(zhì)細(xì)胞表面α7-nAChR 的表達(dá)。A、B、C 為 CC 組，D、E、F為 SD 組，G、H、I為SD+PHA-543613組；A為B、C融合圖，D為E、F融合圖，G為H、I融合圖；B、E、H 為紅色熒光標(biāo)記的 α7-nAChR，C、F、I為綠色熒光標(biāo)記的小膠質(zhì)細(xì)胞

3 討論

本研究首次探討慢性睡眠剝奪對(duì)小鼠海馬組織α7-nAChR表達(dá)的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示慢性睡眠剝奪7 d后小鼠海馬區(qū)α7-nAChR基因與蛋白表達(dá)減少。中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)，α7-nAChR主要分布于海馬、丘腦、額葉及皮層等與學(xué)習(xí)記憶、情感相關(guān)的重要腦區(qū)[1]，F(xiàn)REEDMAN等[9]和JESSEN等[10]發(fā)現(xiàn)AD和精神分裂癥患者腦組織內(nèi)α7-nAChR表達(dá)減少。這與本研究結(jié)果基本一致，研究結(jié)果提示海馬組織α7-nAChR是中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的敏感指標(biāo)。

α7-nAChR具有神經(jīng)保護(hù)作用，體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)均發(fā)現(xiàn)，α7-nAChR激動(dòng)劑通過(guò)抑制淀粉樣蛋白、谷氨酸、乙醇等代謝毒物的生成發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[11-14]。研究也發(fā)現(xiàn)α7-nAChR參與膽堿能系統(tǒng)與γ-氨基丁酸系統(tǒng)之間的相互作用，進(jìn)而引起AD早期認(rèn)知功能的下降[3]，CONCEPCION等[15]認(rèn)為α7-nAChR可能是炎癥反應(yīng)與神經(jīng)退行性疾病之間聯(lián)系的橋梁，因此是多種神經(jīng)變性病的可能治療靶點(diǎn)。在精神分裂癥動(dòng)物模型中，使用α7-nAChR激動(dòng)劑后認(rèn)知功能改善[16]，加蘭他敏也通過(guò)激活α7-nAChR改善AD大鼠的認(rèn)知功能[17]，與既往研究結(jié)果相同，在慢性睡眠剝奪后腹腔注射α7-nAChR激動(dòng)劑PHA-543613后小鼠海馬區(qū)α7-nAChR基因與蛋白表達(dá)增多，但α7-nAChR是否以及通過(guò)何種機(jī)制參與睡眠剝奪后認(rèn)知功能損傷仍需要進(jìn)一步研究。

小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)主要的免疫炎性細(xì)胞，具有抗原呈遞和產(chǎn)生促炎或抗炎因子等多種功能[18-19]。越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)小膠質(zhì)細(xì)胞與神經(jīng)變性病密切相關(guān)[20]，睡眠剝奪模型中，BELLESI等[21]也發(fā)現(xiàn)急性睡眠剝奪和慢性睡眠限制后海馬區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞被激活。α7-nAChR主要表達(dá)于神經(jīng)元表面[22-23]，非神經(jīng)元細(xì)胞如星形膠質(zhì)細(xì)胞[24-25]、小膠質(zhì)細(xì)胞[26-27]、NK細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞等[28]也有不同密度α7-nAChR的表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，正常情況下小鼠海馬區(qū)的小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞表面均有α7-nAChR的表達(dá)，星形膠質(zhì)細(xì)胞表面 α7-nAChR的表達(dá)更多。α7nAChR受體在調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞的炎癥反應(yīng)中有重要作用，激活α7-nAChR能促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞由M1型向M2型轉(zhuǎn)變[29]，進(jìn)而抑制炎性因子的釋放；星形膠質(zhì)細(xì)胞表面的α7-nAChR通過(guò)激活Nrf 2信號(hào)通路、抑制NF-κB信號(hào)通路而發(fā)揮抗炎作用[30]。慢性睡眠剝奪7 d后，海馬區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞表面的α7-nAChR表達(dá)亦減少，睡眠剝奪后腹腔注射α7-nAChR激動(dòng)劑PHA-543613后星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞表面α7-nAChR表達(dá)增多。基于人群的研究發(fā)現(xiàn)5晚的睡眠限制可使外周血中促炎因子釋放增多，而睡眠恢復(fù)后血中促炎因子仍持續(xù)存在[31]，說(shuō)明睡眠剝奪可以誘導(dǎo)一系列免疫炎癥反應(yīng)，因此小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞表面的α7-nAChR可能成為限制睡眠剝奪后海馬炎癥和氧化應(yīng)激的潛在靶點(diǎn)，未來(lái)將進(jìn)一步深入探討膠質(zhì)細(xì)胞表面α7-nAChR在睡眠剝奪中的具體作用機(jī)制。

綜上所述，本研究表明慢性睡眠剝奪抑制海馬組織α7-nAChR的表達(dá)，降低膠質(zhì)細(xì)胞表面α7-nAChR的表達(dá)，海馬組織膠質(zhì)細(xì)胞α7-nAChR的減少可能是慢性睡眠剝奪后認(rèn)知功能下降的危險(xiǎn)因素，鑒于本研究樣本數(shù)量較少，α7-nAChR在慢性睡眠剝奪的具體機(jī)制還需進(jìn)一步研究。