王 蘭，張永東，郭紅云，王 濤，王海濤，郭 歡，楊碎勝，李曉琴，蘇海翔，*

(1．甘肅省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究中心，甘肅 蘭州 730050；2．甘肅省腫瘤醫(yī)院乳腺腫瘤外科，甘肅 蘭州 730050；3．甘肅省腫瘤醫(yī)院病理診斷中心，甘肅 蘭州 730050)

乳腺癌是女性發(fā)病率最高的癌癥，也是女性癌癥的主要死亡原因[1]。研究表明環(huán)境因素和生活方式可能導(dǎo)致乳腺癌或增加罹患乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)[2]，但也有研究發(fā)現(xiàn)，某些基因的多態(tài)性與乳腺癌的發(fā)病相關(guān)[3]。文獻(xiàn)報(bào)告，XRCC3基因多態(tài)性在歐洲、中亞等婦女中與乳腺癌發(fā)病有相關(guān)性[4-5]。因此，我們選擇XRCC3基因研究其與中國西北地區(qū)婦女乳腺癌發(fā)病的相關(guān)性，近年來的研究顯示，非編碼區(qū)的內(nèi)含子在基因復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯過程中也扮演著重要的角色[6]，但這些區(qū)域內(nèi)的基因多態(tài)性位點(diǎn)與乳腺癌的相關(guān)性報(bào)道較少。

本研究選取XRCC3基因位于啟動子區(qū)域的4個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)rs861534、rs861537、rs3212092、rs861530進(jìn)行研究，擬通過檢測XRCC3多態(tài)性位點(diǎn)的基因型與乳腺癌風(fēng)險(xiǎn)之間的關(guān)系，探討XRCC3基因位點(diǎn)與中國西北地區(qū)婦女乳腺癌發(fā)生的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 研究人群

選取517例診斷為乳腺浸潤性導(dǎo)管癌和其他分型的乳腺癌的患者，均為西北地區(qū)的漢族婦女，于2010年12月—2012年6月期間在甘肅省腫瘤醫(yī)院就診，所有的病例具有完整的臨床資料和病理診斷資料，無其他癌癥及乳腺癌家族史；另選取1 008例來自相同地區(qū)、年齡匹配的癌癥篩查項(xiàng)目中健康體檢人員作為空白對照組，空白對照組人員均被臨床證實(shí)無乳腺癌和乳腺良性腫瘤疾病及腫瘤家族史；所有參與者已閱讀并簽署了知情同意書；研究內(nèi)容通過了甘肅省腫瘤醫(yī)院倫理委員會審查。

1.2 儀器及試劑

采用QuantStudioTM12k Flex Real-Time PCR System購于美國ABI公司，恒溫水浴箱購于長風(fēng)醫(yī)療器械廠，HZQ-C空氣浴振蕩器及NANODROP 2000均購于美國Thermo公司，小量全血基因DNA提取試劑盒購于北京百泰生物技術(shù)有限公司。熒光標(biāo)記引物，DNA芯片和相應(yīng)軟件系統(tǒng)，質(zhì)控探針和PCR實(shí)驗(yàn)試劑均由ABI生物技術(shù)中國有限公司提供。EnVision兩步法免疫組化試劑盒，購自福州邁新公司。

1.3 DNA提取

對全部病例及正常體檢人群各采集5 mL全血。按照全血DNA試劑盒提取步驟，抽提得到DNA，測定DNA濃度及D(260)/D(280)值，選用DNA濃度為50～100 ng/μL，D(260)/D(280)值為1.7～2.10的樣本，-80 ℃保存、備用。

1.4 基因分型研究

采用高通量基因芯片技術(shù)，將PCR引物和探針預(yù)先嵌入在基因芯片中，每個(gè)芯片含有1 074位點(diǎn)，使用TaqMan OpenArray QuantStudio TM 12 k Flex測定基因芯片。①上樣芯片制備：將2.0μL樣本DNA和2.0μL反應(yīng)液充分混合后，加入到384孔板中，再由配套的上樣儀，將混合液添加到基因芯片的中，封蓋，并加入專用油滴封閉加樣口。②基因芯片模塊創(chuàng)建：按照TaqMan軟件操作程序，創(chuàng)建運(yùn)行文庫和芯片文件庫。③運(yùn)行芯片模塊：將制備好的基因芯片放入TaqMan OpenArray QuantStudio TM 12 k Flex中，打開芯片文庫中對應(yīng)的文件，運(yùn)行程序，對芯片上每個(gè)微孔中的反應(yīng)液進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，然后測定反應(yīng)結(jié)果。④結(jié)果分析：芯片運(yùn)行結(jié)束，根據(jù)TaqMan芯片分析軟件，將該張芯片基因分型結(jié)果輸出為散點(diǎn)圖及相應(yīng)數(shù)據(jù)，再由ABI軟件系統(tǒng)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)束，按照1%比率隨機(jī)選擇樣本DNA測序技術(shù)分析，驗(yàn)證基因芯片結(jié)果。

1.5 乳腺癌相關(guān)臨床病理學(xué)指標(biāo)檢測

E R、P R、P53、KI67受體采用免疫組織Envision法進(jìn)行化學(xué)法檢測；免疫組化染色評定依據(jù)2010年美國臨床腫瘤學(xué)會(ASCO)/美國病理學(xué)家協(xié)會(CAP)評分系統(tǒng)。＞50%的細(xì)胞染色為強(qiáng)陽性(+++)，＞25%～50%的細(xì)胞染色為中等陽性(++)，＞1%～25%的細(xì)胞染色為弱陽性(+)，≤1%細(xì)胞染色為陰性(-)。Her-2受體采用免疫熒光原位雜交(FISH)與免疫組化相結(jié)合的方法進(jìn)行檢測；參照中國抗癌協(xié)會乳腺癌診治指南中標(biāo)準(zhǔn)：細(xì)胞重度的全細(xì)胞膜染色＞10%為陽性(+++)，＞10%的細(xì)胞輕至中度的全細(xì)胞膜染色為陽性(++)，＞10%的細(xì)胞輕度的全細(xì)胞膜染色或＜10%細(xì)胞膜染色為陰性(-)；若免疫熒光原位雜交檢測為陰性，則確定Her-2為陰性，若FISH檢測顯示陽性，則定義Her-2為陽性。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)，以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)；使用多因素Logistic回歸法分析SNP等位基因和基因型，病例組和對照組分別進(jìn)行評估。多因素Logistic回歸計(jì)算比值比(odds ratios，OR)及其95%可信區(qū)間(confidence intervals，CI)，分析各基因型與乳腺癌發(fā)生的易感性及相關(guān)性；計(jì)數(shù)資料采用卡方檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 XRCC3單個(gè)基因多態(tài)性與乳腺癌風(fēng)險(xiǎn)分析

對所有樣本進(jìn)行基因型分型(見圖1、2)，經(jīng)卡方檢驗(yàn)，XRCC3各基因型頻率的偏差符合Hardy-Weinberg equilibrium(HWE)定律(見表 1)。對 XRCC3 的4個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)的基因型和等位基因進(jìn)行比較研究，結(jié)果顯示XRCC3 rs861534位點(diǎn)的AG/AA基因型，乳腺癌組與對照組比較分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01，P＜0.05)。Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)，乳腺癌組中AG/AA基因型與對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[OR=0.36，95%CI(0.27， 0.50)； OR=0.08， 95%CI(0.01， 0.58)]，同時(shí)，GG+AG基因型與對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[P＜0.01，OR=2.91，95%CI(2.17，3.89)]，AG+AA基因型與對照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[P=0.02，OR=10.66、95%CI(1.42，79.99)]；rs861534位點(diǎn)單基因比較可知，乳腺癌A基因攜帶者與對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[P＜0.01，OR=0.37，95%CI(0.28，0.49)]。研究發(fā)現(xiàn)XRCC3 rs861530位點(diǎn)的Logistic回歸分析顯示AG+AA基因型與對照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[P=0.044，OR=0.78，95%CI(0.62，0.99)](見表2)。研究中沒有發(fā)現(xiàn)XRCC3 rs861537和XRCC3 rs3212092兩個(gè)位點(diǎn)各基因型與對照組有明顯差異。

圖1 基因芯片結(jié)果分析圖

圖2 芯片位點(diǎn)圖

表1 XRCC3各位點(diǎn)基因型Hardy-Weinberg平衡檢測

表2 XRCC3基因多態(tài)性與乳腺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)性研究

2.2 XRCC3基因多態(tài)性與癌組織中乳腺癌相關(guān)臨床病理學(xué)指標(biāo)表達(dá)的分析

乳腺癌相關(guān)臨床病理學(xué)指標(biāo)雌激素受體(ER)、孕激素受體(PR)、人類表皮生長因子受體(Her-2)、P53、KI67，在乳腺癌治療和復(fù)發(fā)用藥選擇時(shí)具有重要的參考價(jià)值。本研究通過對乳腺癌患者各基因型與相關(guān)臨床病理學(xué)指標(biāo)分析顯示，在乳腺癌患者中rs861537多態(tài)性位點(diǎn)AA、AG、GG三種基因型攜帶者在ER陽性與陰性蛋白中分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；但Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)rs861537位點(diǎn)的GG+AG基因型ER蛋白陽性與陰性分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[P=0.048，OR=1.50，95%CI(1.00，2.23)]；對于其他rs861534、rs861530、rs3212092三個(gè)位點(diǎn)的ER+與ER-蛋白表達(dá)與各基因型比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見表3)。在rs3212092多態(tài)性位點(diǎn)，Logistic回歸分析顯示CT基因型癌組織中，Her-2-與Her-2+蛋白表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.049)，CC+CT基因型癌組織中亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[P=0.027，OR=2.06，95%CI(1.08，3.90)]。對于其他3個(gè)位點(diǎn)：rs861534、rs861530、rs861537各基因型癌組織的Her-2+與Her-2-蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見表4)。研究顯示XRCC3 rs861534、rs861537、rs3212092及rs861530四個(gè)位點(diǎn)各基因型與PR、P53、KI67等乳腺癌相關(guān)臨床病理學(xué)指標(biāo)無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表3 XRCC3基因多態(tài)性與ER相關(guān)性研究

3 討論

大量存在的SNP位點(diǎn)，使人們有機(jī)會發(fā)現(xiàn)與各種疾病相關(guān)聯(lián)，包括腫瘤相關(guān)的基因突變[7]；對基因SNP位點(diǎn)的研究可用于高危群體的發(fā)現(xiàn)、疾病相關(guān)基因的鑒定、藥物的設(shè)計(jì)和測試以及生物學(xué)的基礎(chǔ)研究等[8]。

暴露于同樣的危險(xiǎn)因素的個(gè)體患乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)卻不相同，說明個(gè)體遺傳背景不同導(dǎo)致了易感性的差異性[9]；流行病學(xué)研究也表明，基因多態(tài)性與乳腺癌的患病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)[10]。研究報(bào)道顯示XRCC3基因多態(tài)性與乳腺癌的發(fā)病密切相關(guān)[11]；在2002和2004年，英美的學(xué)者研究報(bào)道XRCC3 rs861539位點(diǎn)純合子AA基因型與歐美地區(qū)婦女的乳腺癌發(fā)病具有高度風(fēng)險(xiǎn)性[12-13]；隨后的研究證實(shí)與大多數(shù)亞洲婦女乳腺癌發(fā)病也具有相關(guān)性[14]。最近的數(shù)據(jù)表明XRCC3 rs1799794可略微增加女性的純合子等位基因的乳腺癌患病風(fēng)險(xiǎn)[11]。研究證實(shí)XRCC3 rs1799794、rs1799796多態(tài)性位點(diǎn)與沙特婦女乳腺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)明顯相關(guān)，但與其他地區(qū)婦女乳腺癌發(fā)病無相關(guān)性[15]。

表4 XRCC3基因多態(tài)性與Her-2相關(guān)性研究

DNA修復(fù)機(jī)制可防止癌基因激活，糾正在DNA復(fù)制過程中的基因缺失、插入等，通過DNA損傷修復(fù)機(jī)制可維護(hù)基因的穩(wěn)定性，在預(yù)防DNA復(fù)制過程中引起的基因癌變發(fā)揮了重要作用[16]。研究表明，大多數(shù)家族集聚類乳腺癌是遺傳因素的結(jié)果；同卵雙胞胎與異卵雙胞胎比較，同卵雙胞胎姐妹乳腺癌發(fā)病率明顯較高；這一現(xiàn)象可以解釋為一些特定的基因突變，引起帶來疾病的罹患風(fēng)險(xiǎn)增加[17]。由此可知，乳腺癌的發(fā)病最主要是由于基因型的不同，而不是生活方式或環(huán)境因素引起。

雌激素受體(ER)是乳腺中正常的激素受體，當(dāng)乳腺上皮細(xì)胞發(fā)生癌變時(shí)，ER將會部分或全部缺失，如檢測到腫瘤組織中有ER表達(dá)，則表明腫瘤細(xì)胞可以接受內(nèi)分泌調(diào)節(jié)，因此可以采取內(nèi)分泌治療，對臨床治療及預(yù)后評價(jià)具有指導(dǎo)價(jià)值[18]。研究顯示，在浸潤性乳腺癌組織和轉(zhuǎn)移的腋下淋巴結(jié)中均可見Her-2蛋白的高表達(dá)，表明Her-2的高表達(dá)與乳腺癌患者的無病存活期及腫瘤復(fù)發(fā)高度相關(guān)聯(lián)[19]；Her-2被認(rèn)為是判斷乳腺癌患者預(yù)后和分子靶向治療的關(guān)鍵性標(biāo)志物[20]。

研究表明，XRCC3是中國北方婦女乳腺癌的易感性基因[21]，本研究也顯示兩個(gè)SNP位點(diǎn)對乳腺癌具有潛在的致病風(fēng)險(xiǎn)；在本研究收集的乳腺癌患者樣本中我們觀察到，在XRCC3基因4個(gè)位點(diǎn)rs861534、rs861537、rs3212092、rs861530中，rs861534位點(diǎn)攜帶GG/AG基因型和rs861530位點(diǎn)具有AG/AA基因型者，其罹患乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)較高；對于這兩個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)與乳腺癌風(fēng)險(xiǎn)性關(guān)系，以前文獻(xiàn)中還沒有相關(guān)報(bào)道。其他XRCC3基因位點(diǎn)rs861537、rs3212092與乳腺癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)無相關(guān)性。我們還比較了乳腺癌患者的相關(guān)臨床病理學(xué)指標(biāo)與各位點(diǎn)基因型的關(guān)聯(lián)性，結(jié)果表明，乳腺癌組織中雌激素受體(ER)表達(dá)陽性和陰性的患者相比較，在XRCC3 rs861537位點(diǎn)GG/AG基因型的ER-與ER+患者具有微小的差別，提示ER+的乳腺癌患者攜帶者GG/AG基因型可能具有較高的內(nèi)分泌治療風(fēng)險(xiǎn)，預(yù)后較差；在rs3212092位點(diǎn)，與Her-2-蛋白表達(dá)患者相比較，Her-2+表達(dá)患者并攜帶CT和TT基因型，預(yù)后不良，并具有明顯復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)，在以后的分子靶向治療中也不會獲益；另外，Her-2蛋白高表達(dá)的腫瘤多同步伴隨p53基因的突變，在腫瘤耐藥性方面具有協(xié)同作用，對患者的病情、預(yù)后及化療效果有負(fù)面影響[22]。

在此后研究中，我們還將進(jìn)行其他堿基修復(fù)基因，如APEX1、MUTYH、OGG1等基因的分析研究，擴(kuò)大樣本量，并且進(jìn)一步收集入選的患者及健康人其他信息，如生活環(huán)境、生活習(xí)慣等其他信息，進(jìn)行分層分析，并對不同位點(diǎn)和基因間進(jìn)行交互關(guān)系和關(guān)聯(lián)研究，以及功能學(xué)的研究，尋找西北地區(qū)與乳腺癌易感性相關(guān)的易感基因型，并將其作為西北婦女特有的分子標(biāo)志物用于篩選高危和易感人群，為實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)醫(yī)療、個(gè)體預(yù)防和治療提供科學(xué)依據(jù)。