王亞楠，文海若*，王 雪*

(中國食品藥品檢定研究院，國家藥物安全評價監(jiān)測中心，藥物非臨床安全性評價研究北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100176)

基因突變(genemutation)指在分子水平上基因的堿基對組成或排列順序的改變，如堿基對置換(substitution)、移碼(translocation)、缺失(deletion)、插入(insertion)等?；蛲蛔儸F(xiàn)象最初于1910年由Morgan等[1]在白眼果蠅中首次發(fā)現(xiàn)，從此奠定了染色體的遺傳理論，Morgan也因此于1933年獲得諾貝爾生理學(xué)獎。此后，人們就基因突變類型及其產(chǎn)生機(jī)制進(jìn)行了大量研究?；蛲蛔兪前┌Y發(fā)生與發(fā)展的重要物質(zhì)基礎(chǔ)，已證實(shí)的具有致癌性的物質(zhì)70%有致突變性。遺傳毒性評價為食品(保健食品)、化妝品、藥品和醫(yī)療器械上市前重要的安全性評價研究內(nèi)容，其通過一系列試驗(yàn)來預(yù)測受試物的致癌性，從而降低相關(guān)接觸人群的患癌風(fēng)險。2018年3月由國家食品藥品監(jiān)督管理總局頒布的《藥物遺傳毒性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》[2]中提到兩種標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)組合，而細(xì)菌回復(fù)突變試驗(yàn)(Amestest)和一項(xiàng)小鼠淋巴瘤細(xì)胞tk基因突變試驗(yàn)(mouselymphomaassay，MLA)是其中的重要組成部分。

與2007年起實(shí)施的《藥物遺傳毒性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》相比，新的指導(dǎo)原則強(qiáng)調(diào)了體內(nèi)遺傳毒性試驗(yàn)的重要性，并明確列出轉(zhuǎn)基因動物體內(nèi)突變試驗(yàn)是體內(nèi)試驗(yàn)的備選?？梢姡蛲蛔?nèi)匀皇沁z傳毒性評價的重要檢測終點(diǎn)。近年來，體內(nèi)Pig-a基因突變試驗(yàn)也在國內(nèi)安全評價領(lǐng)域得到進(jìn)一步推廣。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的飛躍，人們逐漸就基因突變檢測方法的適用性和優(yōu)化形成新認(rèn)識。本文就指導(dǎo)原則中涉及的Ames試驗(yàn)、MLA、Pig-a基因突變試驗(yàn)和轉(zhuǎn)基因動物基因突變試驗(yàn)等的試驗(yàn)原理、優(yōu)勢與局限及最新研究進(jìn)展進(jìn)行闡述。

1 細(xì)菌回復(fù)突變試驗(yàn)

我們所熟知的細(xì)菌回復(fù)突變試驗(yàn)，是由Ames在上世紀(jì)70年代建立并經(jīng)十多年不斷發(fā)展完善形成，俗稱Ames試驗(yàn)。Ames試驗(yàn)利用營養(yǎng)缺陷型菌株在不發(fā)生突變的情況下，只能分裂數(shù)次形成顯微鏡下可見的菌落，而在誘變劑作用下可通過突變自行合成氨基酸，形成肉眼可見的菌落。試驗(yàn)通過對菌落計(jì)數(shù)，來評價受試物的致突變潛力。后期在組氨酸營養(yǎng)缺陷的鼠傷寒沙門氏菌的基礎(chǔ)上又引入了含抗性因子質(zhì)粒及色氨酸營養(yǎng)缺陷的大腸桿菌，進(jìn)一步優(yōu)化了試驗(yàn)的檢測譜和檢測靈敏度。Ames試驗(yàn)流程如圖1所示[3]。

當(dāng)前常用的Ames菌株包括TA97/TA97a、TA98、TAl00、TAl02、TAl04、TA1535、TA1537、WP2uvrA等。不同菌株檢測的突變類型有差異，如TA98和TA1537的檢測對象為移碼型突變，而TA100、TA102、TA1535、WP2uvrA等檢測對象為堿基對置換型突變[4]。因Ames試驗(yàn)方法操作較為簡便、試驗(yàn)周期短，又與化學(xué)物質(zhì)的潛在致癌性評價緊密相關(guān)，故在食品、藥品、化妝品、醫(yī)療器械等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。然而，不同的研究領(lǐng)域?qū)τ诰甑倪x擇也存在一定的差異(表1)。

表1 不同研究領(lǐng)域Ames試驗(yàn)中建議采用的菌株[4]

圖1 Ames試驗(yàn)流程示意圖

盡管Ames試驗(yàn)是基于細(xì)菌試驗(yàn)體系的致突變性評價方法，但它對嚙齒類動物致癌性預(yù)測效果優(yōu)于其他基于哺乳動物細(xì)胞試驗(yàn)體系的遺傳毒性評價方法，可檢出87.5%的恒河猴體內(nèi)致癌物[5]。此外，Ames試驗(yàn)也是化合物構(gòu)效關(guān)系(quantitative structure-activity relationship，QSAR)遺傳毒性篩選數(shù)據(jù)庫構(gòu)建的重要基礎(chǔ)，是環(huán)境誘變劑和新藥研發(fā)初篩的首選遺傳毒性試驗(yàn)方法[6]。盡管Ames試驗(yàn)具有不可替代的優(yōu)勢，但也存在一定短板。例如，大部分中藥受試物為混合物，檢測樣本中可能含有色氨酸或組氨酸，對Ames試驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生影響。而一些具有抗菌功能的醫(yī)療器械產(chǎn)品也不適宜使用Ames試驗(yàn)來評價[7]。又如，有的中藥或納米材料本身顏色較深，可對瓊脂及菌落染色，從而對計(jì)數(shù)結(jié)果的準(zhǔn)確性產(chǎn)生一定影響。此外，使用Ames試驗(yàn)來檢測納米材料的適用性也受到了一定質(zhì)疑[8]：堿性的固態(tài)培養(yǎng)條件，菌壁較厚且攜帶負(fù)電荷的革蘭氏陰性菌均可導(dǎo)致納米材料無法與細(xì)菌充分接觸。馬茂才等[9]研究發(fā)現(xiàn)在有或無添加S9體外代謝活化條件的情況下，2種不同濃度的光催化納米材料對菌株TA97、TA98、TA100和TA102的誘發(fā)回變菌落數(shù)均未超過自發(fā)回變菌落數(shù)的2倍，即均未呈現(xiàn)致突變作用；而受試物在彗星、微核等試驗(yàn)中結(jié)果均為陽性。針對上述困境，有人提出可開展液態(tài)培養(yǎng)條件下酸化處理過的“波動Ames試驗(yàn)”，通過增加細(xì)菌對納米材料的吞噬來提高檢出率[10]。

作為最可靠的遺傳毒性評價方法，科研人員長期以來對Ames試驗(yàn)方法進(jìn)行了各種優(yōu)化和改進(jìn)，從而更好地發(fā)揮其長處?；?孔板(mini-Ames)和24孔板(micro-Ames)的Ames試驗(yàn)可有效減少受試物的用量，僅為標(biāo)準(zhǔn)平皿(10 cm2)的1/5和1/20。研究提示mini-Ames與標(biāo)準(zhǔn)平皿Ames試驗(yàn)結(jié)果的一致性可達(dá)95%～98%，可很好地應(yīng)用于藥物遺傳毒性早期的快速篩選[11]。“高通量”是現(xiàn)代毒理學(xué)研究的關(guān)鍵詞，除96板和384孔板液態(tài)培養(yǎng)及顯色的“波動Ames試驗(yàn)”和Ames II以外，Ames試驗(yàn)也通過構(gòu)建含熒光報(bào)告基因質(zhì)粒來實(shí)現(xiàn)高通量化[12]。經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織(Organization for Economic Co-operation and Development，OECD)的藥物遺傳毒性試驗(yàn)Ames試驗(yàn)指導(dǎo)原則于1997年首次發(fā)布，當(dāng)前OECD正在收集基于微孔板(含6孔、24孔、96孔及384孔)Ames試驗(yàn)的背景數(shù)據(jù)及試驗(yàn)操作細(xì)節(jié)，用于進(jìn)行指導(dǎo)原則更新，從而使這項(xiàng)經(jīng)典試驗(yàn)更好地服務(wù)于監(jiān)管和安全評價領(lǐng)域。

2 小鼠淋巴瘤細(xì)胞基因突變實(shí)驗(yàn)

以哺乳動物為試驗(yàn)體系的MLA是以tk基因突變?yōu)闄z測終點(diǎn)的試驗(yàn)方法。tk基因編碼的胸苷激酶(thymidine kinase，TK)在無突變時可通過將胸苷或其類似物如三氟胸苷(trifluorothymidine，TFT)整合入DNA序列導(dǎo)致DNA的失活和細(xì)胞死亡，而突變后的tk基因則無法將TFT整合進(jìn)入DNA。因此，可通過檢測細(xì)胞在給予TFT后的存活率，來檢測是否存在致突變劑[13]。常用的試驗(yàn)方法包括軟瓊脂法和微孔法，兩者對比見表2，微孔法在醫(yī)療器械及藥物安全評價研究中較為常用。

表2 軟瓊脂法和微孔法優(yōu)缺點(diǎn)比較[14]

MLA可以克服Ames試驗(yàn)的某些缺陷，當(dāng)Ames試驗(yàn)不適用時，是備選的基因突變評價方法。如國內(nèi)醫(yī)療器械遺傳毒性評價標(biāo)準(zhǔn)(GB/T 16886.3-2008)中將哺乳動物細(xì)胞基因突變試驗(yàn)(多為MLA)明確列入遺傳毒性評價必選項(xiàng)目中。對于具有殺菌或者抑菌作用的醫(yī)療器械產(chǎn)品，哺乳動物細(xì)胞基因突變試驗(yàn)的結(jié)果更有價值。然而也有文獻(xiàn)指出[15]，Ames試驗(yàn)和體外微核試驗(yàn)兩項(xiàng)已足夠用于預(yù)測嚙齒類動物致癌性和體內(nèi)遺傳毒性，在兩者的基礎(chǔ)上增加MLA后，檢出率僅從78%(316/405)提高至79.5%(322/405)。此外，tk基因自身存在tk+/+，tk+/-及tk-/-等多個基因型，在進(jìn)行致突變研究之前，應(yīng)對所需的基因型進(jìn)行篩選，確保試驗(yàn)中所用的細(xì)胞表達(dá)目的基因型(即tk+/-)。

檢測tk基因突變使用的細(xì)胞株包括小鼠淋巴瘤L5178Y以及人類淋巴母細(xì)胞TK6以及TK-E6等，MLA是以小鼠淋巴瘤L5178Y細(xì)胞為試驗(yàn)體系。與tk基因突變有相似之處的hprt基因突變是以hprt作為突變檢測位點(diǎn)進(jìn)行的哺乳動物細(xì)胞體外遺傳毒性檢測試驗(yàn)方法。hprt基因編碼的次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(hypoxanthine guanine phosphoribosyl transferase，HPRT)參與細(xì)胞內(nèi)嘌呤補(bǔ)救代謝途徑，自身的缺乏或活性降低會引起核酸代謝異常，在無突變時可將嘌呤或其類似物如6-硫鳥嘌呤(6-Thioguanine，6-TG)整合入DNA序列，而導(dǎo)致DNA的失活及細(xì)胞死亡，而當(dāng)hprt基因突變后則無法將6-TG整合進(jìn)入DNA，根據(jù)此原理來檢測hprt基因是否存在突變。張勇等[16]對TK6和TK-E6細(xì)胞tk和hprt基因突變進(jìn)行了比較，其中將TK6和TK-E6兩種細(xì)胞相比較：TK6-E6細(xì)胞的tk突變試驗(yàn)敏感性高，兩種細(xì)胞在hprt位點(diǎn)敏感性一致。然而，不同細(xì)胞或者同一種細(xì)胞tk位點(diǎn)的突變敏感性均較hprt位點(diǎn)突變敏感性高，這主要與tk基因和hprt基因自身特點(diǎn)不同有關(guān)(表3)。有研究分別就L5178Y細(xì)胞與CHO細(xì)胞的tk基因突變試驗(yàn)和hprt基因突變試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行對比，也得到一致結(jié)論[17]。OECD于2015年新增了TG490體外哺乳動物細(xì)胞tk基因突變試驗(yàn)，并新修訂頒布了TG476體外哺乳動物細(xì)胞hprt和xprt基因突變試驗(yàn)。hprt基因的自發(fā)突變頻率較低但特異性高，可與tk基因突變形成互補(bǔ)。

表3 tk基因突變與hprt基因突變的比較[17-18]

3 Pig-a基因突變試驗(yàn)

使用正常動物開展的體內(nèi)Pig-a基因突變試驗(yàn)，是近年來逐漸走入安全評價領(lǐng)域并受到廣泛重視的一項(xiàng)致突變性評價方法。位于人X染色體上的Pig-a基因發(fā)生突變時，可導(dǎo)致糖化磷脂酰肌醇(glycosylphos-phatidyl inositol，GPI)合成障礙，并進(jìn)一步使細(xì)胞GPI錨蛋白缺失(圖2[19])。Araten等[20]于1999年提出可以Pig-a基因作為報(bào)告基因建立體內(nèi)基因突變試驗(yàn)方法，并逐漸將此方法推向臨床前遺傳毒性評價。由于GPI錨在不同物種間的生物合成高度保守，而且其合成起源于骨髓干細(xì)胞，在各類組織細(xì)胞及各類成熟紅細(xì)胞中均有表達(dá)，因此，理論上Pig-a基因突變試驗(yàn)可在不同動物種屬和不同類型組織中開展。但由于具體實(shí)體組織在進(jìn)行單細(xì)胞懸液的制備過程中，會引起細(xì)胞表面重要靶蛋白的缺失或結(jié)構(gòu)的異常，故試驗(yàn)中采用外周血為主要檢測對象。體內(nèi)Pig-a基因突變試驗(yàn)常用的檢測方法主要包括流式細(xì)胞術(shù)檢測法和有限稀釋克隆法。流式細(xì)胞術(shù)方法利用Pig-a基因發(fā)生突變后細(xì)胞表面GPI錨合成異常，導(dǎo)致細(xì)胞表面錨鏈蛋白(如CD48、CD55、CD59等)缺失，從而可利用熒光標(biāo)記GPI錨鏈蛋白以區(qū)分突變細(xì)胞與正常細(xì)胞，并使用另外一種熒光標(biāo)記抗體和(或)流式設(shè)門策略將不同細(xì)胞群區(qū)分，來檢測目標(biāo)細(xì)胞群中突變細(xì)胞的數(shù)量。而有限稀釋克隆法利用細(xì)菌原毒素氣單胞菌溶素前體(proaerolysin，ProAER)可通過直接與正常細(xì)胞的GPI錨(而不是錨鏈蛋白)特異性結(jié)合誘導(dǎo)細(xì)胞膜完整性受損以致細(xì)胞死亡。存在Pig-a基因突變的細(xì)胞表面無法正常合成GPI錨時，氣單胞菌溶素?zé)o法與GPI錨特異性結(jié)合，細(xì)胞得以存活；反之，Pig-a基因突變可致細(xì)胞死亡。Pig-a基因突變試驗(yàn)運(yùn)用了上述試驗(yàn)原理對受試物誘導(dǎo)基因突變的潛力進(jìn)行檢測[21]。Dertinger等[22]在國際聯(lián)合驗(yàn)證過程中進(jìn)一步將高通量免疫磁性篩選技術(shù)高通量方法引入Pig-a基因突變試驗(yàn)，從而有效提高了細(xì)胞分析的數(shù)量與統(tǒng)計(jì)功效。

圖2 Pig-a基因突變原理示意圖

體內(nèi)Pig-a基因突變試驗(yàn)的靈敏性和特異性已得到驗(yàn)證。一項(xiàng)41種化合物的大鼠Pig-a基因突變試驗(yàn)驗(yàn)證數(shù)據(jù)顯示，大部分預(yù)期在試驗(yàn)中呈現(xiàn)陽性反應(yīng)的受試物均可導(dǎo)致Pig-a基因突變[23]。除直接與DNA反應(yīng)的烷化劑外，需經(jīng)體內(nèi)代謝活化后的遺傳毒性陽性化合物，如2-乙酰氨基芴(2-acetylaminofluorene，2-AAF)、馬兜鈴酸(aristolochic acids，AAs)、環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide，CY)、二乙基亞硝胺(diethylnitrosamine，DEN)、苯并[a]芘(benzo[a]pyrene，B[a]P)和7,12-二甲基苯并[a]蒽(7,12-dimethylbenz[a]anthracene，DMBA)等也可在Pig-a基因突變試驗(yàn)中獲得陽性結(jié)果[24-25]。此外，Pig-a基因突變試驗(yàn)對于鹽酸哌醋甲酯(methylphenidate hydrochloride，MPH)和芘(pyrene，Pyr)等非遺傳毒性化合物也呈現(xiàn)較好的特異性。該方法有望成為體內(nèi)試驗(yàn)中第二個遺傳學(xué)終點(diǎn)檢測的候選。流式法檢測Pig-a基因突變較為簡便，該方法以外周血為監(jiān)測窗，除在臨床前研究中更適合與重復(fù)給藥毒性試驗(yàn)結(jié)合外，在職業(yè)暴露人群的環(huán)境誘變劑監(jiān)測和臨床抗腫瘤治療療效動態(tài)監(jiān)測方面也有重要的應(yīng)用價值[26]。然而，因體內(nèi)Pig-a試驗(yàn)通常使用外周血開展，當(dāng)受試物(如某些納米材料)具有特殊的體內(nèi)代謝動力學(xué)特征時，外周血的濃度不能代表其組織分布濃度，此時Pig-a基因突變試驗(yàn)的選擇應(yīng)謹(jǐn)慎。當(dāng)前體內(nèi)Pig-a基因突變試驗(yàn)指導(dǎo)原則的確立也列入了OECD的工作日程，計(jì)劃于2020年正式發(fā)布。

近年來，以人類B淋巴細(xì)胞樣細(xì)胞系TK6、MCL-5以及L5178Y等哺乳動物細(xì)胞系開展的Pig-a基因突變試驗(yàn)也取得了一些進(jìn)展。當(dāng)Ames試驗(yàn)結(jié)果不明確時，可選擇體外Pig-a基因突變試驗(yàn)作為后續(xù)選擇。研究[27]提示，使用不同細(xì)胞系開展體外Pig-a基因突變試驗(yàn)的結(jié)果可存在一定差異(不同細(xì)胞系自發(fā)突變率不同)。Krüger等[28]指出TK6細(xì)胞系在未處理的對照細(xì)胞中顯示GPI(-)自發(fā)突變率較高，檢測前需對GPI(-)進(jìn)行清除以降低背景值。常規(guī)用于開展MLA的小鼠淋巴瘤細(xì)胞系L5178Y也可用于Pig-a基因突變試驗(yàn)，該細(xì)胞的自發(fā)突變率低于TK6細(xì)胞，這與TK6細(xì)胞中Pig-l基因的缺失有關(guān)。另外，也可收集經(jīng)受試物處理的細(xì)胞克隆的Pig-a mRNA進(jìn)行測序，來分析GPI(-)受試物作用后產(chǎn)生的基因突變特點(diǎn)。文獻(xiàn)報(bào)道，L5178Y細(xì)胞經(jīng)EMS處理后對其Pig-a mRNA進(jìn)行測序，其突變特點(diǎn)主要表現(xiàn)為C-T轉(zhuǎn)換，與文獻(xiàn)報(bào)道相符[27，29]。體外Pig-a基因突變試驗(yàn)具有周期長(一般采用受試物處理后表達(dá)8 d進(jìn)行檢測)、不使用動物和適于進(jìn)行機(jī)制研究的優(yōu)勢，但在正式走進(jìn)安全評價領(lǐng)域之前，在細(xì)胞選擇和標(biāo)準(zhǔn)化試驗(yàn)方法的驗(yàn)證等方面還需要開展大量工作。

4 轉(zhuǎn)基因動物試驗(yàn)

體內(nèi)遺傳毒性試驗(yàn)的優(yōu)點(diǎn)在于它的檢測內(nèi)容涵蓋受試物進(jìn)入體內(nèi)并發(fā)揮作用的全程，可較好地模擬藥物在機(jī)體內(nèi)吸收、分布、排泄、代謝并產(chǎn)生毒性的過程。轉(zhuǎn)基因嚙齒動物基因突變模型作為經(jīng)典的體內(nèi)遺傳毒性評價方法至今已有二十多年的歷史。該方法突破了體內(nèi)遺傳毒性評價方法僅使用造血組織為檢測終點(diǎn)的局限，可就肝、腎等不同組織的基因突變進(jìn)行檢測，對受試物的體內(nèi)基因突變靶組織進(jìn)行有效預(yù)測?？缮虡I(yè)購買到的模型包括轉(zhuǎn)基因小鼠MutaTMMouse和BigBlue等，這兩種轉(zhuǎn)基因嚙齒動物模型均基于λ噬菌體體外包裝原理。兩者分別以lacZ和lacI為靶基因并使用轉(zhuǎn)基因小鼠作為轉(zhuǎn)基因受體，動物給予受試物后，通過分離不同組織來檢測相應(yīng)基因的突變率(圖3[30])。OECD已于2011年頒布了TG488轉(zhuǎn)基因動物突變試驗(yàn)的指導(dǎo)原則，然而因轉(zhuǎn)基因動物成本較高，較大程度上限制了其應(yīng)用范圍。

圖3 轉(zhuǎn)基因動物示意圖

國內(nèi)已使用轉(zhuǎn)基因動物對馬兜鈴酸的遺傳毒性及其致突變特性進(jìn)行評價。欒洋等[31]使用LC-ESI-MS-MS和gpt delta轉(zhuǎn)基因小鼠來確定腎臟中馬兜鈴酸I(aristolochic acid I，AAI)和馬兜鈴酸II(AAII)誘導(dǎo)的gpt基因DNA加合物的突變頻率以及它們各自的突變譜特征，結(jié)果顯示，溶劑對照組腎臟中g(shù)pt基因的自發(fā)突變率為2.37×10-6；AAI 1 mg/kg組(6.67×10-6)和AAI 5 mg/kg組的gpt基因突變率(16.72×10-6)分別比溶劑對照組高2.8和7.0倍；AAII 1 mg/kg組gpt基因的突變率(9.54×10-6)和AAII 5 mg/kg組(32.00×10-6)分別比溶劑對照組高4.0和13.5倍；5 mg/kg時AAII誘導(dǎo)的突變率幾乎是AAI誘導(dǎo)的兩倍。

此外，轉(zhuǎn)基因嚙齒動物培養(yǎng)細(xì)胞突變試驗(yàn)也成為相應(yīng)體內(nèi)致突變性試驗(yàn)可行的替代方法。如使用從C57BL/6或B6C3F1遺傳背景的BigBlue小鼠胚胎中分離的原代小鼠胚胎成纖維細(xì)胞或從轉(zhuǎn)基因BigBlue動物各種組織/器官制備的原代細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞突變試驗(yàn)。因該方法使用原代組織細(xì)胞開展，非常適用于可疑誘變劑的初始測試[32]。

5 小結(jié)

隨著新型藥物的涌現(xiàn)以及對藥物評價試驗(yàn)要求的不斷提高，傳統(tǒng)的試驗(yàn)體系也歷經(jīng)了一系列優(yōu)化。然而，不同的致突變新檢測方法對不同檢測品種的適用性及其優(yōu)勢和局限不盡相同(表4)。本文就臨床前安全性評價領(lǐng)域常用的，尤其是新版《藥物遺傳毒性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》涉及的基因突變評價方法及研究進(jìn)展進(jìn)行總結(jié)，以期為相關(guān)科研及安全評價工作者提供借鑒。

表4 不同遺傳毒性致突變檢測方法的比較