徐慧靜，劉 萍，崔立遷，牛建娜

(1.天津市食品安全檢測(cè)技術(shù)研究院，天津 300308；2.天津市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢測(cè)技術(shù)研究院，天津 300384)

圖1 環(huán)戊烷多氫菲核Fig.1 Cyclopentane polyhydrophenanthrene

甾體化合物被譽(yù)為“生命的鑰匙”，可調(diào)節(jié)人體糖代謝、脂肪代謝、蛋白質(zhì)合成、礦物質(zhì)代謝及性功能[4]。甾體化合物具有分子量小、脂溶性大的特點(diǎn)，使其易于進(jìn)入細(xì)胞并產(chǎn)生一系列生理變化，因此，甾體化合物具有成為藥物的自然屬性[5]。在臨床上，腎上腺皮質(zhì)激素是治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、支氣管哮喘、結(jié)締組織病變和濕疹等疾病的首選藥物[6]。此外，甾體激素還具有保健的生理功能，如改善蛋白質(zhì)代謝、抗肥胖、恢復(fù)和增強(qiáng)體力、預(yù)防冠心病及利尿降壓等[7]。近年來(lái)，甾體藥物的應(yīng)用范圍快速擴(kuò)大，在治療細(xì)菌性腦炎、淋巴母細(xì)胞白血病、人體器官移植、預(yù)防艾滋病毒(HIV)的傳染和治療內(nèi)分泌疾病等方面也有相應(yīng)用途[8]。甾體激素類藥物現(xiàn)已廣泛應(yīng)用成為臨床上僅次于抗生素的第二大類藥物。

隨著人們對(duì)甾體藥物的不斷研究，甾體藥物的高效合成具有非常重要的價(jià)值和意義。與化學(xué)合成相比，甾體藥物的生物轉(zhuǎn)化具有如下的特點(diǎn)：①步驟少，周期短；②收率高，副產(chǎn)物少；③專一化強(qiáng)，快速精確地實(shí)現(xiàn)化學(xué)法難完成的反應(yīng)；④立體選擇性和區(qū)域選擇性好；⑤綠色安全，無(wú)環(huán)境污染，條件溫和。目前生物合成已經(jīng)成為工業(yè)上合成甾體藥物的重要途徑。在甾體藥物的生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)過(guò)程中，微生物幾乎能在甾體化合物的各個(gè)位點(diǎn)發(fā)生作用，包括甾體母核、C18和C19的兩個(gè)角甲基及其側(cè)鏈(圖2)。

圖2 甾體化合物的主要生物轉(zhuǎn)化位點(diǎn)Fig.2 Major sites of biotransformation reactions for steroids

植物甾醇是我國(guó)類固醇藥物合成的主要原料，且來(lái)源廣泛。精煉油脂廢渣可作為工業(yè)化生產(chǎn)類固醇藥物的原料，既可提供充分來(lái)源又可變廢為寶，減輕環(huán)境污染。甾體化合物的微生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)類型[9]如表1所示。甾醇的微生物降解過(guò)程中存在三方面的問(wèn)題：①甾醇疏水性強(qiáng)，分散性差，在水溶液中溶解度低；②甾醇核的降解，產(chǎn)物的進(jìn)一步降解以及作為微生物利用碳源的甾醇核B環(huán)的自發(fā)破壞作用；③產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞的毒性作用。如果甾醇以粉末投料會(huì)影響甾醇的利用率，且甾醇微生物降解酶是胞內(nèi)酶，所以在甾醇使用前，需要將甾醇通過(guò)相應(yīng)的媒介擴(kuò)散到細(xì)胞中方能被利用。因此，提高甾體轉(zhuǎn)化率的研究主要集中在兩個(gè)方面：一是使用細(xì)胞固定化技術(shù)或不同的反應(yīng)過(guò)程來(lái)改善類甾體底物的水溶性，提高水相中甾體底物的傳質(zhì)效率；二是利用現(xiàn)代生物技術(shù)轉(zhuǎn)化用于生物轉(zhuǎn)化的微生物，提高酶的活性，提高酶反應(yīng)的選擇性[10-11]。

表1 甾體化合物的微生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)類型[9]

1 甾體化合物的微生物轉(zhuǎn)化

1.1 微生物轉(zhuǎn)化法的研究

皮質(zhì)激素是第一個(gè)微生物轉(zhuǎn)化的甾體藥物，它的轉(zhuǎn)化是生物轉(zhuǎn)化的里程碑，開(kāi)創(chuàng)了微生物轉(zhuǎn)化甾體化合物的先河。早在1952年P(guān)eterson等利用Rhizopusnigricans中的羥化酶成功的生物轉(zhuǎn)化黃體酮[12]，在C11位上引入11α-OH，轉(zhuǎn)化率高且專一性強(qiáng)，克服了皮質(zhì)激素合成中難以引入11α-OH的困難，實(shí)現(xiàn)了化學(xué)方法難以實(shí)現(xiàn)的反應(yīng)。Patrice等分別對(duì)可的松與潑尼松進(jìn)行了3種真菌的生物轉(zhuǎn)化[13]，結(jié)果表明，氧孢鐮刀菌UAMH9013中可能存在C7和C15羥化酶。而將這些甾體化合物作為ExophialajeanselmeUAMH 8783的底物，結(jié)果顯示該真菌中存在高活性的5α和14α羥基化酶，同時(shí)具有氧化烯丙基的能力。CeratocystisparadoxaUAMH 8784對(duì)上述甾體化合物進(jìn)行轉(zhuǎn)化，結(jié)果顯示單氧酶影響烯丙基的羥基化并且具有BV氧化重排的活性，然而，氧化還原反應(yīng)起主導(dǎo)作用。Restaino等[14]利用玫瑰產(chǎn)色鏈霉菌(Streptomycesroseochromogenes)研究了氫化可的松的生物轉(zhuǎn)化過(guò)程，在C16位引入16α-OH，得到16α-羥基氫化可的松，它是生產(chǎn)丙酸羥潑尼龍的重要中間體。此外，藍(lán)色犁頭霉(Absidiacoerulea)和新月彎孢霉(Curvularialunata)還可以對(duì)醋酸可的松和醋酸潑尼松的C11位進(jìn)行羥基化，再次為皮質(zhì)激素的生產(chǎn)提供了基礎(chǔ)性的突破[15-17]。

甾體激素藥物的關(guān)鍵中間體為雄烯二酮(AD)與雄二烯二酮(ADD)，大部分甾體藥物的生產(chǎn)都以這兩種中間體為原料。目前對(duì)于AD的生產(chǎn)，主要通過(guò)植物甾醇的生物降解，如張亞楠等[18]開(kāi)發(fā)了利用工業(yè)用菌株野生小金色分枝桿菌(Mycobacteriumneoaurum)催化降解甾醇制備4-AD的無(wú)油生產(chǎn)工藝，AD進(jìn)一步脫氫即可獲得ADD。大多數(shù)真菌對(duì)上述兩種化合物具有甾基化催化活性，例如：Isariafarinosa具有廣譜的高效類固醇羥化酶，所得到的7-羥基脫氫表雄酮具有較高的生物活性，可用于治療阿爾茨海默病，是合成醛固酮拮抗劑的關(guān)鍵中間體[19]。該菌生物轉(zhuǎn)化孕激素可得到6β,11α-dihydroxyprogesterone，是一種生理活性非常高的孕激素。Kozowska等[19]從波蘭下西里西亞Voivodeship地區(qū)的廢棄礦井中采集到了12株昆蟲(chóng)病原絲狀真菌Isariafarinose,這12菌株均能有效轉(zhuǎn)化脫氫表雄酮(DHEA)，其中IsariafarinosaKCh KW1.1 可高效轉(zhuǎn)化ADD、雄烯二酮、腎上腺甾酮、17α-methyltestosterone、17β-hydroxyandrost-1，4，6-triene-3-one和黃體酮。王雪榮[20]篩選出具有4-AD羥基化能力的4株絲狀真菌:斜臥青霉(Penicilliumdecumbens)、曲霉菌(Aspergillussp.)、雷斯青霉(Penicilliumraistrickii)和赭曲霉(Aspergillusochraceus)，但是這4株菌對(duì)4-AD的羥基化位點(diǎn)不同，所產(chǎn)生的產(chǎn)物的生理活性也有差異。張廣求等[21]研究了刺盤孢屬菌YNCA0116對(duì)孕酮和4-AD的生物轉(zhuǎn)化，孕酮被該菌轉(zhuǎn)化為11α,15α-二羥基孕酮和6β,11α-二羥基孕酮，4-AD被轉(zhuǎn)化成11β,15α-二羥基-4-雄烯二酮，確定了刺盤孢菌YNCA0116具有轉(zhuǎn)化甾體二羥基化的能力，但是對(duì)不同甾體化合物羥基化特點(diǎn)不同。

雷斯青霉(Penicilliumraistrickii)具有15α羥基羥化酶的特異性，可以催化左旋乙基甾烯雙酮15α位羥基化生成15α羥基左旋乙基甾烯雙酮，而且轉(zhuǎn)化率可以達(dá)到93%以上，該工藝是合成新一代避孕藥孕二烯酮所必需的。Torshabi等[22]利用Mucorracemosus生物轉(zhuǎn)化甲基睪丸素(MT)，最終可生成7α-OH-MT、15α-OH-MT和12,15α-OH-MT這3個(gè)產(chǎn)物。生物轉(zhuǎn)化16α,17α-環(huán)氧黃體酮(EP)的研究過(guò)程，主要應(yīng)用Rhizopusnigricans[23]、aspergillusochraceus[24]、Curvularialunata[25]、Cunningnamellaelegans[26]、Absdiacoerulea[27]和Metarhiziumsp.[28]等菌株催化EP在C11位的羥基化。此外，ColletotrichumliniAS3.4486還可以催化EP生成雙羥基產(chǎn)物1β,15α-OH-EP[29-30]。但目前這些研究，還都處在實(shí)驗(yàn)室研究階段，離工業(yè)化應(yīng)用還有一段距離。

Janeczko等[31]以毛殼菌(Chaetomiumsp.1 KCH 6651)作為生物催化劑，黃體酮被高效轉(zhuǎn)化為6β,14α-二羥基雄甾-4-烯-3,20-二酮，而脫氫表雄酮先被轉(zhuǎn)化為7α-羥基衍生物，隨后轉(zhuǎn)換7-羥基雄甾-4烯-3,17-二酮。Gao等[32]利用絲狀真菌Penicilliumcitrinum對(duì)3β-乙酸基孕甾-5,16-二烯-20-酮進(jìn)行轉(zhuǎn)化，生成4種代謝產(chǎn)物，分別為3β,7β-二羥基-孕甾-5,16-二烯-20-酮、3β-羥基-7α-甲氧基-孕甾-5,16-二烯-20-酮、3β,7β,11α-三羥基-孕甾-5,16-二烯-20-酮和3β,7α-二羥基-孕甾-5,16-二烯-20-酮，其中7-O-甲基化是孕甾生物轉(zhuǎn)化的一個(gè)新反應(yīng)。Kolet等[33]利用Mucorhiemalis生物轉(zhuǎn)化黃體酮，得到14α-羥基黃體酮、6β,14α-二羥基黃體酮和7α和14α-二羥基黃體酮3種產(chǎn)物，總轉(zhuǎn)化率達(dá)到94%，該研究一次反應(yīng)得到3種羥基化黃體酮衍生物，并且這3種物質(zhì)均具有工業(yè)開(kāi)發(fā)潛力，是生物轉(zhuǎn)化中比較理想的研究結(jié)果。

工業(yè)上重要的甾體化合物微生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)類型總結(jié)見(jiàn)表2。

1.2 微生物代謝甾醇的分子機(jī)制

甾體降解是有氧代謝[34]，早在20世紀(jì)八九十年代，研究人員就能夠根據(jù)降解過(guò)程中產(chǎn)生的中間產(chǎn)物來(lái)研究出可能的代謝途徑[35]。隨著甾體降解基因簇[36]的發(fā)現(xiàn)，關(guān)鍵酶[37]的功能已被逐一確定?；虼刂械拇蠖鄶?shù)基因與甾體代謝途徑有關(guān)，其多步降解機(jī)制已被人們成功解釋。

表2 工業(yè)上重要的甾體化合物微生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)類型

通過(guò)對(duì)微生物代謝中間體的鑒定，構(gòu)建了甾醇生物降解的可能代謝途徑，并通過(guò)誘變?nèi)コ嗽撏緩街械年P(guān)鍵酶，從而積累中間產(chǎn)物[38]。然而，人們逐漸發(fā)現(xiàn)，這種傳統(tǒng)的方法會(huì)遇到菌株選育的瓶頸。由于誘變劑的成功率低、作用弱，無(wú)法解決突變體和代謝副產(chǎn)物的穩(wěn)定性問(wèn)題，很大程度上限制了這類微生物的應(yīng)用。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，人們?cè)噲D從代謝工程和基因工程等多角度揭示紅球菌[39]和分枝桿菌[40]等降解甾醇的分子機(jī)制，實(shí)現(xiàn)人工修飾和調(diào)控。對(duì)此，van der Geize團(tuán)隊(duì)的Ros?oniec等[41]揭示了紅球菌和分枝桿菌甾醇降解的關(guān)鍵基因簇，并解釋了一些關(guān)鍵基因的功能。同時(shí)為研究分枝桿菌感染性的致病機(jī)制提供了重要參考[42]。到目前為止，大多數(shù)典型的分枝桿菌和紅球菌已經(jīng)被測(cè)序，其中一些還通過(guò)甾醇誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄組和基因芯片進(jìn)行了檢測(cè)[43]。杜大慶[44]研究發(fā)現(xiàn)，微生物體內(nèi)與甾體代謝相關(guān)的基因具有集群化趨勢(shì)聚集成簇，在甾體誘導(dǎo)下，大多數(shù)簇內(nèi)基因均顯著上調(diào)。在紅球菌RHA1[45-46]中，有6個(gè)基因簇被表達(dá)上調(diào)，其中1個(gè)尤為顯著。Petrusma等[39]和Kendall等[40]研究發(fā)現(xiàn)，該簇類包含51個(gè)基因，其中大部分與功能分析鑒定的關(guān)鍵基因高度同源，被鑒定為具有特異性的甾體代謝基因簇。

1.3 生物轉(zhuǎn)化甾醇的方法

甾體化合物的微生物轉(zhuǎn)化過(guò)程一般由兩個(gè)階段組成。第一階段是對(duì)菌體進(jìn)行培養(yǎng)，通過(guò)為菌體提供豐富的營(yíng)養(yǎng)，使菌體能夠在最適宜的溫度、酸堿度和通風(fēng)的條件下生長(zhǎng)，以獲得足夠量的菌體和酶。培養(yǎng)時(shí)間的長(zhǎng)短會(huì)因菌種的不同而不同，一般來(lái)講，細(xì)菌通常需要 12～24 h，霉菌需要24～48 h。第二階段是向培養(yǎng)液中加入甾體化合物來(lái)完成生物轉(zhuǎn)化的過(guò)程。

1.3.1 全細(xì)胞轉(zhuǎn)化法

全細(xì)胞生物催化在甾體化合物的工業(yè)生產(chǎn)中占有主要地位。具有甾體化合物催化能力的酶一般都是氧化還原酶類，通常位于膜蛋白上，在催化過(guò)程中還需要輔酶的參與。與酶催化相比，全細(xì)胞催化避免了成本昂貴、步驟繁瑣的酶的純化步驟，而且不需要在體系中額外添加昂貴的輔酶，因此大大降低了生產(chǎn)成本。

在自然界中，已發(fā)現(xiàn)許多微生物如細(xì)菌、真菌、藻類等可以對(duì)甾體化合物進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化。簡(jiǎn)單節(jié)桿菌(Arthrobactersimplex)、分枝桿菌(Mycobacteria)、棒狀桿菌(Corynebacteria)、假單孢桿菌(Pseudomonas)均可以對(duì)甾體母核C1,2位進(jìn)行脫氫。尖孢鐮刀菌(Oxysporum1301)菌株可催化多種甾體化合物，且生成睪內(nèi)酯的產(chǎn)率較高[47]。在眾多的微生物中，真菌對(duì)甾體藥物的轉(zhuǎn)化最為普遍，而且絕大部分都是進(jìn)行羥基化反應(yīng)，常用的菌種見(jiàn)表3。

1.3.2 靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化法

靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化是通過(guò)制備菌體靜態(tài)懸浮液來(lái)進(jìn)行的生物催化技術(shù)。將菌體培養(yǎng)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，過(guò)濾或離心收集菌體，再將菌體重懸于水中或適宜的緩沖溶液中，然后加入底物再進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)。該方法具有如下優(yōu)點(diǎn)：底物和菌體量的比例可變；雜質(zhì)相對(duì)較少，易于分離純化；反應(yīng)時(shí)間短；菌體可多次重復(fù)利用等。例如，當(dāng)諾卡氏菌氧化膽固醇時(shí)，濕細(xì)菌的酶活性可以保持在-20 ℃以下，并長(zhǎng)期保持穩(wěn)定。徐陽(yáng)光[48]利用新金分枝桿菌生長(zhǎng)細(xì)胞和靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化體系，對(duì)植物甾醇轉(zhuǎn)化過(guò)程中產(chǎn)物母核降解問(wèn)題進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)在靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化體系中，提高轉(zhuǎn)化溫度，甾醇能夠正常轉(zhuǎn)化，并且產(chǎn)物降解受到明顯抑制，轉(zhuǎn)化3 d時(shí)，產(chǎn)物降解率由38.31%下降為16.22%。通過(guò)改用AD作為底物，發(fā)現(xiàn)反應(yīng)2 d后AD的降解率減少約50%。

表3 用于甾體化合物羥基化的微生物

1.3.3 固定化細(xì)胞轉(zhuǎn)化法

固定化細(xì)胞技術(shù)既可以增加菌體濃度又可以重復(fù)利用菌體，既能提高催化效率又有利于生物催化劑與產(chǎn)物間的分離。固定化細(xì)胞技術(shù)在甾體生物轉(zhuǎn)化上的應(yīng)用實(shí)現(xiàn)了甾體藥物的半連續(xù)化生產(chǎn)。菌體培養(yǎng)后，投入底物進(jìn)行轉(zhuǎn)化，隨著轉(zhuǎn)化時(shí)間的增加，菌體會(huì)發(fā)生自溶現(xiàn)象，而采取固定化細(xì)胞的方法可以解決該問(wèn)題。固定化微生物細(xì)胞的方法很多，主要包括包埋及交聯(lián)、載體吸附、共價(jià)結(jié)合等。

固定化細(xì)胞的在甾體生物催化中的效率主要取決于所用載體的性質(zhì)如表面、大小、空隙度及親水性等，另外反應(yīng)條件、固定化方式也會(huì)對(duì)固定化細(xì)胞的活性產(chǎn)生重要影響。例如：將新月彎孢霉(Curvularialunata)先進(jìn)行底物誘導(dǎo)，收集后的濕菌體固定在聚丙烯酰胺凝膠中，可重復(fù)多批次地催化 C11-β羥化反應(yīng)[49]。而利用聚丙烯酰胺、海藻酸等固化劑等進(jìn)行簡(jiǎn)單節(jié)桿菌的固定，能高效地進(jìn)行甾體化合物的C1,2脫氫反應(yīng)，且批次酶活穩(wěn)定，能夠長(zhǎng)期使用。另外也可將固定化細(xì)胞裝在玻璃柱中組成反應(yīng)柱使反應(yīng)液連續(xù)通過(guò)，有效進(jìn)行C1,2脫氫反應(yīng)。

2 甾醇側(cè)鏈降解反應(yīng)

早在1985年，Owen等[50]就對(duì)假單胞菌降解甾醇側(cè)鏈產(chǎn)生AD的機(jī)制進(jìn)行了研究，經(jīng)測(cè)定，該工藝共分16步，涉及11種酶催化劑。到1990年，Szentirmai[35]進(jìn)一步闡明了分枝桿菌NRRL B-3805對(duì)P-谷甾醇側(cè)鏈降解產(chǎn)生AD的過(guò)程和機(jī)制，其過(guò)程主要包括C3羥基氧化脫氫、甾體核上C5雙鍵異構(gòu)化、C17烷基側(cè)鏈降解。反應(yīng)的順序還有待確定，但可以肯定C17側(cè)鏈的降解是其最關(guān)鍵的步驟[51]。

為了更清楚地了解11種功能酶參與甾醇側(cè)鏈降解和酶反應(yīng)的機(jī)制，Thomas等[52-53]、Wilbrink等[54]、Griffin等[55]和Yao等[56]研究過(guò)一些關(guān)鍵酶的基因和代謝機(jī)制。特別是Griffin等[55]通過(guò)高通量轉(zhuǎn)座子突變發(fā)現(xiàn)了幾個(gè)直接參與基因簇內(nèi)外側(cè)鏈降解的關(guān)鍵基因。Yao等[56]首次闡明了膽固醇氧化酶ChoMl和ChoM2在分枝桿菌ATCC 25795產(chǎn)生AD (D)過(guò)程中的代謝功能、分子機(jī)制及重要作用，并提高了關(guān)鍵酶ChoM2的表達(dá)，使AD產(chǎn)量增加51.2%。

然而迄今為止，甾體相關(guān)的研究基本上都是基于基因突變或敲除技術(shù)來(lái)定位甾醇側(cè)鏈降解過(guò)程中的部分關(guān)鍵基因和酶，對(duì)全部過(guò)程中涉及的11種功能酶還沒(méi)有全面的了解，目前甾醇的側(cè)鏈降解只能在微生物的全細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行，不能實(shí)現(xiàn)純酶催化。

3 生物轉(zhuǎn)化體系強(qiáng)化甾體生產(chǎn)效率

3.1 水相體系

甾體化合物在水中溶解度極低，極大地限制了底物傳質(zhì)進(jìn)而影響底物與酶的接觸，細(xì)胞壁和細(xì)胞膜作為細(xì)胞質(zhì)的保護(hù)屏障，限制了底物進(jìn)入胞漿的效率，也會(huì)降低生物轉(zhuǎn)化的產(chǎn)率[57-58]。萬(wàn)古霉素、卵磷脂、氨基乙酸、魚(yú)精蛋白、乙胺丁醇、多粘菌素B九肽、聚乙烯亞胺及桿菌肽等都可導(dǎo)致相關(guān)菌株細(xì)胞壁的缺失[59-61]。

3.2 雙液相體系

雙液相體系是指水相(發(fā)酵液或緩沖液)和與水不溶的有機(jī)相(單一有機(jī)溶劑或混合有機(jī)溶劑)構(gòu)成的體系。水相中含有活性的酶或細(xì)胞，有機(jī)相中含有甾體化合物。在生物轉(zhuǎn)化過(guò)程中，形成油包水和水包油兩種情況，底物在水相被酶或細(xì)胞催化，所得產(chǎn)物再返回到有機(jī)相。由于底物的溶解度在有機(jī)相中要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于水中，因此可以大大提高投料濃度。由于底物和產(chǎn)物都主要處于有機(jī)相中，因此大大降低了底物和產(chǎn)物對(duì)酶或細(xì)胞的抑制作用。同時(shí)，在雙液相生物轉(zhuǎn)化體系中，有機(jī)相主要作為底物的貯存器和產(chǎn)物的原位分離器，隨著生物轉(zhuǎn)化的進(jìn)行，生成的產(chǎn)物不斷被轉(zhuǎn)移到有機(jī)相中，水相中的反應(yīng)平衡向產(chǎn)物方向推動(dòng)，整個(gè)反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率得到提高。選擇合適的有機(jī)相是雙液相系統(tǒng)技術(shù)的關(guān)鍵，一方面有機(jī)溶劑對(duì)生物催化酶或細(xì)胞毒性較小，另一方面有機(jī)相對(duì)底物和產(chǎn)物有較高的溶解度。柏挺[62]在小試發(fā)酵規(guī)模上，優(yōu)化大豆油/水雙液相系統(tǒng)中分枝桿菌降解植物甾醇為雄烯二酮(AD)的工藝。研究了大豆油在發(fā)酵液中的最佳比例，植物甾醇的投料量以及添加表面活性劑對(duì)提高植物甾醇轉(zhuǎn)化率的影響，得到最佳轉(zhuǎn)化工藝條件。楊旭錦等[63]提供一種雙液相發(fā)酵系統(tǒng)發(fā)酵分枝桿菌Mycobacteriumnsp.DE6823制備雄烯二酮的方法，在發(fā)酵轉(zhuǎn)化完成后，通過(guò)膜分離方法，得到含有雄烯二酮的溶液，經(jīng)濃縮、脫色、過(guò)濾、濃縮、重結(jié)晶和真空干燥等操作，可得到純度在99%以上的雄烯二酮。根據(jù)選用油相的不同，植物甾醇的轉(zhuǎn)化率為59%～85%。

3.3 雙水相體系

雙水相體系由兩種高聚溶液或者一種高聚物溶液和一種鹽溶液構(gòu)成，并在特定的溶液濃度下形成兩種不相容相。微生物細(xì)胞被限定在其中一相中，而底物和產(chǎn)物被限定在另一相中。聚合物的存在大大提高了底物和產(chǎn)物在同一相中的溶解度。在反應(yīng)過(guò)程中，底物相中的底物(甾體化合物)會(huì)不斷地進(jìn)入微生物細(xì)胞所在的相中，經(jīng)過(guò)反應(yīng)生成產(chǎn)物后再轉(zhuǎn)移回底物相中，這樣的雙水相體系將底物的濃度提高到接近最大反應(yīng)濃度，又將產(chǎn)物的濃度降低到很低，減少對(duì)轉(zhuǎn)化反應(yīng)的抑制作用。在雙水相體系中，成相介質(zhì)的選取是非常關(guān)鍵的，它直接決定了底物和產(chǎn)物在兩相介質(zhì)中的分配情況。王艷婷等[64]將分枝桿菌(Mycobacteriumsp.)降解植物甾醇制備雄甾-4-烯-3,17-二酮的研究引入雙水相體系中，研究表明，雙水相體系具有良好的生物相容性，可用于分枝桿菌對(duì)植物甾醇降解、萃取發(fā)酵生產(chǎn)雄甾-4-烯-3,17-二酮，可有效緩解轉(zhuǎn)化過(guò)程中的產(chǎn)物抑制作用，其工業(yè)應(yīng)用前景良好。

3.4 離子液體體系

離子液體指完全由離子組成、在室溫或室溫附近溫度下成液體狀態(tài)的鹽類，也稱為室溫熔融鹽或室溫離子液體。組成離子液體的陽(yáng)離子主要有烷基咪唑離子、烷基吡啶離子、季銨鹽離子等；陰離子主要包括氯化鹽類或[BF4]-、[PF6]-和[NTf2]-等。許青青等[65]篩選以離子液體[bmim]Cl為代表，構(gòu)建了液-液兩相體系,結(jié)合高效液相色譜分析測(cè)定離子液體復(fù)合萃取劑對(duì)植物甾醇的分配系數(shù)和分離選擇性。用[bmim]Cl-乙腈/正己烷兩相體系萃取,隨離子液體濃度的增加，分配系數(shù)和萃取選擇性系數(shù)的增加十分顯著，當(dāng)用20%[bmim]Cl-乙腈萃取時(shí)，豆甾醇的分配系數(shù)可達(dá)7.89，豆甾醇對(duì)β-谷甾醇的分離選擇性可達(dá)65.8，是純乙腈為萃取劑時(shí)的54倍以上。

在生物催化反應(yīng)過(guò)程中，與傳統(tǒng)的有機(jī)溶劑相比，離子液體具有以下優(yōu)點(diǎn)：一是為催化體系提供了不同于傳統(tǒng)分子溶劑的反應(yīng)環(huán)境，改善生物酶或細(xì)胞的活性、提高穩(wěn)定性，提高反應(yīng)的選擇性和轉(zhuǎn)化率；二是離子液體種類繁多，可選擇余地大，酶或細(xì)胞溶于離子液體中，反應(yīng)體系可以循環(huán)利用，充分表現(xiàn)了酶或細(xì)胞的均相催化效率高、多相催化易分離的優(yōu)點(diǎn)；三是離子液體難揮發(fā)，操作溫度范圍寬，并且離子液體與有機(jī)溶劑不互溶，使得產(chǎn)物易于分離提取。

3.5 超臨界流體體系

在超臨界流體體系中，物質(zhì)具備優(yōu)異的擴(kuò)散性能和傳質(zhì)效果，酶催化反應(yīng)發(fā)生在接近臨界區(qū)域內(nèi)，溫度和壓力的微小變化就可使溶劑的性質(zhì)發(fā)生獨(dú)特的變化，可提高酶催化反應(yīng)的特異性，目前這一技術(shù)在醫(yī)藥工業(yè)中引起了越來(lái)越多的關(guān)注。Wang等[66]發(fā)現(xiàn)，超臨界流體在甾體藥物合成起始原料甾醇的萃取中表現(xiàn)優(yōu)異。趙亞平等[67]采用植物油加工副產(chǎn)品為原料，根據(jù)甾醇與其他組分在超臨界流體中溶解度的差異，進(jìn)行純化精制高純度甾醇。萃取劑優(yōu)選CO2，并在萃取過(guò)程中加入增效劑醇或酮，得到的甾醇純度高，得率高，而且不引入有害物質(zhì)，無(wú)環(huán)保問(wèn)題。

3.6 微乳化體系

微乳液是將兩種或以上互不相溶的液體經(jīng)混合乳化后，形成的一種熱力學(xué)穩(wěn)定、透明分散體系。在該體系中，生物細(xì)胞或酶以分子水平分散于油包水(W/O)狀的微乳液中，為酶催化提供大量的油/ 水界面。同時(shí)，對(duì)于難溶性的甾體化合物，由于其可溶于有機(jī)介質(zhì)，可有效克服傳質(zhì)阻力。微乳液體系可以提高底物的生物利用度，并且可以將細(xì)胞和底物分別保留在水相和油相中，從而將細(xì)胞毒性降到最低。Zhang等[68]制備了幾種不同親水親脂平衡的微乳液，并對(duì)其穩(wěn)定性和生物轉(zhuǎn)化效率進(jìn)行了評(píng)價(jià)，研究表明微乳液體系中的轉(zhuǎn)化率是傳統(tǒng)的水相生物轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的3.1倍。由于使用微乳液體系的底物細(xì)胞毒性較小，該研究實(shí)現(xiàn)了利用再生細(xì)胞的微乳液進(jìn)行重復(fù)循環(huán)生物轉(zhuǎn)化，6個(gè)周期的總產(chǎn)量是傳統(tǒng)方法的4.3倍。這種高效的微乳液體系，具有更好的細(xì)胞可持續(xù)性和生物反應(yīng)活性，可以擴(kuò)展到其他不溶性和有毒底物的生物轉(zhuǎn)化。

4 結(jié)語(yǔ)與展望

隨著微生物技術(shù)的不斷發(fā)展和新型菌株的應(yīng)用，甾體激素的生物轉(zhuǎn)化不應(yīng)只強(qiáng)調(diào)提高某一步轉(zhuǎn)化效率和專一性，而且要更多地綜合應(yīng)用多種生物技術(shù)(例如合成生物學(xué))來(lái)提高甾體激素藥物生物合成的途徑和方法。目前越來(lái)越多的具有高轉(zhuǎn)化活性的菌株已經(jīng)可以通過(guò)分子生物學(xué)手段對(duì)菌株進(jìn)行改造獲得，通過(guò)上述甾體藥物轉(zhuǎn)化現(xiàn)狀的概述，表明轉(zhuǎn)化的成功不僅需要優(yōu)良菌種，轉(zhuǎn)化體系也至關(guān)重要。而為了克服有機(jī)溶劑對(duì)于環(huán)境污染及毒性，不同新型“綠色溶劑”，如離子液體或低溶點(diǎn)共熔溶劑也逐漸應(yīng)用于甾體藥物生物催化體系中，對(duì)相關(guān)轉(zhuǎn)化方法和轉(zhuǎn)化體系的深入研究，甾體生物轉(zhuǎn)化工業(yè)也必然產(chǎn)生新的飛躍。