鄭文秀，趙倩如，江 凌，黃 和，朱麗英

(1.南京工業(yè)大學(xué) 藥學(xué)院，江蘇 南京 211800； 2.南京工業(yè)大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院，江蘇 南京 211800； 3.南京工業(yè)大學(xué) 食品與輕工學(xué)院，江蘇 南京 211800；4.南京工業(yè)大學(xué) 化學(xué)與分子工程學(xué)院，江蘇 南京 211800)

隨著飼料產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，谷物和動物飼料受到真菌毒素的污染已成為目前全球亟待解決的嚴重問題。在過去的10年中，工廠、研究機構(gòu)和監(jiān)督部門都將注意力集中于飼料安全上[1]。據(jù)統(tǒng)計，全世界每年有25%的糧食作物會受到真菌毒素的污染[2]，如黃曲霉毒素(aflatoxins，AFs)，玉米赤霉烯酮(zearalenone，ZEN)等。

ZEN是一種非甾體雌激素真菌毒素，主要由幾種鐮刀菌產(chǎn)生，尤其是禾谷鐮刀菌和黃色鐮刀菌，其最初于1962年從發(fā)霉的玉米中分離出來[3]。ZEN污染主要發(fā)生在谷物中，例如玉米、小麥、大麥、黑麥和高粱等。而玉米作為能量飼料不僅被全世界養(yǎng)殖業(yè)廣泛使用，而且是發(fā)展養(yǎng)殖業(yè)不可或缺的支柱飼料。

目前，全球玉米的70%～80%都用于飼料，我國50%用作飼料，因此玉米有“飼料之王”的美稱[4]。由于不適宜的氣候條件和環(huán)境因素，玉米可能在生長、儲存、運輸和加工的各個環(huán)節(jié)受到ZEN的污染，導(dǎo)致ZEN在玉米及其副產(chǎn)品中富集，從而對食品安全構(gòu)成嚴重威脅[5]。 動物攝入ZEN污染的飼料后，健康遭受嚴重損害，造成生長和繁殖表現(xiàn)缺陷。而ZEN的雌激素活性可以進入食物鏈，人類食入受污染的有毒素殘留物的家禽產(chǎn)品，如肉類、肝臟或雞蛋，可能也會導(dǎo)致健康受損，誘發(fā)中樞性性早熟，生殖問題以及導(dǎo)致一些乳腺癌發(fā)病率的增加[6]。為了保護人類和動物的健康，歐盟對ZEN設(shè)定了嚴格的限制：未加工谷物在食品中的定量為100 μg/kg，未加工玉米在飼料中的定量為350 μg/kg。根據(jù)文獻[7]的報道，目前中國設(shè)定飼料中ZEN的最大殘留限量為500 μg/kg，谷物和谷物制品為60 μg/kg。

鑒于ZEN對動物和人類的嚴重危害，如何利用有效的手段清除飼料中ZEN已成為全球關(guān)注的熱點問題，物理法、化學(xué)法和生物法是人們現(xiàn)在研究常用的三大方法。其中，物理法包括添加營養(yǎng)惰性吸附劑和擠壓蒸煮，常用的營養(yǎng)惰性吸附劑為鋁硅酸鹽和含有黏土的鋁硅酸鹽，然而其商業(yè)用途由于成本高而受限制；擠壓蒸煮是現(xiàn)代食品加工新技術(shù)之一，盡管能提高產(chǎn)品質(zhì)量和安全性，但仍需證明ZEN的毒性或生物活性已降低或完全消除[8]?；瘜W(xué)法包括使用高濃度的臭氧、H2O2進行處理，可以部分破壞ZEN，但是缺少ZEN代謝物及其潛在毒性的信息[8]。生物法則是解決真菌毒素污染最具前景的方法，據(jù)報道多種細菌和真菌的生物降解能力已被表征[9]，因而通過微生物降解作用或吸附作用將毒素清除或降解為無毒產(chǎn)物已是目前研究的熱點。

酪丁酸梭菌是一種廣泛應(yīng)用于飼料、醫(yī)藥和化工等行業(yè)的厭氧菌株。在飼料領(lǐng)域，農(nóng)業(yè)部批準酪丁酸梭菌可作為新型飼料添加劑，以提高牲畜的免疫力水平和營養(yǎng)價值，減少抗生素的使用，其主要代謝產(chǎn)物丁酸可以作為動物生長代謝所需的營養(yǎng)元素。與抗生素相比，在飼料中添加酪丁酸梭菌具有綠色無污染、無耐藥性和無有害殘留等特點，現(xiàn)正在逐漸被廣泛應(yīng)用于動物飼料行業(yè)中[10]。

筆者對其清除液體中ZEN能力和影響因素進行了系統(tǒng)研究，將酪丁酸梭菌進行活菌培養(yǎng)、熱處理和酸處理，在不同菌濃條件下吸附ZEN，利用高效液相色譜(HPLC)檢測樣品中ZEN含量，以確定酪丁酸梭菌對ZEN的清除率和各個因素的影響。并且對酪丁酸梭菌馴化培養(yǎng)，比較其清除率，以期為今后研究酪丁酸梭菌在動物飼料中的脫毒作用奠定一定的研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗菌種

酪丁酸梭菌(Clostridiumtyrobutyricum)CCTCC W428，由食品與輕工學(xué)院實驗室保存[10]。

1.2 材料與試劑

酵母粉、蛋白胨，英國Oxoid公司；甲醇，上海薩恩化學(xué)技術(shù)有限公司；葡萄糖、NaCl、牛肉浸膏、十二水合磷酸氫二鈉、可溶性淀粉、無水乙醇、NaOH，上海國藥集團化學(xué)試劑有限公司；KH2PO4、無水乙酸鈉、KCl，廣東光華化學(xué)廠有限公司；HCl、分析純，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司；ZEN，以色列Fermentek公司；乙腈、色譜純，北京百靈威科技有限公司；L-半胱氨酸鹽酸鹽、刃天青，美國Sigma公司。

發(fā)酵培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，牛肉浸膏10 g/L，葡萄糖5 g/L，NaCl 5 g/L，無水乙酸鈉3 g/L，酵母浸粉3 g/L，可溶性淀粉1 g/L，L-半胱氨酸鹽酸鹽0.5 g/L，刃天青0.05%(質(zhì)量分數(shù))；pH 6.8。

磷酸鹽緩沖液(PBS，0.1 mol/L，pH 7.4)：十二水合磷酸氫二鈉 2.9 g、KH2PO40.2 g、NaCl 8 g和KCl 0.2 g溶解于去離子水中，定容至1 L。

ZEN儲備液：精密稱量10 mg，用色譜級乙腈溶解，并定容至10 mL，配成1 mg/mL標(biāo)準儲備液，于-20 ℃保存待用。

1.3 儀器與設(shè)備

YXQ-1型厭氧培養(yǎng)箱，上海躍進醫(yī)療器械有限公司；SW-CJ-1FD型超凈工作臺，蘇州凈化有限公司；Ultrospec 3300 pro型分光光度計，美國Amersham Biosciences公司；WGL-230B型電熱鼓風(fēng)干燥箱，天津市泰斯特儀器有限公司；3K15型臺式冷凍離心機，德國Sigma公司；HH-4型恒溫水浴鍋，太倉實驗儀器廠；UltiMate 3000型戴安高效液相色譜儀，美國Dionex公司；DMC 2900型顯微鏡，德國徠卡儀器有限公司。

1.4 實驗方法

1.4.1 菌種的活化和培養(yǎng)

取-80 ℃甘油管保存的菌種，37 ℃靜態(tài)厭氧培養(yǎng)24 h，得到一級種子。繼續(xù)轉(zhuǎn)代2次，以三級種子作為發(fā)酵母種，接入含100 mL生長培養(yǎng)基的500 mL厭氧瓶中，接種量為5%(體積分數(shù))，37 ℃下靜態(tài)厭氧培養(yǎng)待用。

1.4.2 酪丁酸梭菌清除ZEN能力的測定

酪丁酸梭菌的處理方法，結(jié)合參考文獻[12]并稍有修改，酪丁酸梭菌37 ℃靜態(tài)培養(yǎng)12 h后取樣，采用血球計數(shù)板法測定菌體質(zhì)量濃度[13]，調(diào)整菌體密度為1.0×1010個/mL于4 ℃、3 000 r/min離心10 min，菌體用PBS緩沖液洗滌，倒掉上清液，將菌體重懸于1 mL 培養(yǎng)基中，內(nèi)含20 μL 1 mg/mL ZEN，分別于37 ℃ 孵育2、 4、 6、 8、10、12和24 h，反應(yīng)結(jié)束后，離心取上清液，用HPLC分析上清液中的ZEN含量。采用相同的處理方法，控制其他影響因素一定，探究反應(yīng)溫度(20 、30、37和42 ℃)，培養(yǎng)基pH(4.0、5.0、6.0、7.0和8.0)，初始菌體密度(1.0×108、1.0×109、1.0×1010和1.0×1011個/mL)對酪丁酸梭菌清除ZEN的影響。

酪丁酸梭菌的預(yù)處理方法，結(jié)合參考文獻[14]并稍有修改，分為活菌組、熱處理組和酸處理組。酪丁酸梭菌37 ℃靜態(tài)培養(yǎng)12 h后取樣，控制菌體密度為1.0×108、1.0×109、1.0×1010和1.0×1011個/mL分別于4 ℃、3 000 r/min 離心10 min，菌體用PBS緩沖液洗滌?；罹M(37 ℃、4 mL PBS緩沖液孵育1 h)，熱處理組(4 mL PBS緩沖液中煮沸1 h)，酸處理組(37 ℃、4 mL 2 mol/L HCl 中孵育1 h)處理后，酸處理的菌體用PBS洗滌2次。將獲得的菌體重懸1 mL 培養(yǎng)基中，內(nèi)含1 mg/mL ZEN 20 μL，混勻后于37 ℃孵育24 h，離心取上清液，用HPLC分析ZEN的含量。以不含菌體的培養(yǎng)基和ZEN溶液為空白對照。ZEN清除率(Y)計算式見式(1)：

(1)

式中：S為酪丁酸梭菌處理后上清液中毒素的峰面積，S0為空白對照毒素的峰面積。

1.4.3 酪丁酸梭菌菌株的馴化

為了達到更好的清除ZEN毒素的效果，對其進行菌種的馴化。100 mL的厭氧瓶中加入50 mL培養(yǎng)基，然后在第一代菌株的培養(yǎng)基中加入1 mg/mL的ZEN 20 μL(ZEN添加量可忽略不計)，37 ℃培養(yǎng)10 h接種到第二代，并在10 h時取樣，稀釋適當(dāng)倍數(shù)后用可見光分光光度計于600 nm讀取菌懸液的OD值，為提高實驗準確性，單次實驗做3組平行試驗。

第二代菌株的培養(yǎng)基中加入40 μL的ZEN，隨后依次多加入20 μL的ZEN，直至傳代到第50代。選取馴化后的菌種，3 000 r/min離心10 min，除去上清液，PBS緩沖液洗滌獲得菌體。選取3個初始菌體密度：1.0×109、1.0×1010和1.0×1011個/mL，分別進行酸處理和熱處理，方法同上，用HPLC檢測分析馴化后酪丁酸梭菌清除ZEN的含量。

1.4.4 高效液相色譜的檢測條件

取一定量的ZEN標(biāo)準儲備液，用乙腈分別稀釋成濃度25、20、15、10和5 μg/mL的標(biāo)準工作液，用于標(biāo)準曲線的制作。參照參考文獻[15]中使用的檢測條件，根據(jù)本實驗實際情況進行改進，使用C18色譜柱 (250 mm× 4.6 mm，5 μm)，測試條件為流動相乙腈和水的體積比60∶ 40，流速1.0 mL/min，進樣量20 μL，柱溫30 ℃，選用紫外檢測器，檢測波長254 nm。樣品過0.22 μm有機濾膜，裝入自動進樣瓶中，用HPLC進行分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 ZEN標(biāo)準曲線的繪制

為了對酪丁酸梭菌的脫毒效果進行定量考察，根據(jù)標(biāo)準工作液的質(zhì)量濃度與峰面積關(guān)系制作了標(biāo)準曲線Y=2 375.91+41 547.56x，R2=0.999，見圖1。

由圖1可知：在5～25 μg/mL的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，線性關(guān)系較好。

圖1 ZEN標(biāo)準曲線Fig.1 The standard curve of ZEN

2.2 酪丁酸梭菌對ZEN的清除效果

2.2.1 時間對清除效果的影響

以初始菌體密度為1.0×1010個/mL的酪丁酸梭菌重懸于1 mL培養(yǎng)基(pH 4.0)，添加最終ZEN質(zhì)量濃度為20 μg/mL，于37 ℃下孵育2、4、6、8、10、12和24 h，清除毒素ZEN結(jié)果見圖2。

圖2 時間對酪丁酸梭菌清除ZEN的影響Fig.2 The impact of time on the removal of ZEN by Clostridium tyrobutyricum

由圖2可知：酪丁酸梭菌吸附清除ZEN是個持續(xù)的過程。在2 h時清除率為28.4%；在24 h后，達到最高值31.0%。隨著孵育時間的增加，細胞生長將會逐漸減慢，吸附發(fā)生后，細胞表面的結(jié)構(gòu)及其所帶電荷發(fā)生了改變，當(dāng)細胞生長力較強時，ZEN無法吸附到細胞表面；而當(dāng)細胞表面改變，細胞生長力降低，ZEN與細胞結(jié)合則相對容易，因此細胞吸附毒素的量總體呈逐漸上升趨勢[16]。但也有研究表明[17-18]：細胞吸附毒素是一個快速可逆的過程，當(dāng)吸附達到一定時間后，少量毒素也會釋放到溶液中，出現(xiàn)毒素清除率降低的情況，推測細胞與毒素之間結(jié)合的比較松散，而后毒素將被細胞重新結(jié)合。

2.2.2 溫度對清除效果的影響

溫度也是影響細胞結(jié)合ZEN的一個因素，因為細胞有合適的生長溫度，毒素也有存在的最適溫度。以初始菌體密度為1.0×1010個/mL的酪丁酸梭菌重懸于1 mL培養(yǎng)基(pH 4.0)，添加最終ZEN質(zhì)量濃度為20 μg/mL，分別于20 、30 、37和42 ℃下孵育24 h，清除毒素ZEN結(jié)果見圖3。

圖3 溫度對酪丁酸梭菌清除ZEN的影響Fig.3 The impact of temperature on the removal of ZEN by Clostridium tyrobutyricum

由圖3可知：溫度為37 ℃時ZEN清除率最高，推測可能與此溫度下菌體生長代謝活力最強有關(guān)[11]。

2.2.3 pH對清除效果的影響

以初始菌體密度為1.0×1010個/mL的酪丁酸梭菌重懸于1 mL 培養(yǎng)基(pH 分別為4.0、5.0、6.0、7.0和8.0)，添加最終ZEN質(zhì)量濃度為20 μg/mL，于37 ℃下孵育24 h，清除毒素ZEN結(jié)果見圖4。

由圖4可知：不同pH環(huán)境下，細胞吸附ZEN的效果也有差別，因為ZEN在不同pH溶液中的分子結(jié)構(gòu)有所不同。ZEN是一種內(nèi)酯型結(jié)構(gòu)，在堿性環(huán)境的條件下可以將酯鍵打開。根據(jù)Miao等[16]的研究表明，ZEN有2種酚式羥基。當(dāng)pH小于7時，ZEN主要以內(nèi)酯型的形式存在，因其非極性疏水作用，ZEN更易被細胞壁的非極性成分吸附或者進入內(nèi)部的非極性孔道；當(dāng)初始pH上升，在堿性環(huán)境的條件下可以將酯鍵打開，ZEN將形成陰離子，使其難與細胞表面的親水極性成分結(jié)合。因此，當(dāng)pH為4時，細胞對毒素的吸附效果較好。

圖4 pH對酪丁酸梭菌清除ZEN的影響Fig.4 The impact of pH on the removal of ZEN by Clostridium tyrobutyricum

2.2.4 不同預(yù)處理方法對清除效果的影響

為了考察酪丁酸梭菌清除ZEN的能力，選擇4種菌體密度1.0×108、1.0×109、1.0×1010和1.0×1011個/mL，分別通過使用不同處理方法對酪丁酸梭菌細胞進行處理，其對玉米赤霉烯酮的清除效果見圖5。

由圖5可知：當(dāng)菌體密度為1.0×108個/mL時，酪丁酸梭菌對ZEN就展現(xiàn)了清除的能力，隨著菌體濃度的升高，ZEN清除率也逐漸增大，尤其是菌體密度為1.0×1011個/mL時，活菌組(31.9%)、熱處理組(44.2%)和酸處理組(50.2%)的清除效果遠遠超過菌體密度為1.0×108個/mL，顯示出菌株處理ZEN最好的清除效果，但是與菌體密度為1.0×1010個/mL時的清除效果相當(dāng)，說明菌體密度的增大，有利于ZEN含量的降低，但當(dāng)菌密度超過一定后，對清除毒素的效果就不顯著了，這與Zhao等[17]利用植物乳酸菌吸附ZEN的研究結(jié)果類似。

圖5 不同細胞密度對清除ZEN的影響Fig.5 The impact of cell density on the removal of ZEN under different treatments

除此以外，當(dāng)菌體密度一定時，通過對比活菌組，熱處理組和酸處理組清除毒素的效果，發(fā)現(xiàn)酪丁酸梭菌經(jīng)過熱和酸處理后，清除毒素的能力明顯增強，且經(jīng)過酸處理后的酪丁酸梭菌在菌體密度為1×1010個/mL時，清除率可達49.3%，而熱處理組為42%，活菌組為30.4%，分別增加了7.3%和18.9%。這樣的結(jié)果可能有幾種解釋：1)熱處理和酸處理可能改變了活有機體的原始結(jié)合位點，并且暴露了新的結(jié)合位點[14]，這樣細胞的結(jié)合位點對ZEN的親和力就可能增加，從而表現(xiàn)出更好的清除效果；2)酪丁酸梭菌的細胞壁主要成分是多糖和肽聚糖，經(jīng)過熱處理可能會導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性，或者多糖與肽和蛋白質(zhì)之間形成了美拉德反應(yīng)產(chǎn)物；3)經(jīng)過酸處理，多糖的糖苷鍵斷裂，單體被釋放，進一步可轉(zhuǎn)化成醛。肽和蛋白質(zhì)間的酰胺鍵也被破壞，產(chǎn)生肽和氨基酸，且可能改變了肽聚糖的結(jié)構(gòu)和細胞壁的厚度，從而孔徑增加[17-18]，有利于細胞對ZEN的吸附清除。由此推斷，酪丁酸梭菌清除毒素的機制是吸附作用；且通過熱處理和酸處理，酶失去活性，這也證明了酪丁酸梭菌清除毒素不是在酶的作用下轉(zhuǎn)化為其他物質(zhì)。

2.3 酪丁酸梭菌菌株對高濃度ZEN的馴化研究

為了增強酪丁酸梭菌清除ZEN的能力，達到更好的清除效果，成為飼料添加劑中清除毒素的高效菌株，將其進行適應(yīng)性馴化培養(yǎng)，使其能夠在有毒素的環(huán)境中具備較高的耐受力和活動能力。將ZEN添加進酪丁酸梭菌的培養(yǎng)基中，以20 μL ZEN為起點，每代培養(yǎng)10 h后接種于下一代，每一代的培養(yǎng)基中均逐代增加20 μL ZEN，以此規(guī)則馴化50代，最后一代的ZEN添加量為1 000 μL，終濃度20 μg/mL。50代酪丁酸梭菌生長第10 h連成的生長曲線圖見圖6。

由圖6可知：從第1～第15代，酪丁酸梭菌生長第10小時的OD均較低，說明菌體生長緩慢，從第16代開始，酪丁酸梭菌OD逐漸增加，生長迅速，說明酪丁酸梭菌對ZEN的耐受性已逐漸增強，生存能力也逐漸增加。經(jīng)過適應(yīng)性馴化培養(yǎng)，猜想酪丁酸梭菌菌株的某種表型或者生理特性發(fā)生了改變，但目前具體機制不明，有待研究。且馴化后的酪丁酸梭菌不排除具有其他有害特性的可能，還有待進一步探究馴化后酪丁酸梭菌的代謝產(chǎn)物變化及毒性分析，繼而進行安全性評估。

圖6 酪丁酸梭菌生長曲線Fig.6 Growth curve of Clostridium butyricum

為了進一步測試馴化后的酪丁酸梭菌清除ZEN的能力，選擇1.0×109、1.0×1010和1×1011個/mL 3種菌體密度，同樣進行熱處理和酸處理，清除效果見圖7。

圖7 馴化后不同處理條件下細胞密度對清除ZEN的影響Fig.7 The impact of cell density on the removal of ZEN under different treatments after domestication

由圖7可知：馴化后的菌株清除ZEN的能力得到了顯著地提高，當(dāng)菌體密度達到1.0×1011個/mL時，經(jīng)過酸處理后的酪丁酸梭菌對毒素的吸附效果最好，可吸收ZEN達98.5%，并且酸處理組比未馴化酸處理組提高了48.3%，熱處理組比未馴化熱處理組提高了53.1%?？傮w來說，酸處理后的清除效果優(yōu)于熱處理。由此證明，通過連續(xù)培養(yǎng)馴化菌株的過程能夠獲得一株耐ZEN毒素性能較好的馴化菌株，同時，成功獲得具有生長優(yōu)勢的馴化菌株說明了ZEN濃度逐漸增加的條件下能夠提高菌株的耐受性能，維持菌株的細胞活性并保證其穩(wěn)定生長?？紤]到將來會將馴化的酪丁酸梭菌運用于實際中，除了其安全性有待考察外，將其加入飼料中吸附毒素后，飼料還需要進行沖刷、洗滌和烘干等步驟，以及時去除吸附毒素的酪丁酸梭菌菌體。

3 結(jié)論

酪丁酸梭菌作為新型的飼料添加劑，不僅能夠促進家禽腸道內(nèi)其他有益菌的快速生長，維持菌群平衡，在本文中得到驗證還能夠吸附飼料中的ZEN，起到有效清除飼料中毒素的效果。筆者考察了孵育時間、溫度、pH及初始菌濃對酪丁酸梭菌吸附ZEN效果的影響，且通過使用不同的處理方法對酪丁酸梭菌細胞進行處理，熱處理組和酸處理組吸附ZEN的效果明顯高于活菌組，并且菌體密度控制在1.0×1011個/mL時，經(jīng)過酸處理的酪丁酸梭菌清除ZEN的效果最佳。隨后酪丁酸梭菌經(jīng)過50代的連續(xù)培養(yǎng)馴化，其清除ZEN的能力明顯提高，在毒素環(huán)境中的生存能力也逐漸增強，同樣的，馴化后的酪丁酸梭菌經(jīng)酸處理后，初始菌體密度為1.0×1011個/mL，培養(yǎng)基pH為4.0，于37 ℃孵育24 h時，對ZEN的清除率可達到98.5%，實現(xiàn)了吸附的最佳效果。

由此，本研究為酪丁酸梭菌清除飼料中的ZEN毒素奠定了研究基礎(chǔ)，有望對飼料的改良提供理論依據(jù)，具有良好的應(yīng)用前景。