栗媛 ，王茂芊 ，邳植 ，吳則東

（1.黑龍江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱150080；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院甜菜研究所/黑龍江大學(xué)農(nóng)作物研究院，哈爾濱150080；3.黑龍江省甜菜工程技術(shù)研究中心，哈爾濱150080）

0 引言

糖用甜菜（Beta vulgarisL.）屬于藜科、甜菜屬、二年生草本植物[1]。栽培甜菜分為糖用甜菜、飼用甜菜、葉用甜菜和食用甜菜。我國糖用甜菜主要分布在黑龍江、新疆、內(nèi)蒙古等地，是除了甘蔗之外的另一個(gè)主要糖來源，也是我國北方一種重要的經(jīng)濟(jì)作物[1]。近年來，甜菜分子生物學(xué)發(fā)展迅速，目前已經(jīng)有多種分子標(biāo)記技術(shù)在甜菜分子生物學(xué)中得到了應(yīng)用，包括：SSR[2-3]、ISSR[4]、SRAP[5]以及RAPD[6]等。其中，由于SSR分子標(biāo)記技術(shù)操作簡單并且所得產(chǎn)物具有共顯性、重復(fù)性好等特點(diǎn)[10]，因此在作物遺傳多樣性以及品種的鑒定研究中得到廣泛應(yīng)用，例如：水稻[7]、小麥[8]、玉米[9]、煙草[10]、甘薯[11]以及甘蔗[12]等，均利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)構(gòu)建了相應(yīng)的分子身份證，并建立了標(biāo)準(zhǔn)。

對(duì)于甜菜來說，2017年國家對(duì)甜菜品種實(shí)行登記制度，然而目前鑒別品種純度和真實(shí)性的方法主要是形態(tài)學(xué)鑒定法，形態(tài)學(xué)鑒定的方法一般需要整個(gè)生長周期，不僅鑒別時(shí)間長，還有時(shí)效性的問題，而且對(duì)于親緣關(guān)系較近的品種難以鑒別，這樣甜菜種植者一旦買到假冒偽劣的種子，將會(huì)極大地影響他們當(dāng)年的收入以及育種公司的利益。而分子標(biāo)記技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)對(duì)近似品種的鑒別，并且不受生育期的限制，隨時(shí)提取DNA即可鑒別。因此新登記的品種亟需利用分子標(biāo)記技術(shù)構(gòu)建指紋圖譜，而利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)構(gòu)建甜菜品種的指紋圖譜是目前比較好的一個(gè)選擇。本試驗(yàn)利用SSR引物對(duì)2018年農(nóng)業(yè)農(nóng)村部全國農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣服務(wù)中心提供的39份甜菜登記品種進(jìn)行分子身份證的構(gòu)建，為將來利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)鑒定甜菜品種的純度和真實(shí)性提供技術(shù)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試品種

實(shí)驗(yàn)用到的39份甜菜品種均來自于農(nóng)業(yè)農(nóng)村部全國農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣服務(wù)中心，品種名稱及其編號(hào)見表1。

表1 供試甜菜品種編號(hào)及名稱Table 1 Number andname of sugar beet varieties for trial

1.1.2 引物

實(shí)驗(yàn)中用到的 17 對(duì)核心引物，分別為 BVGTT6、BVV45、BVV21、BVV23、C74、LNX38、LNX95、SB06、SB13、SB15、SSD6、TC55、TC58、TC83、TC122、TC123和TC129。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 甜菜DNA的提取

本實(shí)驗(yàn)中用到的甜菜品種是在光照培養(yǎng)室進(jìn)行培養(yǎng)，播種時(shí)每個(gè)品種取15粒，待其長出4片真葉時(shí)，從每個(gè)品種里挑選10株新鮮健康的幼苗，然后利用改進(jìn)過的CTAB法[13]提取甜菜基因組DNA。最后每個(gè)離心管加入100μL TE緩沖液溶解DNA，利用核酸蛋白測(cè)定儀最終得到DNA原液并取部分稀釋至10 ng/μL，剩下的母液放到-20℃的冰箱中保存。

1.2.2 甜菜SSR-PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系及程序

甜菜SSR-PCR的反應(yīng)體系來自于文獻(xiàn)[14]，反應(yīng)程序采用Touchdown程序，退火溫度由65℃到56℃，1℃兩個(gè)循環(huán)，最后55℃20個(gè)循環(huán)。

1.2.3 電泳及銀染

利用8%的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分離，每個(gè)孔加入PCR產(chǎn)物2μL，電壓180 V，時(shí)間為90 min。電泳結(jié)束后，使用快速銀染法對(duì)其染色[15]，最后拍照記錄。

圖1引物TC129對(duì)39個(gè)甜菜品種的擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 Amplification results of 39 sugar beet varieties by primer TC129

2 結(jié)果及分析

2.1 39個(gè)甜菜品種指紋圖譜的構(gòu)建

把這17對(duì)引物作為核心引物，對(duì)已提取出的39份甜菜品種的基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，便成功構(gòu)建出39個(gè)甜菜品種的SSR指紋圖譜。通過對(duì)SSR-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)，在同一遷移率位置，有帶記為1，無帶記為0，利用0、1數(shù)據(jù)構(gòu)建甜菜品種的指紋圖譜。圖1為引物TC129對(duì)39個(gè)甜菜品種的擴(kuò)增條帶。利用5對(duì)引物L(fēng)NX38、LNX95、SSD6、SB06、SB13，便可完全鑒別出39個(gè)甜菜品種（0、1數(shù)據(jù)略）。

2.2 聚類分析

利用17對(duì)SSR引物所擴(kuò)增的條帶，依據(jù)0、1數(shù)據(jù)，按照UPGMA進(jìn)行聚類分析，得到了39份甜菜品種的遺傳關(guān)系樹狀圖，親緣關(guān)系樹狀圖在分子水平上顯示了甜菜品種間的親緣關(guān)系，可以為今后甜菜育種親本的選配提供理論依據(jù)。聚類圖見圖2。

在遺傳距離0.17的位置，39份甜菜品種被分成5個(gè)類群，包括了4個(gè)較大的類群和1個(gè)小類群，聚類的結(jié)果與品種的來源有較好的一致性，也就是一般說來來源于同一種子公司或者同一地區(qū)的品種聚在了一起。如BETA176和BETA468聚在了一起，這兩個(gè)品種均為美國Betaseed公司的品種；KUHN1178和SV1375聚在了一起，這兩個(gè)品種均為荷蘭的品種；HI0936和MA3001聚在了一起，這兩個(gè)品種同屬于瑞典的Hillesh?gMaribo公司。這種現(xiàn)象說明一定程度上，目前生產(chǎn)方面同一公司反復(fù)使用同一不育系或授粉系配制品種，從而才造成了遺傳基礎(chǔ)狹窄這一事實(shí)。因?yàn)樘鸩说倪z傳基礎(chǔ)本來就比較狹窄，未來甜菜育種工作只有加強(qiáng)國內(nèi)外的合作才有可能組配、選育出更加優(yōu)良的甜菜品種。

圖2 39個(gè)甜菜品種的聚類圖Fig.2 Clustergram of 39 sugar beet varieties

3 討論

目前，雖然有多篇文獻(xiàn)記載關(guān)于甜菜指紋圖譜的構(gòu)建，但構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)卻各不相同，例如：甜菜基因組DNA的提取[16]、PCR反應(yīng)程序[17]、SSR擴(kuò)增產(chǎn)物不同的檢測(cè)方法[18]等。這些因素均會(huì)對(duì)我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生或大或小的影響，因此我們不斷地改進(jìn)DNA提取方法以及反應(yīng)體系、反應(yīng)程序，最終利用SSR核心引物成功地構(gòu)建出39份甜菜品種的指紋圖譜，實(shí)現(xiàn)了快速鑒定甜菜品種真實(shí)性以及純度的目的。這對(duì)于減少種植者的損失，以及維護(hù)甜菜品種市場(chǎng)的秩序均具有重大的意義。