鄧振山，趙瑞華，賀曉龍，劉月芹

(延安大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，陜西 延安 716000)

促進(jìn)學(xué)生自主創(chuàng)新能力的培養(yǎng)，全面推進(jìn)人才培養(yǎng)模式的綜合改革，尤其是培養(yǎng)學(xué)生的自學(xué)能力和創(chuàng)新精神已成為目前我國(guó)高等教育改革的核心問(wèn)題[1]。微生物學(xué)是生物科學(xué)專業(yè)的一門重要的專業(yè)基礎(chǔ)課程，同時(shí)它也是實(shí)踐性很強(qiáng)的一門學(xué)科，在高等院校的生物科學(xué)、生物技術(shù)和生物工程及農(nóng)、林、醫(yī)、環(huán)境等專業(yè)的教學(xué)計(jì)劃中占有很重要的地位。微生物學(xué)的知識(shí)和技能在當(dāng)今社會(huì)的諸多領(lǐng)域中的應(yīng)用十分廣泛，因此，高水平學(xué)校的微生物教學(xué)體系對(duì)于培養(yǎng)和提高學(xué)生的探究能力、創(chuàng)新精神和整體素質(zhì)具有十分重要的意義[2]。鑒于此，本文以課堂教學(xué)案例的形式闡釋在本科課堂教學(xué)過(guò)程中如何培養(yǎng)學(xué)生的探究能力和創(chuàng)新意識(shí)，旨在倡導(dǎo)教師在平時(shí)的教學(xué)過(guò)程中有意識(shí)地注重大學(xué)生探究能力和科學(xué)思維能力的培養(yǎng)。在講授時(shí)，按照科學(xué)探究的方法，引導(dǎo)學(xué)生通過(guò)采用分組討論方式，完成探究過(guò)程。具體過(guò)程為：(1)觀察現(xiàn)象，提出問(wèn)題(什么？為什么？如何？)；(2)提出科學(xué)假說(shuō)(以解釋所觀察到現(xiàn)象內(nèi)部深藏的機(jī)理和內(nèi)在規(guī)律)；(3)設(shè)計(jì)科學(xué)實(shí)驗(yàn)方案，驗(yàn)證科學(xué)假設(shè)是否成立；(4)最后形成理論，并修改完善假說(shuō)。

1 觀察現(xiàn)象，提出問(wèn)題

革蘭氏染色(Gram Staining)是用來(lái)鑒別細(xì)菌的一種方法：這種染色法利用細(xì)菌細(xì)胞壁上的生物化學(xué)性質(zhì)不同，可將細(xì)菌分成兩類，即革蘭氏陽(yáng)性(Gram Positive)與革蘭氏陰性(Gram Negative)。革蘭氏染色法是細(xì)菌學(xué)中廣泛使用的一種鑒別染色法，這種染色法是由一位丹麥醫(yī)生漢斯·克里斯蒂安·革蘭(Hans Christian Gram，1853年-1938年)于1884年所發(fā)明，最初是用來(lái)鑒別肺炎球菌與克雷白氏肺炎菌之間的關(guān)系。后推廣為鑒別細(xì)菌種類的重要特性之一，對(duì)由細(xì)菌感染引起的疾病的臨床診斷及治療有著廣泛用途。

給學(xué)生強(qiáng)調(diào)革蘭氏染色法是其可將所有細(xì)菌染色的重要方法。其染色要點(diǎn)：先用結(jié)晶紫染液染色，再加媒染劑—碘液處理，使菌體著色，然后用乙醇脫色，最后用復(fù)染液(沙黃或番紅)復(fù)染。顯微鏡下菌體呈紅色者為革蘭氏染色陰性細(xì)菌(常以G-表示)深紫色者為革蘭氏染色陽(yáng)性反應(yīng)細(xì)菌(常以G+表示)。

具體通過(guò)G+菌(金黃色葡萄球菌)與G-菌(大腸桿菌)為例介紹染色的具體步驟及結(jié)果，創(chuàng)設(shè)情境讓學(xué)生首先從感官上先感受G+菌與G-菌染色的結(jié)果的差異，展示的效果見圖1和表1。

圖1 革蘭氏染色法的步驟及結(jié)果圖

步驟方法結(jié) 果陽(yáng)性(G+)陰性(G-)初染結(jié)晶紫30 s紫色紫色媒染劑碘液30 s仍為紫色仍為紫色脫色95%乙醇10～20 s保持紫色脫去紫色復(fù)染蕃紅(或復(fù)紅)30～60 s仍顯紫色紅色

在此基礎(chǔ)上，啟發(fā)學(xué)生去思考所有的細(xì)菌經(jīng)過(guò)革蘭氏染色，為什么能被染成兩種不同顏色？其內(nèi)在的原因和機(jī)理是什么？還要給學(xué)生強(qiáng)調(diào)，此答案是在革蘭氏染色法發(fā)明后的一百多年，經(jīng)過(guò)幾代科學(xué)家的不懈努力才找到其染色原因及機(jī)理，以此來(lái)激勵(lì)學(xué)生在科學(xué)的道路上，要不斷的堅(jiān)持和探索，最終才能找到科學(xué)的真諦。

2 提出科學(xué)假說(shuō)

繼續(xù)引導(dǎo)學(xué)生去思考和探究，學(xué)生可以利用空余時(shí)間自由組合成討論小組，結(jié)合自己對(duì)提出問(wèn)題的理解，有針對(duì)性的開展自主查閱與問(wèn)題內(nèi)容有關(guān)的文獻(xiàn)，提出相應(yīng)的科學(xué)假說(shuō)，如：之所以出現(xiàn)兩種不同的染色結(jié)果可能存在外在因素和內(nèi)在因素影響所致。具體的是(1)認(rèn)為是外在因素影響，即由于不同的染色步驟反應(yīng)的差別引起的，同學(xué)們就提出同一株菌株如果改變?nèi)旧襟E或染色時(shí)間會(huì)染成不同顏色的假說(shuō)；(2)認(rèn)為是內(nèi)在因素影響的，卻提出染色結(jié)果的差異是由于兩類細(xì)菌的細(xì)胞外膜結(jié)構(gòu)的差異所致的假說(shuō)。

3 設(shè)計(jì)科學(xué)實(shí)驗(yàn)方案

學(xué)生依據(jù)各自提出的假說(shuō)，撰寫實(shí)驗(yàn)實(shí)施方案，自己動(dòng)手做實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證所提出的假說(shuō)是否科學(xué)。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，要求學(xué)生認(rèn)真做好實(shí)驗(yàn)記錄，并對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理和分析。如認(rèn)為是內(nèi)在因素影響的，也就是說(shuō)染色結(jié)果的差異是由于兩類細(xì)菌的細(xì)胞外膜結(jié)構(gòu)的差異所致的同學(xué)，要想搞清其染色機(jī)理，首先必須要闡釋G+菌與G-菌細(xì)胞壁的化學(xué)組成結(jié)構(gòu)差異所在。為此，該組學(xué)生去思考并找出革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌(Gram positive)和革蘭氏陰性細(xì)菌(Gram negative)細(xì)胞壁的化學(xué)組成與超微結(jié)構(gòu)的差異所在：

(1)革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌

革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌細(xì)胞壁具有較厚(30～40 nm)而致密的肽聚糖層，多達(dá)20層，占細(xì)胞壁的成分60%～90%，它同細(xì)胞膜的外層緊密相連(見圖2)。有的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌細(xì)胞壁中含有磷壁酸(teichoi-acid)，也即胞壁質(zhì)(murein)。

圖2 革蘭氏陽(yáng)性菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)圖

(2)革蘭氏陰性細(xì)菌

革蘭氏陰性細(xì)菌特殊的是外膜上含有許多獨(dú)特的結(jié)構(gòu)(見圖示3)，如把外膜與肽聚糖層連接起來(lái)的布朗(Braun′s)脂蛋白，使?fàn)I養(yǎng)物被動(dòng)運(yùn)輸通過(guò)膜的膜孔蛋白和起保護(hù)細(xì)胞作用的脂多糖(LPS)。脂多糖也稱為內(nèi)毒素，對(duì)哺乳動(dòng)物有高度毒性。

圖3 革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)圖

G-細(xì)菌細(xì)胞壁外膜的基本成分是脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)，此外還有磷脂、多糖、和蛋白質(zhì)。外膜被分為脂多糖層(外)、磷脂層(中)、脂蛋白層(內(nèi))。

1)肽聚糖層：G-細(xì)菌細(xì)胞壁肽聚糖層很薄，約有2～3 nm厚。它與外膜的脂蛋白層相連。

2)周質(zhì)空間：周質(zhì)空間(periplasmic space，即壁膜間隙)是革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞膜與外膜兩膜之間的一個(gè)透明的區(qū)域(見圖2)。它含有與營(yíng)養(yǎng)物運(yùn)輸和營(yíng)養(yǎng)物進(jìn)入有關(guān)的蛋白質(zhì)，有：營(yíng)養(yǎng)物進(jìn)入細(xì)胞的蛋白；營(yíng)養(yǎng)物運(yùn)輸?shù)拿?，如蛋白水解酶；?xì)胞防御有毒化合物，如破壞青霉素的-內(nèi)酰胺酶。革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌以上這些酶常分泌到胞外周圍，革蘭氏陰性細(xì)菌則依靠它的外膜，保持這些酶與菌的緊密結(jié)合。因此，在此基礎(chǔ)上，通過(guò)查閱相關(guān)文獻(xiàn)和小組討論，依據(jù)革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌和革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的差異，設(shè)計(jì)出通過(guò)改造革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的方法，即通過(guò)加入十二級(jí)磺酸鈉(SDS)等表面活性劑以去除革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁最外層脂多糖，高速離心，取細(xì)胞體進(jìn)行革蘭氏染色，看結(jié)果有無(wú)變化，從染色結(jié)果的變化推斷出染色的差異是由于兩種菌株的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)差異所致的結(jié)論。

4 修改完善假說(shuō)

最后學(xué)生經(jīng)過(guò)探究和思考，并討論最終獲得革蘭氏染色機(jī)理如下：固定過(guò)的細(xì)胞經(jīng)過(guò)初染，例如結(jié)晶紫染色，接著加碘液媒染，細(xì)菌細(xì)胞壁內(nèi)由于染色形成結(jié)晶紫與碘的復(fù)合物。隨后加酒精從薄的細(xì)胞壁中洗出結(jié)晶紫與碘暗染色的復(fù)合物，但是結(jié)晶紫—碘復(fù)合物不能從厚的細(xì)胞壁中洗出。最后，用較淺的石炭酸復(fù)紅復(fù)染。加石炭酸復(fù)紅染色，使脫色的細(xì)胞呈粉紅色，但在含厚的肽聚糖暗染色的細(xì)胞中沒(méi)有看到粉紅色，仍保持第一次的染色結(jié)果。保持原來(lái)染色(厚的細(xì)胞壁)的細(xì)胞稱作革蘭氏陽(yáng)性，在光學(xué)顯微鏡下呈現(xiàn)藍(lán)紫色。脫色的細(xì)胞(薄的細(xì)胞壁和外膜)稱作革蘭氏陰性，染成粉紅色。

5 結(jié)語(yǔ)

通過(guò)這樣的探究過(guò)程，使學(xué)生明白科學(xué)的探究全過(guò)程，依靠自己去思考、去探究、去驗(yàn)證想法，這極大地激發(fā)了學(xué)生們的創(chuàng)造能力，也讓課堂更生動(dòng)更有活力。從而，經(jīng)過(guò)學(xué)生的積極思考和主動(dòng)參與，在教師主導(dǎo)作用下，潛默移化地培養(yǎng)了學(xué)生科學(xué)探究能力，激發(fā)了創(chuàng)新意識(shí)。還可以激發(fā)學(xué)生對(duì)科學(xué)研究的積極性，在本科學(xué)習(xí)中營(yíng)造濃厚的學(xué)術(shù)氛圍，充分調(diào)動(dòng)學(xué)生認(rèn)知客觀世界的能力，同時(shí)將教學(xué)和科研緊密結(jié)合。

經(jīng)過(guò)科學(xué)探究能力的培養(yǎng)，近2年來(lái)“陜北地區(qū)原油污染土壤的微生物修復(fù)技術(shù)”等30多個(gè)項(xiàng)目先后獲得國(guó)家級(jí)“大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃”計(jì)劃項(xiàng)目的立項(xiàng)，本科生畢業(yè)發(fā)表的微生物學(xué)相關(guān)的學(xué)術(shù)論文20余篇，并2次獲得全國(guó)大學(xué)生互聯(lián)網(wǎng)+大賽省級(jí)銀獎(jiǎng)和銅獎(jiǎng)。同時(shí)，通過(guò)科學(xué)探究意識(shí)的訓(xùn)練和創(chuàng)新實(shí)踐能力的培養(yǎng)，真正使個(gè)人科學(xué)素養(yǎng)培養(yǎng)落到實(shí)處，并使學(xué)生終身受益。讓學(xué)生在鞏固理論知識(shí)的同時(shí)，培養(yǎng)了學(xué)生科研創(chuàng)新思維能力。

因此，通過(guò)教學(xué)實(shí)踐模式表明，將科學(xué)探究過(guò)程融入到基礎(chǔ)微生物學(xué)教學(xué)過(guò)程的目的是激發(fā)學(xué)生科學(xué)研究和探索的積極性和主動(dòng)性，使其更好地掌握微生物學(xué)基本理論，并培養(yǎng)學(xué)生科學(xué)思維能力。