劉 爽，李 會(huì)，許椏楠，史勁松，許正宏

(1. 江南大學(xué) 藥學(xué)院，江蘇 無錫 214122； 2. 江南大學(xué) 糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122)

細(xì)菌胞外多糖均具有獨(dú)特的理化性質(zhì)、流變學(xué)特性及其生理活性，使其在食品、醫(yī)藥、生物選礦及污水處理等領(lǐng)域具有潛在的應(yīng)用前景[1]。不同種類細(xì)胞的胞外多糖之間，單糖及重復(fù)單元構(gòu)成存在較大差異，相關(guān)的功能也存在差異，如：細(xì)菌產(chǎn)海藻酸鈉可作為藥物在體內(nèi)運(yùn)輸?shù)奈⑤d體，制作牙模等[2]；腸膜狀明串珠菌所分泌的葡聚糖可用作血漿替代物，用以治療休克及失血[3]；鏈球菌分泌的透明質(zhì)酸可以用于眼科藥品及人造皮膚[2]；Martin等[4]發(fā)現(xiàn)某些細(xì)菌胞外多糖具有安眠效果，可以消除失眠人群對(duì)于化學(xué)藥物的依賴；膠質(zhì)芽孢桿菌胞外多糖不僅對(duì)改善免疫力具有顯著作用[5]，而且還具有解磷、解鉀的功能[6]。細(xì)菌胞外多糖還可作為單糖的來源，如L-巖藻糖、L-鼠李糖等都來源于大分子多糖。這一類單糖化學(xué)合成或從自然界動(dòng)植物資源中提取成本過高且產(chǎn)量不足，卻有不可或缺的利用價(jià)值，因此，含有相應(yīng)糖基的多糖則成為此類單糖的來源。如，肺炎克雷伯氏菌和陰溝腸桿菌所分泌的胞外多糖，其中均富含巖藻糖成分，可作為巖藻糖的來源[7]。

盡管細(xì)菌胞外多糖的種類繁多，但其生物合成途徑卻存在較多相似之處[8]。Lee等[9]研究發(fā)現(xiàn)，較高的通氣量有利于多糖產(chǎn)量的提高及發(fā)酵液黏度的增大；Yang等[10]在發(fā)酵法制備芝多糖的研究中得到了相近的結(jié)果，較高的攪拌轉(zhuǎn)速和通氣速率對(duì)多糖的積累具有促進(jìn)作用。多糖合成過程涉及一系列高耗能過程的氧化反應(yīng)，為菌體自身生長(zhǎng)及多糖合成提供所需能量。細(xì)菌胞外多糖的發(fā)酵過程對(duì)溶氧條件要求較高，在營(yíng)養(yǎng)元素充足時(shí)，為菌體提供較好的溶氧條件將會(huì)促進(jìn)多糖產(chǎn)量的提高[11]。目前對(duì)膠質(zhì)芽孢桿菌胞外多糖的研究主要集中于菌株篩選及發(fā)酵工藝研究，但多糖產(chǎn)率較低，已報(bào)道的膠質(zhì)芽孢桿菌胞外多糖發(fā)酵多采用分批發(fā)酵工藝，且產(chǎn)量較低，多數(shù)低于10 g/L[12-13]。細(xì)菌胞外多糖的合成分泌，將直接導(dǎo)致發(fā)酵體系的流變學(xué)特性發(fā)生改變。胞外多糖發(fā)酵過程中，發(fā)酵液黏度不斷增大，將會(huì)表現(xiàn)出非牛頓流體的特性或假塑性流體的特點(diǎn)，當(dāng)發(fā)酵液體現(xiàn)為非牛頓流體的特性時(shí)，發(fā)酵液中的菌體會(huì)形成不同的形態(tài)，多糖的性質(zhì)也將會(huì)出現(xiàn)差異[1]。

本研究團(tuán)隊(duì)在前期工作中篩選獲得一株膠質(zhì)芽孢桿菌SM-01，在生長(zhǎng)過程中該菌株能夠產(chǎn)生一定含量的胞外多糖(BMPS)。為了進(jìn)一步促進(jìn)菌株生產(chǎn)胞外多糖的能力及應(yīng)用范圍，本文中，筆者重點(diǎn)研究攪拌轉(zhuǎn)速和通氣量對(duì)膠質(zhì)芽孢桿菌產(chǎn)胞外多糖的影響，并進(jìn)一步對(duì)所發(fā)酵生產(chǎn)的胞外多糖進(jìn)行分離純化，分析鑒定其多糖的結(jié)構(gòu)組成，以期為膠質(zhì)芽孢桿菌胞外多糖的工業(yè)化生產(chǎn)及應(yīng)用開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

膠質(zhì)芽孢桿菌(Bacillusmucilaginosus)SM-01，保藏于中國(guó)菌種保藏中心，保藏號(hào)：CGMCC 5766。

斜面培養(yǎng)基(g/L)： K2HPO4·3H2O 0.2、蔗糖 10.0、NaCl 0.2、尿素 0.1、CaCO35.0、MgSO4·7H2O 0.2、瓊脂 20。

種子培養(yǎng)基(g/L)：K2HPO4·3H2O 0.2、蔗糖 10.0、 NaCl 0.2、尿素 0.1、MgSO4·7H2O 0.2、CaCO35.0。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：K2HPO4·3H2O 0.2、葡萄糖 60.0、MgSO4·7H2O 0.6、NaCl 0.4、尿素 0.3、CaCO35.0。

以上培養(yǎng)基都需調(diào)節(jié)pH至 7.0～7.2。

1.2 方法

1.2.1 膠質(zhì)芽孢桿菌的培養(yǎng)

種子液培養(yǎng)：將斜面保藏的菌種接種至種子培養(yǎng)基中，置于150 r/min、 30 ℃搖床上培養(yǎng)。

搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)：將種子液以體積分?jǐn)?shù)4%的接種量接至發(fā)酵培養(yǎng)基中，置于搖床上，在150 r/min、30 ℃條件下進(jìn)行培養(yǎng)。

發(fā)酵罐培養(yǎng)：將種子液以體積分?jǐn)?shù)4%接種量接至5 L發(fā)酵罐中，裝液量3 L，培養(yǎng)溫度30 ℃，通氣量2 VVM(每分鐘通氣量與罐體實(shí)際料液體積比值)，攪拌轉(zhuǎn)速600 r/min(優(yōu)化攪拌轉(zhuǎn)速時(shí)換為其他攪拌轉(zhuǎn)速)。

1.2.2 分析方法

菌體濃度測(cè)定：取1 mL發(fā)酵液，加入等體積2%鹽酸，混勻，以除去殘留的CaCO3。將原液稀釋2～8倍后，分光光度計(jì)于600 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值。

葡萄糖濃度測(cè)定：取2 mL發(fā)酵液，稀釋100倍后，13 000 r/min離心10 min，取上清液，生物傳感分析儀測(cè)定葡萄糖濃度。

粗多糖濃度測(cè)定：取15 mL發(fā)酵液，稀釋1～10倍后，13 000 r/min離心20 min，以除去CaCO3及菌體。取上清液，加入3倍體積無水乙醇，混勻，4 ℃沉淀10 h后，7 000 r/min離心15 min，棄上清得粗多糖。將粗多糖真空干燥至恒質(zhì)量，然后用分析天平稱質(zhì)量。

1.2.3 膠質(zhì)芽孢桿菌胞外多糖粗提取工藝

以去離子水將發(fā)酵液稀釋10倍，13 000 r/min離心20 min，以去除殘留CaCO3及菌體。取上清液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮儀將上清液濃縮。向濃縮液中加入3倍體積無水乙醇，混合均勻，4 ℃沉淀10 h。沉淀結(jié)束后，7 000 r/min離心15 min，取沉淀，即為粗多糖。粗多糖溶于去離子水中，以Sevrage法除蛋白，蛋白除凈后再次以無水乙醇沉淀獲取多糖。粗多糖冷凍干燥，樣品保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 膠質(zhì)芽孢桿菌胞外多糖分離純化

1)粗多糖溶液制備。稱取500 mg粗多糖，將其溶解于100 mL去離子水中，即為粗多糖溶液。

2)離子交換柱層析。安裝層析柱，將處理好的陰離子交換填料DEAE-52緩慢加入層析柱，至填料離上端5 cm左右。以0.02 mol/L的NaCl溶液進(jìn)行平衡，流速1.2 mL/min。層析柱平衡完畢，將5 mL粗多糖溶液加入層析柱，用重蒸水以1.2 mL/min流速洗脫，將過量粗多糖洗脫。洗脫后分別以濃度為0.1、0.25、0.5、0.75、1.0、1.25、1.5、1.75及2.0 mol/L的NaCl溶液進(jìn)行分階段洗脫，每一濃度洗脫5倍柱體積，流速1.2 mL/min。每隔2 min的洗脫液收集為1管，收集完畢以苯酚-H2SO4法測(cè)定多糖含量。

3)透析脫鹽。按照洗脫曲線合并洗脫液，以旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮儀將洗脫液濃縮。濃縮液置于透析袋中，先以流水透析48 h，然后以去離子水透析48 h，每隔2 h將去離子水更換1次。透析結(jié)束后將多糖溶液濃縮，然后加入3倍體積無水乙醇，于4 ℃沉淀10 h。7 000 r/min離心15 min，獲取沉淀冷凍干燥即為純BMPS。

1.2.5 膠質(zhì)芽孢桿菌胞外多糖純度檢驗(yàn)

1)蛋白含量測(cè)定。以Braford蛋白測(cè)定試劑盒說明書所述流程進(jìn)行操作，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。配制質(zhì)量濃度為5.0 g/L的多糖溶液，并進(jìn)行梯度稀釋，分別取不同質(zhì)量濃度多糖溶液20 μL加入孔板。各孔中分別加入Braford 試劑200 μL，振蕩均勻，室溫靜置10 min。酶標(biāo)儀測(cè)定A595，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算多糖中蛋白含量。

2)全波長(zhǎng)掃描。配制質(zhì)量濃度為2.0 g/L的多糖溶液，以0.22 μm微孔濾膜進(jìn)行過濾。紫外全波長(zhǎng)掃描范圍200～800 nm。

3)凝膠滲透色譜。配制質(zhì)量濃度為2.0 g/L的多糖溶液，以0.22 μm微孔濾膜進(jìn)行過濾。濾液采用GPC-多角度激光散射聯(lián)用系統(tǒng)(GPC-MALLS)進(jìn)行測(cè)定，色譜柱為Shodex OHpak SB-806 HQ，流動(dòng)相為0.2 mol/L NaCl溶液，流速為0.5 mL/min，柱溫為30 ℃。此法可以同時(shí)檢測(cè)多糖分子量。

1.2.6 膠質(zhì)芽孢桿菌胞外多糖結(jié)構(gòu)初步分析

1)紅外光譜分析。取10.0 mg膠質(zhì)芽孢桿菌胞外多糖樣品置于瑪瑙研缽中，加入500.0 mg KBr干粉末，充分研磨。用壓片機(jī)將研磨粉末壓制成薄片，薄片厚度控制在0.6～0.8 mm。紅外光譜掃描波數(shù)范圍為4 000～500 cm-1。

2)單糖組成分析。參照文獻(xiàn)[14]的方法測(cè)定單糖組成。

3)糖醛酸含量測(cè)定。參照文獻(xiàn)[15]的方法，制作葡萄糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.2.7 樣品中糖醛酸含量測(cè)定

取質(zhì)量濃度5.0 g/L的膠質(zhì)芽孢桿菌胞外多糖溶液，進(jìn)行梯度稀釋。按照標(biāo)準(zhǔn)曲線操作流程重復(fù)，于波長(zhǎng)525 nm處測(cè)定吸光值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算BMPS中糖醛酸含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 5 L發(fā)酵罐中膠質(zhì)芽孢桿菌胞外多糖的發(fā)酵生產(chǎn)

在膠質(zhì)芽孢桿菌胞外多糖發(fā)酵過程中，隨著菌體生長(zhǎng)，多糖逐漸積累，發(fā)酵液黏度逐漸提高，發(fā)酵液中傳氧、傳質(zhì)效果較差，從而限制了多糖的進(jìn)一步積累[16]。在前期研究中，已對(duì)膠質(zhì)芽孢桿菌SM-01搖瓶發(fā)酵的培養(yǎng)基成分及培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化(數(shù)據(jù)未顯示)，但由于搖瓶發(fā)酵本身存在較多限制條件，隨著發(fā)酵液黏度增大，搖瓶發(fā)酵體系中傳氧、傳質(zhì)效果變差且沒有良好的應(yīng)對(duì)措施，嚴(yán)重阻礙了膠質(zhì)芽孢桿菌胞外多糖進(jìn)一步積累。為了進(jìn)一步促進(jìn)多糖的工業(yè)化生產(chǎn)，筆者在5 L發(fā)酵罐進(jìn)行了膠質(zhì)芽孢桿菌胞外多糖的發(fā)酵研究。

2.1.1 攪拌轉(zhuǎn)速對(duì)膠質(zhì)芽孢桿菌產(chǎn)BMPS的影響

攪拌轉(zhuǎn)速是細(xì)菌胞外多糖發(fā)酵過程中一個(gè)至關(guān)重要的因素。適宜的攪拌轉(zhuǎn)速會(huì)保證良好的傳氧，充足的溶氧能夠?yàn)榘舛嗵堑暮铣商峁┠芰抗┙o，而均勻攪拌所達(dá)到的傳質(zhì)效果，能夠使菌體與各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)良好的接觸，促進(jìn)各種營(yíng)養(yǎng)元素的快速攝取，以提高菌體生長(zhǎng)速率及胞外多糖合成速率。因此，考察不同攪拌轉(zhuǎn)速對(duì)發(fā)酵體系中多糖濃度及OD600的影響，結(jié)果見圖1。

圖1 攪拌轉(zhuǎn)速對(duì)菌體生長(zhǎng)和多糖濃度的影響Fig.1 Effects of agitation speed on cell growth and polysaccharide concentration

由圖1可知：當(dāng)轉(zhuǎn)速為100 r/min時(shí)，多糖質(zhì)量濃度最低，且此時(shí)OD600也最低；隨著攪拌轉(zhuǎn)速增大，胞外多糖濃度及OD600隨之提高，并于轉(zhuǎn)速為600 r/min時(shí)多糖濃度及OD600達(dá)到最高，分別為25.9 g/L及3.1；當(dāng)轉(zhuǎn)速超過600 r/min時(shí)，多糖濃度及OD600均隨轉(zhuǎn)速的升高而降低。發(fā)酵罐攪拌轉(zhuǎn)速的提高會(huì)提升膠質(zhì)芽孢桿菌胞外多糖發(fā)酵過程中傳氧、傳質(zhì)速率，保證了發(fā)酵過程中能量與營(yíng)養(yǎng)元素的充足供應(yīng)，因此在轉(zhuǎn)速為100～600 r/min時(shí)，隨著攪拌轉(zhuǎn)速提高，多糖濃度及菌體濃度也隨之升高。此外，BMPS溶液為假塑性流體，發(fā)酵體系中剪切速率隨攪拌轉(zhuǎn)速的提高而增大，使得發(fā)酵液表觀黏度下降。發(fā)酵液黏度下降對(duì)發(fā)酵過程中的傳氧、傳質(zhì)效果具有促進(jìn)作用，進(jìn)而促進(jìn)菌體生長(zhǎng)及多糖合成。但當(dāng)攪拌速度過高時(shí)，過高的剪切速率反而會(huì)對(duì)菌體正常生長(zhǎng)及代謝活動(dòng)帶來傷害，因此在轉(zhuǎn)速為600～700 r/min時(shí)，OD600隨轉(zhuǎn)速的升高而降低，最終導(dǎo)致多糖合成效率降低。

2.1.2 通氣量對(duì)膠質(zhì)芽孢桿菌產(chǎn)胞外多糖的影響

溶氧是胞外多糖發(fā)酵過程中一個(gè)重要環(huán)境因子。菌體自身生長(zhǎng)代謝活動(dòng)及胞外多糖合成過程都是耗能過程，會(huì)涉及一系列氧化反應(yīng)。在膠質(zhì)芽孢桿菌SM-01胞內(nèi)，分子氧既可作為最終電子受體，又可作為菌體內(nèi)某些化合物的結(jié)構(gòu)成分?？疾觳煌饬繉?duì)菌體生長(zhǎng)及多糖合成的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 通氣量對(duì)菌體生長(zhǎng)和多糖濃度的影響Fig.2 Effects of aeration rate on cell growth and polysaccharide concentration

由圖2可知：當(dāng)通氣量為0.5 VVM時(shí)，胞外多糖濃度及菌體濃度最低；通氣量為0.5～2.0 VVM時(shí)，發(fā)酵液中溶氧水平隨通氣量升高而升高，與此同時(shí)，菌體濃度及多糖濃度均有所提高并于通氣量為2.0 VVM時(shí)，多糖質(zhì)量濃度及OD600達(dá)到最高值，分別為29.8 g/L及2.3；當(dāng)通氣量為2.5 VVM時(shí)，OD600及多糖濃度都開始下降。這是因?yàn)榉肿友鯇?duì)菌體而言，除了作為最終電子受體外，還能夠產(chǎn)生對(duì)生物體有毒害作用的物質(zhì)，如超氧基化合物及H2O2，這2種物質(zhì)在互相作用時(shí)會(huì)產(chǎn)生毒性更強(qiáng)的自由基·OH，不利于菌體的生長(zhǎng)及胞外多糖的合成。

2.2 膠質(zhì)芽孢桿菌胞外多糖的分離純化結(jié)果

2.2.1 粗多糖的制備

經(jīng)離心、濃縮、去蛋白、醇沉、干燥后得到的粗多糖樣品(圖3)。將粗多糖溶解于去離子水中得到粗多糖溶液，光學(xué)顯微鏡檢測(cè)結(jié)果顯示并無菌體存在，表明多糖中已不含菌體。

圖3 粗多糖樣品Fig.3 Crude polysaccharide

2.2.2 膠質(zhì)芽孢桿菌胞外多糖分離純化

細(xì)菌胞外多糖為長(zhǎng)鏈大分子結(jié)構(gòu)，除寡糖重復(fù)單元聚合而成的主鏈之外，在多糖的主鏈之上還有較多側(cè)鏈及基團(tuán)。這些側(cè)鏈及基團(tuán)一般為帶電子結(jié)構(gòu)，能對(duì)胞外多糖與其他多糖復(fù)配時(shí)的作用效果產(chǎn)生影響，而細(xì)菌胞外多糖的吸附能力也主要取決于這些側(cè)鏈修飾結(jié)構(gòu)。一般而言，細(xì)菌胞外多糖為單一組分時(shí)，其側(cè)鏈帶電基團(tuán)基本一致，不同多糖結(jié)構(gòu)中，側(cè)鏈帶點(diǎn)基團(tuán)間的差異決定了其與離子交換層析中所用填料之間結(jié)合程度的差異?；谶@一特性，可利用離子交換柱層析將細(xì)菌胞外不同組分的多糖分離純化。

選取用DEAE-52離子交換柱層析純化膠質(zhì)芽孢桿菌胞外多糖。以不同濃度的NaCl溶液作為洗脫液進(jìn)行分階段洗脫，結(jié)果如圖4。

圖4 DEAE離子交換柱層析Fig.4 Chromatography on DEAE ion exchange column

由圖4可知：當(dāng)洗脫液為0.5 mol/L NaCl溶液時(shí)出現(xiàn)洗脫峰，其他濃度NaCl溶液洗脫時(shí)均無明顯洗脫峰出現(xiàn)。當(dāng)洗脫液用量為40 mL時(shí)，出現(xiàn)峰形對(duì)稱的洗脫峰，表明在該條件下所得多糖為單一組分。

洗脫得到的洗脫液，用透析法除去多糖中的無機(jī)鹽離子及殘留的各種小分子雜質(zhì)后濃縮體積，以3倍體積無水乙醇4 ℃沉淀10 h，離心后冷凍干燥獲得多糖樣品。

2.2.3 膠質(zhì)芽孢桿菌胞外多糖純度檢測(cè)結(jié)果

1)紫外全波長(zhǎng)掃描及蛋白含量測(cè)定。對(duì)質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL的純化多糖溶液進(jìn)行紫外全波長(zhǎng)掃描分析，結(jié)果如圖5。由圖5可知：該多糖溶液只在200 nm左右出現(xiàn)多糖類物質(zhì)特征吸收峰，260、280 nm處均沒有特征吸收峰，表明純化過后的多糖中核酸及蛋白含量較低，多糖純度較高。進(jìn)一步對(duì)蛋白含量進(jìn)行測(cè)定結(jié)果表明，純化的多糖樣品中蛋白質(zhì)含量?jī)H為0.9%，與紫外全波長(zhǎng)掃描結(jié)果一致。

圖5 紫外全波長(zhǎng)掃描Fig.5 Ultraviolet full spectrum

2)凝膠滲透色譜。細(xì)菌胞外多糖為大分子化合物，其純度檢驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)及方法與小分子化合物的標(biāo)準(zhǔn)及方法存在較大差異。多糖純度檢驗(yàn)通常有4種方式：超速離心法、高壓電泳法、比旋度法和凝膠過濾法。凝膠過濾法是目前應(yīng)用較為廣泛且準(zhǔn)確的方法，其原理為不同性狀及分子量的多糖在不同大小孔徑凝膠中的遷移速率存在差異，分子量較小的多糖在過濾過程中進(jìn)入凝膠孔徑中，因此遷移速率相對(duì)較慢，而分子量較大的多糖則具有較快的遷移速率，若經(jīng)檢測(cè)器檢測(cè)到單一對(duì)稱的峰，即可認(rèn)為此多糖為單一組分。

本研究中，膠質(zhì)芽孢桿菌胞外多糖經(jīng)過離子交換柱層析等一系列分離純化過程后，凝膠滲透色譜檢測(cè)結(jié)果顯示只有一個(gè)單一對(duì)稱的峰出現(xiàn)(圖6)，表明得到的多糖純度較高，為單一組分。

圖6 凝膠滲透色譜分析圖譜Fig.6 Analysis results of gel permeation chromatographic

2.3 膠質(zhì)芽孢桿菌胞外多糖的結(jié)構(gòu)初步分析結(jié)果

2.3.1 膠質(zhì)芽孢桿菌胞外多糖的紅外光譜分析

采用紅外光譜掃描對(duì)純化得到的膠質(zhì)芽孢桿菌胞外多糖進(jìn)行分析，結(jié)果見圖7，將圖7(a)中2 000～400 cm-1位置放大，得到圖7(b)。由圖7可知：1 413及1 600 cm-1為羧酸伸縮振動(dòng)峰，說明多糖中有羧基存在，由此初步判定膠質(zhì)芽孢桿菌胞外多糖為酸性糖；1 400～1 200及2 800～3 000 cm-1為亞甲基伸縮振動(dòng)峰，是糖類化合物的特征吸收；3 405 cm-1為羥基伸縮振動(dòng)峰，此測(cè)定結(jié)果與李潔等[14]對(duì)膠質(zhì)芽孢桿菌胞外多糖的研究結(jié)果基本一致。

圖7 胞外多糖紅外光譜分析Fig.7 Infrared spectrum analysis of EPS

2.3.2 糖醛酸含量測(cè)定

較多細(xì)菌胞外多糖中都存在己糖醛酸，其可與四硼酸鈉-硫酸作用后再與間羥基聯(lián)苯互相作用產(chǎn)生有色物質(zhì)，該有色物質(zhì)最大吸收波長(zhǎng)為525 nm，且525 nm處吸光值大小與糖醛酸含量之間具有良好線性關(guān)系。因此本研究以此法測(cè)定BMPS中糖醛酸含量，結(jié)果顯示糖醛酸在BMPS中含量為24.6%。結(jié)合紅外光譜分析結(jié)果可認(rèn)定膠質(zhì)芽孢桿菌胞外多糖為一種酸性多糖。離子色譜測(cè)定結(jié)果顯示酸性糖為葡萄糖醛酸。

2.3.3 分子量測(cè)定

細(xì)菌胞外多糖分子量測(cè)定是多糖性質(zhì)研究工作中一個(gè)重要方面。細(xì)菌胞外多糖的性質(zhì)與其分子量之間存在密切的聯(lián)系。如多糖水溶液黏度，其黏度不僅與多糖在水溶液中的濃度有關(guān)，還與多糖分子量存在關(guān)系。一般情況下，多糖水溶液黏度與其分子量之間呈正相關(guān)關(guān)系。不同分子量大小的多糖之間性質(zhì)也存在差異，因此在細(xì)菌胞外多糖應(yīng)用中，時(shí)常根據(jù)其具體應(yīng)用要求選取合適分子量的多糖。

本研究中以凝膠滲透色譜檢驗(yàn)多糖純度的同時(shí)，可測(cè)定其分子量(圖6)。經(jīng)測(cè)定，膠質(zhì)芽孢桿菌胞外多糖平均分子量為4.4×106，這一測(cè)定結(jié)果與李潔等[14]所測(cè)定膠質(zhì)芽孢桿菌胞外多糖分子量處于同一數(shù)量級(jí)。

2.3.4 單糖組成測(cè)定

利用氣相色譜檢測(cè)單糖組成，結(jié)果見圖8。

1—鼠李糖；2—半乳糖；3—木糖；4—甘露糖；5—葡萄糖；6—半乳糖；7—肌醇圖8 單糖組成氣相色譜圖Fig.8 GC chromatogram of monosaccharides

由圖8可知：分離得到的BMPS單糖由葡萄糖、甘露糖及半乳糖構(gòu)成，摩爾比為3.2∶ 2.2∶ 1，單糖種類與李潔等[14]測(cè)定結(jié)果相同，但各單糖摩爾比存在差異。李潔等[14]以蔗糖為碳源對(duì)膠質(zhì)芽孢桿菌進(jìn)行培養(yǎng)，而本文筆者所用碳源為葡萄糖，推測(cè)碳源的差異是BMPS中單糖比例發(fā)生改變的原因。

3 結(jié)論

通過對(duì)5 L發(fā)酵罐發(fā)酵過程攪拌轉(zhuǎn)速及通氣量對(duì)膠質(zhì)芽孢桿菌產(chǎn)胞外多糖的影響，最終確定了最適攪拌轉(zhuǎn)速和通氣量，并對(duì)胞外多糖BMPS進(jìn)行分離純化及初步結(jié)構(gòu)分析。通過除菌體、除蛋白等粗提取工藝，進(jìn)而以離子交換柱層析、透析脫鹽等精細(xì)純化過程，獲得膠質(zhì)芽孢桿菌胞外多糖BMPS純品，經(jīng)純度檢驗(yàn)其純度較高，為蛋白質(zhì)含量?jī)H為0.9%的高純度細(xì)菌胞外多糖，可用于后續(xù)研究。采用紫外全波長(zhǎng)掃描、紅外光譜分析、氣相色譜分析、凝膠滲透色譜分析等技術(shù)對(duì)BMPS結(jié)構(gòu)進(jìn)行初步解析，確定了所得膠質(zhì)芽孢桿菌胞外多糖為糖醛酸含量為24.6%的酸性糖，平均分子量為4.4×106，由葡萄糖、甘露糖及半乳糖構(gòu)成，摩爾比為3.2∶ 2.2∶ 1。

國(guó)內(nèi)已有膠質(zhì)芽孢桿菌胞外多糖結(jié)構(gòu)的相關(guān)研究報(bào)道。本文所研究的胞外多糖BMPS與已報(bào)道多糖相比，分子量處于同一數(shù)量級(jí)，但單糖組成有所差異，這可能是培養(yǎng)條件及營(yíng)養(yǎng)因素不同引起。后續(xù)將在上述工作基礎(chǔ)上，結(jié)合京都基因與基因組百科全書(KEGG)中膠質(zhì)芽孢桿菌的中心代謝途徑，解析以葡萄糖為碳源時(shí)菌體的胞外多糖生物合成途徑，從而為代謝工程手段改造膠質(zhì)芽孢桿菌提高胞外多糖合成效率提供理論基礎(chǔ)。