劉 浩 魯 清 李海芬 李少雄 陳小平 梁炫強 洪彥彬

花生硬脂酰-ACP酸脫飽和基因表達的分子機制

劉 浩 魯 清 李海芬 李少雄 陳小平 梁炫強*洪彥彬*

廣東省農(nóng)業(yè)科學院作物研究所 / 廣東省農(nóng)作物遺傳改良重點實驗室, 廣東廣州 510640

位于油酸合成通路的上游, 編碼硬脂酰-ACP脫飽和酶, 調(diào)控硬脂酸(C18:0)向油酸(C18:1)轉(zhuǎn)化。本研究發(fā)現(xiàn)高油酸品種開農(nóng)176種子發(fā)育前期的表達量升高, 而成熟期油酸過量積累會抑制的表達。利用開農(nóng)176與開農(nóng)70構(gòu)建F2雜交群體, 發(fā)現(xiàn)當植株油酸含量超過60%時會從整體水平上抑制的表達。種子發(fā)育前期, 油酸不斷積累會導致過氧化物酶活性升高, 并且活性氧含量隨之增加; 但是在種子發(fā)育后期均降低, 該結(jié)果與的表達量變化趨勢相同。亞細胞定位結(jié)果表明,與分別定位于葉綠體與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。編碼區(qū)序列多態(tài)性分析顯示, 該蛋白序列氮端的氨基酸結(jié)構(gòu)缺失可能會導致硬脂酸含量升高。啟動子序列存在大量AT堿基的富集區(qū)域, 并且含有光響應、激素調(diào)控、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的保守順式元件。本研究發(fā)現(xiàn)過量積累的油酸會激活過氧化物酶介導的活性氧信號途徑, 進而通過細胞核內(nèi)的未知轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)上游基因的表達量, 該結(jié)果不僅拓展了對的功能認知, 也為培育高油酸花生品種提供了相關(guān)的理論指導。

花生; 高油酸;; ROS; 反饋調(diào)節(jié)

油酸分子為18碳烯酸, 因第9位與第10位碳原子間存在雙鍵而形成單不飽和脂肪酸, 且第12位碳原子繼續(xù)脫氫后會生成亞油酸。()基因位于油酸合成通路的下游, 是控制油酸(C18:1)向亞油酸(C18:2)轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵因子[5]。花生的2種隱性突變型與可阻斷油酸向亞油酸轉(zhuǎn)化, 是調(diào)控花生高油酸性狀的主要基因?；诖嗽? 通過選育攜帶基因的品種, 是目前花生高油酸育種的主要策略[6]。經(jīng)過多年探索, 我國已培育出諸多油酸含量(油酸/總脂肪酸)高于70%的花生品種, 例如花育32、開農(nóng)176、冀花16、桂花37等[7]。

對培育高油酸花生做出了巨大貢獻, 而調(diào)控油酸合成的上游基因并未被廣泛應用于育種實踐。[8](Stearoyl-ACP Desaturase 2)編碼存在于質(zhì)體與細胞基質(zhì)內(nèi)的可溶性硬脂酰-ACP脫飽和酶, 在18碳脂肪酸長鏈的C9和C10之間加入雙鍵(圖1-A), 將硬脂酰-ACP轉(zhuǎn)化為油酰ACP后, 機體利用乙酰輔酶A轉(zhuǎn)運途徑將油酰-ACP輸入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)繼而合成油酸, 該反應決定了植物體內(nèi)油酸的含量[8]。多數(shù)高等植物中,呈現(xiàn)組織特異性表達, 且在發(fā)育的種子內(nèi)表達量比其他組織要高[9]。此外,兼具調(diào)控多種植物生理生化反應的功能。擬南芥突變體內(nèi)硬脂酸(C18:0)含量增加, 油酸(C18:1)含量降低, 結(jié)果增強了水楊酸與茉莉酸介導的抗病反應[10]; 敲除水稻的基因, 植株提高了稻瘟病及白葉枯抗性[11-12]; 過量表達小麥同源基因, 轉(zhuǎn)基因擬南芥植株對白粉病的抗性降低[13]。研究表明, 在花生克隆的3個同源基因中,與在種子中表達量較高, 隨著種子發(fā)育兩者表達水平持續(xù)升高; 而在花中的表達量較高, 只在種子發(fā)育的早期呈現(xiàn)上調(diào)表達趨勢; 并且異位表達花生可提高酵母體內(nèi)的油酸含量[14]。但是, 花生基因的研究尚處于基因克隆階段, 具體分子功能研究相對滯后。因此, 充分解釋在花生種子發(fā)育階段調(diào)控油酸合成的分子機制, 有助于為高油酸育種提供理論指導, 該基因可能是繼續(xù)提高油酸含量的潛在突破點。

花生為異源四倍體豆科植物, 其油酸合成的蛋白調(diào)控網(wǎng)絡仍不清楚。鑒于此, 本課題組前期以花生高油酸品種開農(nóng)176 (Kainong 176, KN176)與對照種開農(nóng)70 (Kainong 70, KN70)為材料, 采用ITRAQ (Isobaric Tags for Relative and Absolute Quantitation)技術(shù)分析種子動態(tài)發(fā)育的差異蛋白, 發(fā)現(xiàn)在開農(nóng)176中, 種子成熟階段高度積累的油酸可能反饋抑制上游關(guān)鍵限速酶基因的表達量[15], 即生成產(chǎn)物抑制限速酶活性, 而反饋抑制的具體原因并不清楚, 本研究則針對該問題進行深入研究。

1 材料與方法

1.1 花生材料

花生普通品種開農(nóng)70與高油酸品種開農(nóng)176種子均由開封市農(nóng)林科學院谷建中研究員提供, 相同栽培條件下, 分別在2個品種果針入土后的第20、30、40、50、60、70 d (day after flowering, DAF)取發(fā)育的種子開展相關(guān)研究[15]。利用2個品種構(gòu)建F2代雜交群體, 該群體單株油酸含量變異幅度為40%~75%。本研究所用到的種質(zhì)資源均有國家油料改良中心南方花生分中心提供。

1.2 種子總RNA提取及RT-PCR分析

花生種子經(jīng)液氮研磨后, 取0.1 g粉末, 利用Invitrogen的TRIZOL試劑提取總RNA。取1 μg RNA,利用TOYOBO的FSK-100 cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成第一條單鏈cDNA備用。熒光定量PCR的總反應體積為20 μL, 所用試劑為SYBR Premix Ex(TaKaRa, 中國大連), 儀器為ABI StepOne Plus系統(tǒng)。所用的熒光定量引物由Invitrogene公司合成, 利用2–ΔΔCT進行計算差異基因表達倍數(shù)[16]。內(nèi)參基因為(F: 5￠-GACGCTTGGCGAGATCAACA-3￠, R: 5￠-AACCGGACAACCACCACATG-3￠),熒光定量引物為F: 5￠-TACTTGATTGGCTCTGGAATGGA T-3￠, R: 5￠-TTCTTCCTCATCATGTCAGCAA-3￠。

1.3 過氧化物酶活性及活性氧H2O2含量測定

花生種子經(jīng)液氮研磨至粉末狀, 取300 mg粉末轉(zhuǎn)移至5 mL離心管, 4 mL 0.05 mol L-1PBS緩沖液(pH 7.8)重懸, 10,000 ×離心沉淀15 min, 轉(zhuǎn)移上清溶液至新的5 mL離心管。POD活性表示為體外降解H2O2的速率, 愈創(chuàng)木酚作為氫離子供體, 436 nm波長下用分光光度計檢測愈創(chuàng)木酚氧化酶顏色的變化速率。采用鐵二甲酚橙方法測定過氧化氫含量。預冷的丙酮研磨花生種子, 過濾掉殘渣, 用CCl4-CHCl3抽提上清液, 轉(zhuǎn)移至新的離心管中, 加入250 μmol L-1硫酸亞鐵銨鹽、100 μmol L-1山梨醇、100 μmol L-1二甲酚橙和25 mmol L-1的濃硫酸, 混合后黑暗室溫下反應30 min, 測量溶液在560 nm波長下的吸光度[17]。

1.4 亞細胞定位

與不含終止密碼子的全長編碼序列克隆到載體pNA580 (p35S-GFP)上, 將構(gòu)建好的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α, 利用DNA提取試劑盒(Omega)提取大腸桿菌質(zhì)粒, Nanodrop-1000檢測-GFP與-GFP質(zhì)粒濃度, 約30 μg μL-1。將擬南芥葉片切成細絲, 加入酶解液[含1.5% Cellulase RS (w/v)、0.75% Macerozyme R-10 (w/v)、0.6 mol L-1mannitol、10 mmol L-1MES、10 mmol L-1CaCl2、0.1% BSA; pH 5.7]游離5 h, 用W5溶液(含有154 mmol L-1NaCl、125 mmol L-1CaCl2、5 mmol L-1KCl、2 mmol L-1MES; pH 5.7)洗滌原生質(zhì)體2次, MMG溶液(含有0.4 mol L-1mannitol、15 mmol L-1MgCl2、4 mmol L-1MES; pH 5.7)重懸。加入10 μL-GFP與-GFP質(zhì)粒經(jīng)40% PEG-4000介導共同轉(zhuǎn)化擬南芥原生質(zhì)體, 16 h后使用激光共聚焦顯微鏡Carl Zeiss LSM 780檢測觀察。-GFP引物為F: 5￠-GTTGTTACTAGTATGGCTCTGAGGCTG AACCCTAAC-3￠, R: 5￠-GTTGTTCCCGGGGAGTTG CACTTCCCTATCGTAAAT-3￠;-GFP引物為F: 5￠-GTTGTTTCTAGAATGGGAGCTGGAGGGCGTGTCACT-3￠, R: 5￠-GTTGTTGGATCCGAACTTGTTC TTGTACCAATAAAC-3￠。

1.5 脂肪酸含量測定

脂肪酸含量檢測采用國標GB/T 17377-2008/ ISO 5508:1990。100 mg的花生種子經(jīng)液氮研磨成粉末狀, 加1.5 mL氯仿/甲醇(2∶1, v/v)與100 μL內(nèi)標C17:0 (1 mg mL-1)溶液, 超聲波輔助提取30 min, 12,000 ×離心6 min, 取1 mL上清液轉(zhuǎn)移到新的離心管中。在脂肪酸粗提溶液中加0.2 mL KCl (75%, w/v)溶液, 12,000 ×離心6 min, 轉(zhuǎn)移400 μL氯仿相到新的離心管內(nèi), 加2 mL硫酸甲醇(5∶95, v/v), 85℃水浴1.5 h。隨后加1 mL H2O與1 mL己烷, 混合液體5000 ×離心5 min, 加入500 μL己烷提取相用于氣相色譜檢測?；ㄉ煞N子無損傷脂肪酸成份檢測采用近紅外谷物分析儀Perten DA7250。

2 結(jié)果與分析

2.1 油酸積累反饋調(diào)節(jié)FAB2的表達

開農(nóng)176的油酸含量約占總油脂的70%, 開農(nóng)70的油酸含量約占總油脂的45% (圖1-B, E)。利用RT-PCR在種子發(fā)育的6個時期(20~70 DAF)檢測的表達量顯示,的表達量在高油酸種子發(fā)育的第20~40天呈上升趨勢, 且顯著高于正常品種; 而進入種子發(fā)育的后期(50~70 DAF), 高油酸種子內(nèi)的表達豐度逐漸降低, 而在正常品種內(nèi),的表達量呈逐漸增加的趨勢(圖1-C, D)。開農(nóng)176種子發(fā)育階段油酸呈逐漸增加的趨勢(圖1-F), 該趨勢與的表達量呈負相關(guān)。該結(jié)果表明, 隨著花生種子內(nèi)油酸含量的增加會反饋調(diào)節(jié)上游合成基因的表達量。

對場效應器件的進一步改進方法是采用三維石墨烯通道，來增強器件的性能并減小功耗。Ameri等[20]研制了基于涂有HfO2薄膜的石墨烯懸浮網(wǎng)絡的pH傳感器，此傳感器在高離子強度[(289±1) mmol/L]的介質(zhì)中也顯示出極高的pH敏感性[(71±7) mV/pH]，這歸因于電解液中懸浮的三維石墨烯材料，提高了電解液與通道間的靜電耦合效率以及電解液中離子對器件通道的柵極控制能力。同時，涂有HfO2薄膜的石墨烯為氫離子提供了結(jié)合位點，從而提高了檢測靈敏度。

2.2 反饋調(diào)節(jié)FAB2表達的油酸積累閥值

從F2群體中篩選出25個具有代表性的單株, 在種子發(fā)育的成熟期(70 DAF)進行油酸與亞油酸含量檢測, 其油酸含量變化幅度為40.30%~72.74% (圖2-A)。并以F2-25單株為對照, 相對應地檢測每個單株種子成熟期(70 DAF)的表達量, 結(jié)果油酸含量為46.23%~54.77%的單株, 其的表達量顯著高于對照單株; 但是隨著油酸含量的不斷升高且超過60.21% (F2-12)時,的表達量迅速降低, 當油酸含量超過66.17% (F2-6)時,的表達水平相對于對照單株表達量非常微弱(圖2-B)。因此, 可以肯定花生植株的油酸含量超過60%則會抑制的表達。

2.3 油酸積累影響POD活性及H2O2含量

在種子發(fā)育的6個階段, 對過氧化物酶活性以及H2O2的含量進行檢測顯示高油酸種子發(fā)育的第30~40天, 過氧化物酶活性顯著高于正常品種開農(nóng)70, 第50~70天POD活性逐漸降低直至檢測不到(圖3-A)。高油酸種子發(fā)育的第30~40天, H2O2含量顯著高于正常品種, 并且在種子發(fā)育后期逐漸降低(圖3-B)。表明過度積累油酸不僅會影響過氧化物酶活性, 亦可能通過POD介導脂肪酸氧化反應, 進而導致H2O2含量升高。

圖1 花生油酸積累反饋調(diào)節(jié)FAB2的表達量

A: 油酸合成示意圖; B: 開農(nóng)176與開農(nóng)70的植株照片; C: 種子發(fā)育的6個時期; D:在高、低油酸品種種子發(fā)育過程中的表達變化量; E: 開農(nóng)176與開農(nóng)70的油酸與亞油酸含量; F: 開農(nóng)176與開農(nóng)70種子發(fā)育階段油酸與亞油酸含量變化。

A: schematic diagram of oleic acid synthesis; B: photograph of Kainong 176 and Kainong 70; C: photograph of the six stages in the developing seeds; D: expression level ofduring seeds development in the high- and normal-oleic varieties; E: contents of oleic acid and linoleic acid in Kainong 176 and Kainong 70; F: relative content changes of oleic acid and linoleic acid during seed development in Kainong 176 and Kainong 70.

2.4 FAB2與FAD2的亞細胞定位

利用擬南芥的原生質(zhì)體細胞, 對-GFP與-GFP的亞細胞定位進行活體檢測顯示,- GFP融合蛋白釋放的綠色熒光與葉綠體Marker釋放的紅光重合, 表明主要被定為在葉綠體; 而-GFP的綠色熒光與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Marker的紅光重合后顯示為明亮的黃色熒光, 黃色熒光被葉綠體自激活的粉色熒光包裹, 表明定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(圖4)。亞細胞定位結(jié)果表明,與雖然位于油酸合成的上游與下游, 但是兩者存在細胞器間的隔離關(guān)系。

2.5 FAB2 CDS序列多態(tài)性分析

是否對油酸具有一定的調(diào)控作用, 本研究首先克隆了的全長CDS序列, 并利用不同的種質(zhì)資源, 對的編碼區(qū)序列多態(tài)性進行了分析。FAB2蛋白含有406個氨基酸殘基, 且第85至第400位氨基酸區(qū)段為脂肪酸脫飽和酶結(jié)構(gòu)域(圖5),第148位氨基酸處含有乙酰ACP脫飽和酶, 為FAB2蛋白發(fā)揮功能最主要的結(jié)構(gòu)域。高油酸開農(nóng)176與正常品種開農(nóng)70的編碼區(qū)序列存在16個位點的差異, 但是305 bp與614 bp位點處的突變導致氨基酸序列102的甘氨酸變?yōu)楣劝彼? 205處的

圖2 花生FAB2表達受抑制的油酸積累值

A: F2群體單株的油酸與亞油酸含量。OA: oleic acid; LOA: linoleic acid。B: F2群體單株的表達量變化。F2-25位對照單株, 柱狀圖結(jié)果表明3次獨立重復。

A: contents of oleic acid and linoleic acid in the individual plant of F2population. OA: oleic acid; LOA: linoleic acid. B: relative expression ofin the individual plant of F2population. F2-25 as the control, bar value represented three independent replications.

圖3 POD活性與H2O2含量變化

A: POD活性檢測; B: H2O2含量檢測; **代表< 0.01, *代表< 0.05。

A: changes of POD activity; B: changes of H2O2content; **< 0.01, *< 0.05.

亮氨酸變?yōu)榻z氨酸, 這兩處突變均位于FAB2蛋白的核心結(jié)構(gòu)域內(nèi)[15]。通過克隆不同種質(zhì)資源中的基因, 構(gòu)建基因進化樹表明,可被劃分為5個具有代表性的亞家族(圖5); 其中HZ-152品種的硬脂酸含量較高, 可達到5.6% (表1), 但其FAB2 41蛋白(FAB41)的氨基端(N端)含有6個氨基酸殘基的缺失, 該區(qū)域的氨基酸缺失可能會影響FAB2的蛋白活性, 導致硬脂酸含量增加(圖6)。編碼序列比對結(jié)果表明, FAB2蛋白序列在不同的種質(zhì)資源中常呈現(xiàn)氨基與羧基端發(fā)生多態(tài)性, 但是其發(fā)揮主要功能的核心結(jié)構(gòu)域很少出現(xiàn)氨基酸位點的變異。

圖4 FAB2與FAD2的亞細胞定位

表1 種質(zhì)資源農(nóng)藝性狀

(續(xù)表1)

圖5 不同花生種質(zhì)的FAB2蛋白進化樹

圖6 不同花生種質(zhì)FAB2蛋白序列多重比對

2.6 FAB2啟動子序列分析

本研究發(fā)現(xiàn)高油酸通過活性氧途徑反饋調(diào)節(jié)的表達, 那么啟動子區(qū)域是否存在其他保守元件響應油酸激活的信號通路。于是利用Peanutbase數(shù)據(jù)庫, 克隆了上游的1474 kb的啟動子序列, 并利用PlantCare數(shù)據(jù)庫, 對啟動子序列進行保守元件預測。預測結(jié)果顯示,上游啟動子區(qū)間存在多種保守元件, 依照功能劃分, 最多的為光響應元件, 其次是激素響應元件, 包括赤霉素、生長素、茉莉酸響應元件, 以及MYB、MYC等轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合元件(表2)。按照序列特異性分析,的啟動子區(qū)間存在大量的AT堿基富集的區(qū)域(圖7-A)[18], 這些AT-rich基序是許多核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子與染色質(zhì)調(diào)控的保守區(qū)間, 可能對調(diào)控的表達量至關(guān)重要。

3 討論

脂肪酸脫飽和酶基因位于油酸合成通路的下游, 其突變后抑制油酸向亞油酸轉(zhuǎn)化, 導致花生種子內(nèi)油酸含量增加,的亞細胞定位表明該過程主要發(fā)生在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。油酸的合成前體是C18:1- ACP, 主要由調(diào)節(jié)硬脂酰-ACP (C18:0-ACP)脫飽和形成,的亞細胞定位顯示該反應主要發(fā)生在細胞的質(zhì)體內(nèi)?；ㄉ堑湫偷牡厣祥_花、地下結(jié)果作物, 其果針進入土壤后, 種子發(fā)育過程中不受光照影響[19], 可以推斷主要在細胞的質(zhì)體中發(fā)揮主要功能。油酰-ACP必須被轉(zhuǎn)化為油酰-CoA,再通過乙酰輔酶A轉(zhuǎn)運系統(tǒng)由質(zhì)體輸送進內(nèi)質(zhì)網(wǎng), 由于的突變, 油酰-CoA不能向亞油酸轉(zhuǎn)化, 使得脫去輔酶A的游離態(tài)脂肪酸C18:1與甘油骨架生成高含量的三酰甘油進行儲存[20]。油酸過量積累使種子體內(nèi)增加了對人體較為有益的油酸分子, 但是對于植株生長卻產(chǎn)生負向效應, 擬南芥與水稻的同源突變體均表現(xiàn)出植株矮小、而且不飽和脂肪酸的種類隨之減少, 細胞膜流動性降低, 植株對低溫敏感[21]。種子是植物用于繁衍后代的載體, 各類儲存物質(zhì)相對均衡有利于萌發(fā), 過量積累的油酸使得單一類型的貯藏物質(zhì)增加, 不利于成熟種子萌發(fā), 因此機體需要將過量積累的油酸氧化代謝, 以消除后續(xù)種子萌發(fā)時產(chǎn)生的負向作用[22]。脂肪酸氧化過程中, 過氧化物酶發(fā)揮著重要作用, 脂肪酸長鏈的2次氧化均發(fā)生在過氧化物酶體內(nèi)[23], 本研究發(fā)現(xiàn)POD的活性、H2O2含量以及的表達量在種子發(fā)育的6個時期均呈現(xiàn)出相同的變化趨勢, 前期升高, 后期降低。油酸過量積累可能會通過活性氧途徑反饋調(diào)節(jié)的表達量, 即過量積累的油酸可能會在過氧化物酶體發(fā)生氧化代謝反應, 該反應釋放的活性氧信號傳遞進入細胞核后, 利用轉(zhuǎn)錄因子抑制的表達, 導致質(zhì)體定位的FAB2蛋白豐度降低, 繼而使合成的底物油酰-ACP含量降低(圖7-B), 油酸抑制表達的跨細胞器調(diào)節(jié)的機制仍然需要深入研究。

圖7 油酸調(diào)控FAB2表達的模型

A:啟動子區(qū)域內(nèi)AT堿基富集區(qū)域示意圖; B: 油酸反饋調(diào)節(jié)表達的假定模型。

A: schematic diagram of AT-rich region inpromotor sequence; B: a proposed putative model of oleic acid feedback regulatingexpression.

表2 FAB2啟動子區(qū)間保守元件

的編碼區(qū)序列相對較為保守, 篩選不同花生種質(zhì)資源中的等位基因, 發(fā)現(xiàn)其編碼區(qū)5￠和3￠端的序列存在堿基多態(tài)性, 根據(jù)堿基多態(tài)性可將劃分為5種亞類型, 而核心的?；舅崦擄柡兔附Y(jié)構(gòu)域內(nèi)氨基酸位點差異相對較少。FAB2蛋白的核心結(jié)構(gòu)域相對保守, 對調(diào)控硬脂酸向油酸轉(zhuǎn)化具有重要作用, 但是氨基酸序列N端的結(jié)構(gòu)缺失可能會導致蛋白酶催化活性降低, 從而使得花生種子硬脂酸(C18:0)含量升高?；ㄉ拖鄬τ诟叨说拈蠙煊鸵约吧讲栌? 其油脂中的硬脂酸含量相對較高, 硬脂酸為飽和脂肪酸, 低溫存儲條件下油品易出現(xiàn)絮狀沉淀?；蚴钦{(diào)控18碳的飽和脂肪酸向不飽和脂肪酸轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵限速因子, 該蛋白酶活性直接影響食用油種子體內(nèi)不飽和脂肪酸的含量, 飽和脂肪酸對人體健康不利, 因此通過種質(zhì)資源篩選獲得的強優(yōu)勢等位基因, 是減少種子飽和脂肪酸含量的有效方法。同時,的強優(yōu)勢等位基因挖掘也能夠為高油酸花生育種提供理論指導,即建立“開源節(jié)流”型高油酸育種策略。突變會導致油酸含量增加, 但是現(xiàn)有高油酸品種油酸含量通常為70%以上, 若在突變體內(nèi)過量表達,理論上可以繼續(xù)提高油酸含量。再者, 花生含有野生種A與B兩套基因組,同時突變, 雖增加油酸含量, 但是與原種對比會出現(xiàn)產(chǎn)量降低的負面影響, 能否在單一基因突變體或中過量表達的強優(yōu)勢等位基因以增加油酸含量, 并且降低突變導致的不利表型仍需要深入研究。

本研究發(fā)現(xiàn)的表達與活性氧信號爆發(fā)存在正相關(guān),啟動子序列存在大量保守的順式作用元件, 光響應元件數(shù)量最多, 由于花生種子發(fā)育的特殊性, 推測光響應元件主要在植株的地上部分調(diào)控的表達; 此外,啟動子區(qū)還含有赤霉素、生長素、茉莉酸信號的調(diào)控元件。擬南芥的突變體兼具調(diào)控茉莉酸與水楊酸的交互途徑, 從而影響植株的抗病性,突變導致油酸不能向亞油酸轉(zhuǎn)化, 亞油酸在的作用下生成亞麻酸, 亞麻酸通過LOX酶氧化作用生成茉莉酸合成的前體物質(zhì)[24]。花生高油酸品種內(nèi)由于的突變, 導致茉莉酸合成的主要途徑被截斷, 亞油酸、亞麻酸含量均減少, 可能會導致茉莉酸含量減少, 而的啟動子元件內(nèi)存在2個茉莉酸信號整合元件, 本研究推測的表達量在高油酸種子發(fā)育的后期受到抑制, 可能與激素合成途徑存在密切關(guān)系,的表達不僅受到活性氧信號的調(diào)節(jié), 也可能受到茉莉酸信號途徑的影響。

4 結(jié)論

突變導致的高油酸表型反饋調(diào)節(jié)表達, 在種子發(fā)育前期升高, 后期降低。油酸積累增加了種子內(nèi)活性氧含量, 進而影響的表達, 并且明確了油酸積累抑制表達的閾值。定位于葉綠體, 氨基酸序列的突變會抑制自身的蛋白酶活性,啟動子序列存在大量AT堿基富集區(qū)以及多種順式調(diào)節(jié)元件。

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Molecular mechanism of stearoyl-ACP desaturase geneexpression in peanut

LIU Hao, LU Qing, LI Hai-Fen, LI Shao-Xiong, CHEN Xiao-Ping, LIANG Xuan-Qiang*, and HONG Yan-Bin*

Crops Research Institute, Guangdong Academy of Agricultural Science / Guangdong Provincial Key Laboratory of Crop Genetic Improvement, Guangzhou 510640, Guangdong, China

Stearoyl-ACP desaturase, encoded by, and located on the upstream of oleic acid biosynthesis pathway, modulates the conversion of stearic acid (C18:0) into oleic acid (C18:1). The expression ofwas increased at the early stage of seed development in high-oleic variety Kainong 176, but over-accumulated oleic acid repressed theexpression at the period of seed maturation. An F2hybrid population was constructed using Kainong 176 and Kainong 70, showing that the content of oleic acid up to 60% directly repressed theexpression on the whole. The activity of peroxidase (POD) and content of ROS were increased at the early stage of seed development with the oleic acid gradual accumulation, but decreased at the maturation stage. Subcellular localization analysis indicated thatandwere located on chloroplast and endoplasmic reticulum, respectively. Encoding sequence polymorphism analysis ofsuggested that amino acid deficient at the N-terminal of FAB2 protein sequence probably induced the high content of stearic acid in peanut. Furthermore, the promotor sequence ofcontained multiple AT-rich region, and possessed the light responsive, hormone regulation, and transcription factor binding site-regulating elements. Taken together, this study found that over-accumulated oleic acid activated the POD-induced ROS robust pathway, and then regulated the expression ofby unknown transcription factor in nucleus. The results extend the knowledge offunction, and provide a relevant theoretical guidance in future peanut breeding for high oleic acid.

peanut; high oleic acid;; ROS; feedback regulation

本研究由國家自然科學基金項目(31771841, 31801401), 廣東省自然科學基金項目(2017A030311007), 國家重點研發(fā)計劃項目(2018YFD0201009-02)和廣東省農(nóng)業(yè)科學院優(yōu)秀博士計劃聯(lián)合資助。

This study was supported by the National Natural Science Foundation of China (31771841, 31801401), the Natural Science Foundation of Guangdong Province (2017A030311007), the National Key Research and Development Program (2018YFD0201009-02), and Excellent PhD Program of Guangdong Academy of Agricultural Science.

梁炫強, E-mail: liangxuanqiang@gdaas.cn; 洪彥彬, E-mail: hongyanbin@gdaas.cn

E-mail: liuhao2054@stu.scau.edu.cn

2019-01-02;

2019-05-12;

2019-05-30.

URL: http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20190530.0959.002.html

10.3724/SP.J.1006.2019.94003