張安寧 劉 毅 王飛名 謝岳文 孔德艷 聶元元 張分云 畢俊國(guó) 余新橋 劉國(guó)蘭 羅利軍,*

節(jié)水抗旱稻恢復(fù)系的抗褐飛虱分子標(biāo)記輔助選育及抗性評(píng)價(jià)

張安寧1,2劉 毅1,2王飛名1謝岳文2孔德艷1聶元元3張分云1畢俊國(guó)1余新橋1劉國(guó)蘭1羅利軍1,2,*

1上海市農(nóng)業(yè)生物基因中心, 上海 201106;2華中農(nóng)業(yè)大學(xué)植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院, 湖北武漢 430070;3江西省超級(jí)水稻研究發(fā)展中心, 江西南昌 330200

褐飛虱是水稻的主要害蟲(chóng)之一, 利用水稻抗褐飛虱基因培育抗蟲(chóng)品種是目前公認(rèn)最經(jīng)濟(jì)有效、環(huán)境友好的策略。本研究利用水稻功能基因組已克隆的抗褐飛虱基因, 通過(guò)分子標(biāo)記輔助選擇和常規(guī)回交育種相結(jié)合的方法, 將抗褐飛虱基因、、和單獨(dú)和聚合導(dǎo)入到節(jié)水抗旱稻恢復(fù)系旱恢3號(hào), 獲得了一系列含有單基因、雙基因、三基因和四基因的改良系。采用標(biāo)準(zhǔn)苗期集團(tuán)篩選法進(jìn)行褐飛虱抗性鑒定, 評(píng)價(jià)這些基因在旱恢3號(hào)背景下的效應(yīng)及相互作用。表明單基因改良系中,的抗性最強(qiáng), 且>>>; 在聚合改良系中, 抗性均優(yōu)于單基因改良系, 四基因聚合改良系的抗性最強(qiáng), 不同基因型組合的抗性效應(yīng)是>>>>>。在自然條件下, 改良系與旱恢3號(hào)在株高、有效穗和千粒重等農(nóng)藝性狀上差異不顯著, 其他性狀與旱恢3號(hào)相仿或略差。本試驗(yàn)表明單獨(dú)和聚合導(dǎo)入、、和基因能顯著提高節(jié)水抗旱稻恢復(fù)系的褐飛虱抗性, 這4個(gè)基因的加性效應(yīng)明顯, 可為今后節(jié)水抗旱稻抗褐飛虱育種提供理論依據(jù)和材料基礎(chǔ)。

育種; 褐飛虱; 抗性基因; 分子標(biāo)記輔助選擇; 抗性評(píng)價(jià); 節(jié)水抗旱稻

水稻是主要糧食作物之一, 全世界近一半人口以其為主食[1]。褐飛虱(Brown planthopper,St?l, BPH)屬昆蟲(chóng)綱(Insecta)同翅目(Homoptera)飛虱科, 是一種水稻專(zhuān)食性昆蟲(chóng), 通過(guò)吸食水稻韌皮部汁液來(lái)獲取營(yíng)養(yǎng), 造成水稻的減產(chǎn)甚至絕收[2-3]。近年來(lái), 褐飛虱在中國(guó)、韓國(guó)、日本、越南等國(guó)家造成了水稻大面積減產(chǎn)。2005年報(bào)道, 中國(guó)直接減產(chǎn)270萬(wàn)噸大米, 越南損失達(dá)到40萬(wàn)噸[4]。對(duì)褐飛虱的防治, 培育抗褐飛虱品種是目前最經(jīng)濟(jì)、環(huán)保、有效的策略[5]。自20世紀(jì)70年代起, 各國(guó)相繼開(kāi)展了水稻褐飛虱抗性基因的發(fā)掘工作, 經(jīng)國(guó)際注冊(cè)確認(rèn)和報(bào)道的水稻抗褐飛虱基因共27個(gè), 其中已定位的有20個(gè)(http://www.ricedata.cn/gene/gene_bph. htm)。這些抗褐飛虱基因主要分布于水稻第2、第3、第4、第6和第12染色體, 并且傾向于成簇分布。和基因是分別被定位在藥用野生稻()導(dǎo)入系B5第3染色體長(zhǎng)臂和第4染色體短臂上的顯性抗性基因[6]。水稻資源Swarnalata中的顯性抗褐飛虱基因定位于水稻第4染色體長(zhǎng)臂上, 該基因是一個(gè)廣譜抗蟲(chóng)基因, 對(duì)多種生物型褐飛虱和白背飛虱均有抗性, 對(duì)水稻生長(zhǎng)和產(chǎn)量無(wú)不良影響, 在秈稻和粳稻背景下都有高抗性[7]。是來(lái)源于秈稻品種Pokkali的顯性基因, 被定位于第12染色體, 編碼一個(gè)CC- NBS-NBS-LRR結(jié)構(gòu)域[8]。隨著越來(lái)越多的抗褐飛虱基因的定位和克隆, 與抗性基因緊密連鎖的分子標(biāo)記開(kāi)發(fā), 育種家利用分子標(biāo)記輔助選擇對(duì)現(xiàn)有的品種進(jìn)行定向改良已經(jīng)成為抗褐飛虱育種中的常用手段, 并且顯著地提高了現(xiàn)有優(yōu)良品種的抗性[9-14]。

節(jié)水抗旱稻(water-saving and drought-resistance rice, WDR)是指既具有水稻的高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)特性、又具有旱稻節(jié)水抗旱特性的一種新水稻品種類(lèi)型[14], 是在水稻科技進(jìn)步的基礎(chǔ)上, 引進(jìn)旱稻的節(jié)水抗旱特性而育成的新品種。在灌溉條件下, 其產(chǎn)量、米質(zhì)與水稻基本持平, 但可節(jié)水50%以上; 在缺乏灌溉的田塊下, 具有較好的抗干旱能力(或基本具有旱稻品種的抗旱能力)。在栽培上, 簡(jiǎn)單易行, 投入低, 節(jié)能環(huán)保。節(jié)水抗旱稻因其節(jié)水抗旱、輕簡(jiǎn)栽培等特點(diǎn)深受農(nóng)民喜愛(ài), 在安徽、湖南、江西等地大面積推廣種植[15-17]。但是, 目前主推品種旱優(yōu)73對(duì)褐飛虱的抗性較弱, 因而只能依靠化學(xué)農(nóng)藥防治褐飛虱。2012年本研究通過(guò)分子標(biāo)記輔助選擇和常規(guī)回交育種, 將、、和等抗褐飛虱基因?qū)牍?jié)水抗旱稻恢復(fù)系旱恢3號(hào), 并評(píng)價(jià)抗褐飛虱基因的抗性效應(yīng)及其對(duì)受體親本主要農(nóng)藝性狀的影響, 為培育持久高抗褐飛虱節(jié)水抗旱稻新組合提供了優(yōu)異的種質(zhì)資源。

1 材料與方法

1.1 材料

水稻抗褐飛虱基因供體為珞珈6號(hào)和珞珈9號(hào)(9311背景, 分別攜帶和, 武漢大學(xué)何光存教授饋贈(zèng)), 自選恢復(fù)系R2003 (旱恢3號(hào)背景, 攜帶和)。受體親本為節(jié)水抗旱稻恢復(fù)系旱恢3號(hào)(來(lái)源6078/明恢86//旱恢13///ET28)。感蟲(chóng)對(duì)照為T(mén)N1。

1.2 分子標(biāo)記輔助選擇

選用與目標(biāo)基因連鎖的分子標(biāo)記RM5757[7](上游引物序列5′-CCTGAGACCATATGCTGCTG-3′; 下游引物序列5′-GAGGGAGCATCATTAGCTGG-3￠), 與目標(biāo)基因連鎖的分子標(biāo)記InD28432[8](上游引物序列5′-TGCAGACACCACATGCATAA-3′; 下游引物序列5′-A CGCATACACACAGGGACAA-3′), 與目標(biāo)基因連鎖的分子標(biāo)記76-2[13](上游引物序列5′-CTGCTGCTGCT CTCGTATTG-3′; 下游引物序列5′-CAGGGAAGCTCCAA GAACAG-3′), 與目標(biāo)基因連鎖的分子標(biāo)記MS5[13](上游引物序列5′-TTGTGGGTCCTCATCTCCTC-3′;下游引物序列5′-TGACAACTTTGTGCAAGATCAAA-3′), 對(duì)親本和回交后代進(jìn)行抗性基因檢測(cè), 相關(guān)的分子標(biāo)記均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。在苗期選取水稻幼嫩葉片, 采用CTAB法快速提取DNA, 參考前人方法[11]進(jìn)行PCR擴(kuò)增、電泳和銀染檢測(cè)。

1.3 苗期抗褐飛虱鑒定

鑒定苗期抗性采用國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)苗期群體篩選法。水稻浸種催芽后播種在鑒定圃水泥池內(nèi), 設(shè)每品種3個(gè)重復(fù), 每重復(fù)20株左右, 播后4 d定苗, 每重復(fù)保留秧苗15株。在秧苗二至三葉期按照每株接生物型II褐飛虱2~3齡若蟲(chóng)5~7頭的量進(jìn)行接蟲(chóng), 當(dāng)感蟲(chóng)對(duì)照品種TN1死苗率達(dá)到95%左右時(shí)調(diào)查結(jié)果。

分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)為, 0級(jí), 未受害; 1級(jí), 第1片葉部分發(fā)黃; 3級(jí), 植株有2片葉顏色變黃; 5級(jí), 植株顯著發(fā)黃, 并明顯矮小; 7級(jí), 植株僅有1片葉未枯死, 并嚴(yán)重矮小; 9級(jí), 植株枯死。稻苗抗性級(jí)別與被害級(jí)別之間關(guān)系是, 0級(jí)為免疫(I); 0~2級(jí)為高抗(HR); 2~4級(jí)為抗蟲(chóng)(R); 4~6級(jí)為中抗(MR); 6~8級(jí)為感蟲(chóng)(S); 8級(jí)以上為高感(HS)。

1.4 田間農(nóng)藝性狀調(diào)查

2018年夏, 種植所有材料于上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院莊行綜合試驗(yàn)站。5月18日播種, 6月15日移栽。每個(gè)材料種植6行7株, 每穴1株苗, 行距23.3 cm, 株距20 cm。移栽后, 按常規(guī)方法進(jìn)行田間管理。成熟后選取第3行的第3~5株室內(nèi)考種, 考察株高、穗長(zhǎng)、單株有效穗、每穗總粒數(shù)、結(jié)實(shí)率、千粒重和單株產(chǎn)量。采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 分子標(biāo)記輔助選擇選育抗褐飛虱改良系

2012年冬于海南陵水, 將珞珈6號(hào)和珞珈9號(hào)分別與節(jié)水抗旱稻恢復(fù)系旱恢3號(hào)雜交。2013年夏于上海莊行, 以分子標(biāo)記檢測(cè)和, 對(duì)F1單株進(jìn)行聚合雜交。2013年冬于海南陵水, 將F1與自育恢復(fù)系R2003雜交。2014年夏于上海莊行, 取F1共36個(gè)單株葉片, 以分子標(biāo)記檢測(cè)、、和, 檢測(cè)到7株四基因聚合的單株, 與旱恢3號(hào)雜交。2014年冬于海南陵水, 種植BC1F1株系36株, 檢測(cè)到2株四基因聚合的單株與旱恢3號(hào)進(jìn)行回交。2015年夏于上海莊行, 種植BC2F1株系36株, 檢測(cè)到1株四基因聚合的單株, 自交留種。2015年冬于海南陵水, 種植BC2F2株系376株, 檢測(cè)到3株四基因純合單株, 11株三基因純合單株, 8株兩基因純合單株, 7株單基因純合單株, 自交留種。之后按系譜法, 選取農(nóng)藝性狀優(yōu)良單株留種。2017年冬于海南陵水, 進(jìn)行分子標(biāo)記檢測(cè), 選取抗性基因純合、農(nóng)藝性狀優(yōu)良的單株留種。2018年夏于上海莊行, 對(duì)田間編號(hào)18R1~18R11的改良系進(jìn)行抗褐飛虱鑒定和田間主要農(nóng)藝性狀調(diào)查(圖1)。11個(gè)改良系的分子標(biāo)記檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖2。

2.2 抗褐飛虱改良系苗期抗性表現(xiàn)

2018年夏, 將旱恢3號(hào)及11個(gè)改良系送江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)應(yīng)用微生物研究所進(jìn)行褐飛虱的苗期抗性鑒定(表1)。輪回親本旱恢3號(hào)平均抗性指數(shù)為8.93, 表現(xiàn)高感, 而攜帶有抗性基因的11個(gè)改良系平均抗性指數(shù)為0.53~5.20, 表現(xiàn)中抗至高抗, 抗性明顯優(yōu)于輪回親本。單基因改良系抗性為>>>。和改良系抗性級(jí)別為抗蟲(chóng),和改良系抗性級(jí)別為中抗, 導(dǎo)入和改良系的苗期抗性?xún)?yōu)于和改良系。所有聚合改良系抗性級(jí)別都達(dá)到高抗, 均優(yōu)于單基因改良系, 抗性效應(yīng)是>>>>>, 其中四基因聚合改良系18R11的抗性表現(xiàn)最好, 平均抗性指數(shù)為0.53。

圖1 抗褐飛虱恢復(fù)系的選育

圖2 抗褐飛虱基因的分子標(biāo)記檢測(cè)

A: 檢測(cè); B: 檢測(cè); C: 檢測(cè); D: 檢測(cè)。M: D2000 marker; P1: 旱恢3號(hào); P2: 供體; 1~11: 改良系18R1~18R11。

A:-linked marker RM5757; B:-linked marker InD28432; C:-linked marker 76-2; D:-linked marker MS5. M: D2000 marker; P1: recurrent parent Hanhui 3; P2: donor parent; 1?11: improved lines 18R1?18R11.

2.3 抗褐飛虱改良系主要農(nóng)藝性狀調(diào)查

2018年夏, 在正常田間條件下, 對(duì)旱恢3號(hào)及其改良系田間農(nóng)藝性狀調(diào)查(表2)表明, 除18R1和18R3, 其他所有改良系的穗長(zhǎng)顯著或極顯著長(zhǎng)于對(duì)照旱恢3號(hào); 所有改良系的每穗總粒數(shù)極顯著少于對(duì)照旱恢3號(hào); 18R5的結(jié)實(shí)率顯著低于對(duì)照旱恢3號(hào), 18R7、18R8、18R9、18R10和18R11的結(jié)實(shí)率極顯著低于對(duì)照旱恢3號(hào); 18R1、18R5和18R10的單株產(chǎn)量顯著低于對(duì)照旱恢3號(hào), 18R3、18R6和18R11的單株產(chǎn)量極顯著低于對(duì)照旱恢3號(hào)。11個(gè)改良系的其他性狀與旱恢3號(hào)均無(wú)顯著差異。這表明導(dǎo)入抗褐飛虱基因后除穗長(zhǎng)、每穗總粒數(shù)和單株產(chǎn)量有改變外, 對(duì)其他農(nóng)藝性狀無(wú)顯著影響。

表1 苗期抗褐飛虱鑒定結(jié)果

#HR: highly resistant; R: resistant; MR: moderately resistant; HS: highly susceptible.

表2 改良品系的主要農(nóng)藝性狀

數(shù)據(jù)均為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤;*表示與對(duì)照旱恢3號(hào)在0.05水平顯著差異;**表示與對(duì)照旱恢3號(hào)在0.01水平極顯著差異。

The data are the average ± standard error;*indicates significant difference at the 0.05 probability level;**indicates significant difference at the 0.01 probability level.

3 討論

3.1 抗褐飛虱基因聚合

隨著水稻功能基因組研究的快速發(fā)展, 克隆了一批水稻抗褐飛虱基因, 并開(kāi)發(fā)出相應(yīng)的分子標(biāo)記, 加速了抗性基因在水稻褐飛虱抗性育種中的應(yīng)用。有許多研究將抗性基因?qū)氪竺娣e推廣的骨干親本, 并獲得一批抗性增強(qiáng)的材料[11-13]。但是, 單個(gè)基因的導(dǎo)入對(duì)品種的抗性提高有限, 并且容易使褐飛虱生物型轉(zhuǎn)變, 導(dǎo)致抗性喪失。多基因聚合不僅能利用不同性質(zhì)的抗性基因, 調(diào)動(dòng)不同層面的抗性機(jī)制, 而且能拓寬褐飛虱生物型抗譜, 從而達(dá)到持久高抗褐飛虱的效果。胡杰等[10]研究發(fā)現(xiàn)將和基因?qū)氩挥怠疁?A’, 雙基因聚合的不育系和所配的組合抗性級(jí)別均達(dá)到高抗。陳英之等[9]研究發(fā)現(xiàn)將和等抗褐飛虱基因?qū)?個(gè)雜交水稻親本獲得抗性基因聚合系, 苗期和成株期都對(duì)褐飛虱高抗。將和導(dǎo)入粳稻品種日本晴, 基因聚合導(dǎo)入系的抗性?xún)?yōu)于單基因系[20]。本研究首次將4個(gè)顯性抗褐飛虱基因、、聚合到褐飛虱高感恢復(fù)系旱恢3號(hào)中, 獲得的基因聚合改良系抗性效應(yīng)均優(yōu)于單基因改良系, 與前人的結(jié)果一致。這些聚合改良系的創(chuàng)制為進(jìn)一步培育持久高抗褐飛虱的品種奠定了良好的基礎(chǔ)。

在聚合改良系的創(chuàng)制中, 群體大小也是育種家比較關(guān)心的問(wèn)題。群體太小, 可能獲得不了目標(biāo)基因型; 群體太大, 增加田間雜交和分子檢測(cè)的工作量[21]。在本試驗(yàn)中,筆者認(rèn)為有兩點(diǎn)比較關(guān)鍵。首先, 嚴(yán)格控制低世代群體的規(guī)模, 本試驗(yàn)在F1、BC1F1和BC2F1世代都只種植了36株的小群體, 確?；驒z測(cè)的準(zhǔn)確性。其次, 種植BC2F2世代376個(gè)單株的大群體, 挑選目標(biāo)基因型純合的單株, 從而在以后的系譜選擇中不必重復(fù)進(jìn)行基因檢測(cè)。

3.2 抗性基因的效應(yīng)及相互關(guān)系

抗褐飛虱基因的效應(yīng)大小和相互關(guān)系是決定其在水稻抗性育種中應(yīng)用的關(guān)鍵, 同時(shí)抗性基因的持久性和效應(yīng)大小也受遺傳背景的影響。本研究的主要目的之一是通過(guò)鑒定各種基因型組合的抗性表現(xiàn), 來(lái)揭示在旱恢3號(hào)背景下, 抗性基因的效應(yīng)和相互關(guān)系, 為今后的節(jié)水抗旱稻抗性育種提供實(shí)踐指導(dǎo)。胡杰等[22]研究表明在9311背景下, 抗性基因效應(yīng)是>>。本研究中, 在旱恢3號(hào)背景下, 單基因改良系中的抗性最強(qiáng), 不同基因的抗性效應(yīng)是, 這與以前的研究結(jié)果一致[9,22]。許多研究表明, 抗性基因之間存在加性互作, 表現(xiàn)為抗性較單基因進(jìn)一步增強(qiáng)[18-20,22]。在本研究中, 聚合改良系的抗性明顯優(yōu)于單基因改良系, 證明抗性基因之間存在明顯的加性效應(yīng)。另外, 本研究發(fā)現(xiàn)只要攜帶基因型的改良系其抗性明顯高于其他聚合改良系。這2個(gè)基因聚合將是我們今后稻飛虱抗性改良的首選基因型。

3.3 農(nóng)藝性狀影響

利用分子標(biāo)記輔助選擇改良優(yōu)良親本, 育種家不僅要提高改良系的抗性水平, 更希望保持輪回親本的優(yōu)良農(nóng)藝性狀。李進(jìn)波等[12]將和導(dǎo)入9311, 配制的組合抗性和產(chǎn)量都優(yōu)于對(duì)照揚(yáng)兩優(yōu)6號(hào); 羅世友等[13]研究表明聚合和的改良系和受體親本的7個(gè)主要農(nóng)藝性狀, 除株高、有效穗和單穗重外, 改良恢復(fù)系的其他主要農(nóng)藝性狀與受體親本沒(méi)有顯著差異; 樓玨等[23]研究表明聚合、、和的改良系及其測(cè)交種在正常條件下的農(nóng)藝性狀與原始恢復(fù)系及其測(cè)交種相仿或更優(yōu)。本研究中, 11個(gè)改良系在大部分農(nóng)藝性狀上與旱恢3號(hào)無(wú)顯著差異, 與前人結(jié)果一致。但就結(jié)實(shí)率來(lái)看, 雖然單基因改良系與旱恢3號(hào)沒(méi)有顯著差異, 但聚合2個(gè)基因以上的改良系顯著低于旱恢3號(hào), 其中聚合4個(gè)基因的改良系18R11最低。本試驗(yàn)表明, 在進(jìn)行多基因聚合時(shí), 產(chǎn)生的遺傳累贅效應(yīng)較大, 需要通過(guò)繼續(xù)回交或擴(kuò)大回交群體來(lái)獲得農(nóng)藝性狀和抗性兼顧的株系。下一步本實(shí)驗(yàn)室將針對(duì)四基因聚合改良系進(jìn)行繼續(xù)回交工作, 利用分子標(biāo)記進(jìn)行前景和背景選擇并結(jié)合田間農(nóng)藝性狀調(diào)查, 以期獲得抗性和農(nóng)藝性狀同步改良的多基因聚合恢復(fù)系。

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Pyramiding and evaluation of brown planthopper resistance genes in water-saving and drought-resistance restorer line

ZHANG An-Ning1,2, LIU Yi1,2, WANG Fei-Ming1, XIE Yue-Wen2, KONG De-Yan1, NIE Yuan-Yuan3, ZHANG Fen-Yun1, BI Jun-Guo1, YU Xin-Qiao1, LIU Guo-Lan1, and LUO Li-Jun1,2,*

1Shanghai Agrobiological Gene Center, Shanghai 201106, China;2College of Plant Science and Technology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, Hubei, China;3Jiangxi Super Rice Research and Development Center, Nanchang 330200, Jiangxi, China

The brown planthopper (St?l, BPH) is the most serious pest threat to rice production across Asia. Increasing host-plant resistance is the most economical and ecological strategy for controlling this pest. The objective of this study was to survey the resistance effects of differentgenes to brown planthopper, reveal its influence on agronomic traits, and provide insights into molecular breeding of rice with resistance to brown planthopper. In this research, the brown planthopper R genes,,, andwere introgressed into the water-saving and drought-resistant rice restorer line ‘Hanhui 3’ through marker-assisted backcrossing scheme. The standard seedling group screening method was used to identify the resistance of the improved lines. Among single-gene improved lines, the order of thegenes effects was>>>, and among pyramiding improved lines, that was>>>>>. Furthermore, the survey of agronomic traits demonstrated that there were no significant differences between the 11 improved lines and recurrent parent ‘Hanhui 3’ in plant height, panicle number per plant and 1000-grain weight. These results suggest that the introgression of,,, andgenes by molecular marker-assisted selection technology could enhance the resistance to brown planthopper and improve breeding efficiency.

breeding; brown planthopper; resistance gene; marker-assisted selection; resistance evaluation; water-saving and drought-resistance rice

本研究由上海市種業(yè)發(fā)展項(xiàng)目(2019-02-08-00-08-F01110), 上海市科技興農(nóng)重點(diǎn)攻關(guān)(2018-02-08-00-08-F01553)和國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃(2017YFD0100304)資助。

This study was supported by the Shanghai Seed Industry Development Project (2019-02-08-00-08-F01110), the Shanghai Agriculture Applied Technology Development Program (2018-02-08-00-08-F01553), and the National Key Research and Development Program of China (2017YFD0100304).

羅利軍,E-mail: lijun@sagc.org.cn

E-mail: zan@sagc.org.cn

2018-12-20;

2019-06-12;

2019-07-09.

URL: http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.s.20190705.1300.008.html

10.3724/SP.J.1006.2019.82066