唐 俊，張 杰，孫 偉，趙 昂，朱志銘，鮑曉文，張銘雅，馬 博

(1.江蘇黃河藥業(yè)股份有限公司,江蘇 阜寧 224400；2.南京工業(yè)大學(xué) 藥學(xué)院，江蘇 南京 211800；3.江蘇省食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，江蘇 南京 210008)

地榆(SanguisorbaofficinalisL.)為薔薇科地榆屬植物地榆的干燥根，性微寒、味苦，歸肝、大腸經(jīng)，具有涼血止血、解毒斂瘡的作用[1]。從地榆中分離得到的地榆皂苷Ⅰ(ZiyuglycosideⅠ)和地榆皂苷Ⅱ(ZiyuglycosideⅡ)為地榆中具有藥理活性的主要成分[2]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，地榆中的皂苷類(lèi)成分具有抗腫瘤和美容護(hù)膚的作用[3-4]，其中，地榆皂苷Ⅰ既可以防止膠原纖維的降解，又能有效促進(jìn)I型膠原蛋白的生成，減少皮膚皺紋，有望被開(kāi)發(fā)成為新一代的美容護(hù)膚品；地榆皂苷Ⅱ能夠抑制血管生成，起到抗腫瘤轉(zhuǎn)移的作用[5]。因此，地榆中皂苷類(lèi)成分的含量測(cè)定對(duì)其進(jìn)一步的藥學(xué)研究發(fā)開(kāi)具有重要意義?，F(xiàn)有研究中主要采用高效液相色譜-紫外檢測(cè)法(HPLC-UV)[6]、高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)器法(HPLC-ELSD)[7]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(LC-MS)[8]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)[9]、液相色譜-四極桿/飛行時(shí)間質(zhì)譜法(LC-Q-TOF/MS)[10]等方法對(duì)地榆植物中的活性成分進(jìn)行了含量的測(cè)定。但地榆總皂苷因其較差的水溶性，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中的給藥方式大多為口服給藥。因此，鮮有對(duì)其在體內(nèi)的絕對(duì)生物利用度的相關(guān)研究。

本文中，筆者擬建立快速、靈敏、簡(jiǎn)便的LC-MS/MS法測(cè)定大鼠血漿中地榆皂苷Ⅰ和地榆皂苷Ⅱ的方法并運(yùn)用于大鼠體內(nèi)藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究，以期為地榆皂苷系列化合物的藥物開(kāi)發(fā)提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

地榆皂苷Ⅰ、地榆皂苷Ⅱ、竹節(jié)香附素A(經(jīng)HPLC檢測(cè)，純度≥98%)，上海源葉生物科技有限公司；甲酸(質(zhì)譜純)，Sigma公司；甲醇(色譜純)，Merck公司；超純水，Millipore公司。

SD大鼠12只(動(dòng)物合格證號(hào):SCXK (蘇) 2016—0004)，揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心，體質(zhì)量(200±10) g，雌雄各半。飼養(yǎng)環(huán)境：室溫(22±2)℃，相對(duì)濕度(50±10)%，12 h/12 h晝夜循環(huán)。

1.2 主要儀器

AB Sciex 4000型三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜儀，Sciex公司；UFLC-20A型高效液相色譜儀，Shimadzu公司；BT125D型電子天平，Sartorius公司；SPD2010型真空濃縮裝置、5810R型冷凍離心機(jī)，Thermo Fisher公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 高效液相色譜條件

色譜柱為Ultimate XB-C8色譜柱(100 mm×2.1 mm,3 μm,Welch)，柱溫為40 ℃，流動(dòng)相為乙腈(含0.05%甲酸)-水(2 mmol/L乙酸銨)(體積比為52∶ 48)，采用等度洗脫，流速0.20 mL/min，進(jìn)樣量5 μL，每個(gè)樣品檢測(cè)所需時(shí)間為6 min。

1.3.2 質(zhì)譜檢測(cè)條件

電噴霧離子源(ESI)，多級(jí)反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)，負(fù)離子模式，輔助氣溫度(turbo gas temperature)為450 ℃，輔助氣(GS1)為275.79 kPa(40 psi)，霧化氣(GS2)為379.21 kPa(55 psi)，氣簾氣(CUR)為68.94 kPa(10 psi)，離子噴霧電壓(IS)為-4 500 V。

在此條件下相關(guān)離子如表1所示。

1.3.3 溶液的配制

分別精密稱取地榆皂苷Ⅰ，地榆皂苷Ⅱ，竹節(jié)香附素A各10.00 mg，加入甲醇定容至10 mL，配制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的儲(chǔ)備液，于-20 ℃下保存；分別取地榆皂苷Ⅰ，地榆皂苷Ⅱ儲(chǔ)備液，用甲醇梯度稀釋?zhuān)謩e配制成10、20、50、100、200、500、1 000、2 000、5 000、10 000和20 000 ng/mL的工作液；取竹節(jié)香附素A儲(chǔ)備液，用甲醇稀釋至質(zhì)量濃度為1 μg/mL的內(nèi)標(biāo)工作液。分別配制濃度為16、1 600 和16 000 ng/mL的地榆皂苷Ⅰ和地榆皂苷Ⅱ的質(zhì)控工作液。

表1 各物質(zhì)MRM模式檢測(cè)離子

1.3.4 血漿樣品的處理方法

取100 μL 血漿，加入10 μL(1 μg/mL)內(nèi)標(biāo)工作液，混勻振蕩30 s，隨后加入0.4 mL 甲醇溶液，渦旋振蕩5 min，于12 000 g、4 ℃下離心10 min，取上清液0.4 mL，用Speed Vac真空濃縮裝置揮干，殘?jiān)?00 μL 流動(dòng)相溶解，于20 000g、4 ℃下離心10 min，取上清液5 μL 進(jìn)樣分析。

1.3.5 藥代動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)

SD大鼠12只實(shí)驗(yàn)前禁食12h后隨機(jī)均分為2組：口服給藥組和靜脈注射組，每只大鼠給藥2 mg/kg地榆皂苷Ⅰ和地榆皂苷Ⅱ的混合物。采血點(diǎn)設(shè)計(jì)如下，口服給藥組：口服給藥前及服藥后0.083、0.25、0.5、0.75、1、2、4、6、8和12 h 時(shí)眼眶后靜脈叢采血200 μL，置于肝素鈉化的試管中；靜脈注射組：靜脈注射前及注射后0.033、0.083、0.25、0.5、1、2、4、6、8和12 h時(shí)眼眶采血200 μL，置于肝素鈉化的試管中。全血樣品于3 000g離心10 min獲取血漿。血漿樣品立即放置-70 ℃冰箱中凍存待測(cè)。采用DAS3.0 軟件中的非房室模型法計(jì)算藥動(dòng)學(xué)參數(shù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 分析方法的專(zhuān)屬性

圖1顯示了6 份不同來(lái)源的空白大鼠的血漿，按1.2.4節(jié)的方法處理后其中地榆皂苷Ⅰ、地榆皂苷Ⅱ及內(nèi)標(biāo)的保留時(shí)間分別為1.91、3.08和2.82 min。

由圖1可知：血漿中內(nèi)源性物質(zhì)不干擾待測(cè)物質(zhì)的測(cè)定；待測(cè)物及內(nèi)標(biāo)的峰型較好。表明該方法具有較高的專(zhuān)屬性。

圖1 大鼠血漿樣品及加入一定濃度地榆標(biāo)準(zhǔn)品溶液(a)和大鼠靜脈注射地榆標(biāo)準(zhǔn)品5 min后(b)血漿的色譜圖Fig.1 Typical MRM chromatograms of blank plasma sample added with standard solution of ZiyuglycosideⅠand ZiyuglycosideⅡ (a) and rat plasma sample obtained at 5 min after tail vein injection (b)

2.2 線性關(guān)系的考察

取空白血漿90 μL，分別加入地榆皂苷Ⅰ、地榆皂苷Ⅱ工作液，配制成含地榆皂苷Ⅰ、地榆皂苷Ⅱ?yàn)?～2 000 ng/mL的含藥血漿，按1.2.4節(jié)的方法處理。以血漿中待測(cè)物的濃度為橫坐標(biāo)、待測(cè)物的峰面積與內(nèi)標(biāo)的峰面積之比為縱坐標(biāo)，用加權(quán)最小二乘法(W=1/ρ2) 進(jìn)行回歸運(yùn)算，得線性方程分別為：Y=0.009 67X+0.010 8，相關(guān)系數(shù)R=0.999 1(地榆皂苷Ⅰ)；Y=0.002 52X+0.000 151，相關(guān)系數(shù)R=0.995 2(地榆皂苷Ⅱ)。數(shù)據(jù)表明地榆皂苷Ⅰ，地榆皂苷Ⅱ在1～2 000 ng/mL范圍內(nèi)與峰面積比值的線性關(guān)系良好，定量下限均為1 ng/mL(信噪比S/N>10)。

2.3 精密度與準(zhǔn)確度試驗(yàn)

分別配制含地榆皂苷Ⅰ和地榆皂苷Ⅱ的定量下限(LLOQ)，低、中、高濃度(1、1.6、160和1 600 ng/mL)4個(gè)濃度的血漿樣本各6份，按1.2.4節(jié)的方法處理，根據(jù)當(dāng)日的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算質(zhì)控樣品的測(cè)得濃度。將質(zhì)控樣品的分析結(jié)果進(jìn)行方差分析，計(jì)算方法的精密度與準(zhǔn)確度結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知，樣品批間和批內(nèi)分析精密度均小于15%，實(shí)驗(yàn)結(jié)果符合生物樣品的測(cè)定要求。

表2 LC-MS/MS 法測(cè)定地榆皂苷Ⅰ及Ⅱ的精密度與準(zhǔn)確度

2.4 提取回收率與基質(zhì)效應(yīng)

按1.2.4節(jié)的方法處理低、中、高濃度的質(zhì)控樣品，每個(gè)濃度6個(gè)樣本，以其進(jìn)樣得到的峰面積除以空白血漿經(jīng)處理后再加入低、中、高濃度的質(zhì)控溶液及內(nèi)標(biāo)溶液后進(jìn)樣得到的峰面積，計(jì)算血漿中地榆皂苷Ⅰ、地榆皂苷Ⅱ的提取回收率與基質(zhì)效應(yīng)，結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可知，在實(shí)驗(yàn)中未見(jiàn)到明顯的基質(zhì)效應(yīng)，兩種物質(zhì)的提取回收率良好。

表3 LC-MS/MS 法測(cè)定地榆皂苷Ⅰ及Ⅱ的基質(zhì)效應(yīng)及提取回收率

2.5 穩(wěn)定性的考察

配制含地榆皂苷Ⅰ和地榆皂苷Ⅱ的低、中、高濃度對(duì)照品血漿各6份，分別于-70 ℃反復(fù)凍融3 次、室溫放置12 h、4 ℃自動(dòng)進(jìn)樣器中放置24 h和-70 ℃冷凍保存1個(gè)月。按1.2.4節(jié)的方法處理樣品，測(cè)定血漿中地榆皂苷Ⅰ、地榆皂苷Ⅱ的濃度，分別考察凍融循環(huán)、室溫、4 ℃自動(dòng)進(jìn)樣盤(pán)和長(zhǎng)期冷凍保存條件下的穩(wěn)定性，結(jié)果見(jiàn)表4。由表4可知，地榆皂苷Ⅰ和地榆皂苷Ⅱ在各條件下穩(wěn)定性良好。

表4各儲(chǔ)存條件或處理?xiàng)l件下地榆皂苷Ⅰ及地榆皂苷Ⅱ的穩(wěn)定性

Table 4Stability of ZiyuglycosideⅠand ZiyuglycosideⅡ under various conditions (n=6)

化合物理論質(zhì)量濃度/(ng·mL-1)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD/%凍融循環(huán)3次室溫放置12 h4 ℃放置24 h長(zhǎng)期凍存21 d地榆皂苷Ⅰ1.6-9.6-6.5-3.8-10.2160.0-10.3-4.48.7-7.41 600.0-12.53.84.23.7地榆皂苷Ⅱ1.6-7.42.9-8.2-6.5160.0-9.65.4-7.63.81 600.0-8.77.25.7-7.1

2.6 藥代動(dòng)力學(xué)研究結(jié)果

采用建立并經(jīng)過(guò)考證的LC-MS /MS方法檢測(cè)大鼠血漿中地榆皂苷Ⅰ、地榆皂苷Ⅱ的濃度，繪制血藥濃度-時(shí)間曲線見(jiàn)圖2和圖3，采用DAS3.0軟件應(yīng)用非房室模型法計(jì)算藥動(dòng)學(xué)參數(shù)見(jiàn)表5。由圖2可知，地榆皂苷Ⅰ、地榆皂苷Ⅱ經(jīng)靜脈注射進(jìn)入大鼠體循環(huán)后，血液中藥物濃度即達(dá)到最高，并且藥物濃度隨著時(shí)間逐漸降低。由圖3可知，大鼠口服地榆皂苷Ⅰ、地榆皂苷Ⅱ后，血液中藥物濃度逐漸上升。血藥濃度分別在(0.500±0.204)h和(0.438±0.125)h時(shí)刻達(dá)到最高(69.506±25.857)ng/mL和(55.350±10.313)ng/mL。由表5可知，大鼠口服和靜脈注射地榆皂苷Ⅰ、地榆皂苷Ⅱ的絕對(duì)生物利用度(Fabs)分別為(9.580±3.886)%、(12.215±3.353)%。兩種物質(zhì)的口服絕對(duì)生物利用度較低，可能與其水溶性較差有關(guān)。

圖2 大鼠靜脈注射地榆皂苷Ⅰ、地榆皂苷Ⅱ后血藥濃度-時(shí)間曲線Fig.2 Plasma concentration-time profiles of ZiyuglycosideⅠand ZiyuglycosideⅡ after tail vein injection

圖3 大鼠口服地榆皂苷Ⅰ、地榆皂苷Ⅱ后血藥濃度-時(shí)間曲線Fig.3 Plasma concentration-time profiles of ZiyuglycosideⅠand ZiyuglycosideⅡ after oral administration

表5 大鼠分別靜注注射和口服地榆皂苷Ⅰ和地榆皂苷Ⅱ藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)

注：AUC 為血藥濃度時(shí)間曲線下面積；ρmax為血藥濃度峰值；tmax是指用藥以后，血藥濃度達(dá)到峰值所需的時(shí)間；MRT為平均駐留時(shí)間；V為表觀分布容積；CL為清除率；t1/2為半衰期；Fabs為絕對(duì)生物利用度。

3 結(jié)論

本文中，筆者建立了LC/MS-MS方法用于同時(shí)測(cè)定大鼠血漿中地榆皂苷Ⅰ和地榆皂苷Ⅱ。此法具有專(zhuān)屬性好、靈敏度高、線性良好、精密度良好且準(zhǔn)確度高的特點(diǎn)。在此方法學(xué)研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)行了地榆皂苷Ⅰ和地榆皂苷Ⅱ在大鼠體內(nèi)的藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究。結(jié)果顯示，地榆皂苷Ⅰ和地榆皂苷Ⅱ口服吸收較快，但吸收不完全。兩種化合物生物利用度均較低，可能是由于化合物的脂溶性較差。實(shí)驗(yàn)結(jié)果為進(jìn)一步研究和開(kāi)發(fā)地榆皂苷Ⅰ和地榆皂苷Ⅱ類(lèi)生物制品提供了理論基礎(chǔ)。