王前進(jìn)，方 琦 ，葉恭銀

（1.洛陽師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，河南 洛陽 471000；2.浙江大學(xué)昆蟲科學(xué)研究所/水稻生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部作物病蟲分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310058）

【研究意義】水稻矮縮病毒（Rice dwarf virus，RDV）是水稻普通矮縮?。╮ice dwarf disease）的病原，屬于呼腸孤病毒科（Reoviridae）植物呼腸孤病毒屬（Phytoreovirus）［1］。該病害在水稻整個生長發(fā)育期內(nèi)均可發(fā)生，嚴(yán)重時可造成水稻大面積減產(chǎn)，甚至絕收［2-3］。黑尾葉蟬Nephotettix cincticeps（Uhler）是水稻上重要的害蟲，在我國大部分稻區(qū)都有為害，不僅可以直接刺吸水稻汁液造成危害，還可作為媒介昆蟲以持久性方式傳播水稻普通矮縮病、黃矮病和黃萎病等多種病毒病，間接地給水稻產(chǎn)業(yè)造成了更為嚴(yán)重的損失［4-6］。媒介昆蟲是病毒病傳播的重要途徑，病毒病的傳播依賴于特定的媒介昆蟲，蟲傳病毒病害的防控不同于真菌與細(xì)菌等病害的防治，既要控制病毒本身，又要通過控制介體昆蟲來控制病毒病害的蔓延與流行［7］。長期進(jìn)化過程中，病毒-昆蟲-寄主植物三者間形成了復(fù)雜而特異的互作關(guān)系，這種協(xié)同進(jìn)化關(guān)系不僅是生態(tài)學(xué)、進(jìn)化生物學(xué)等理論學(xué)科的重要研究內(nèi)容，同時也是病害防控措施制定的理論基礎(chǔ)［8］。因此，探明水稻矮縮病毒對黑尾葉蟬的生長發(fā)育和種群增長情況等的影響，對于害蟲種群治理和水稻病毒病可持續(xù)控制具有重要意義。

【前人研究進(jìn)展】近年來，以病毒-介體昆蟲-寄主植物作為研究對象，從生態(tài)學(xué)水平、分子水平等解析三者復(fù)雜的互作關(guān)系取得了諸多重要進(jìn)展［7］。病毒對介體昆蟲的影響分為直接影響和間接影響兩個方面，直接影響是病毒在媒介昆蟲體內(nèi)滯留對昆蟲生物學(xué)特性的影響［9-10］；間接影響是病毒侵染寄主植物后會引起植物的光合作用、次生代謝、營養(yǎng)成分、信號途徑等發(fā)生變化，繼而影響介體昆蟲的生物學(xué)特性，最終會影響介體對于病毒的傳播［8］。這種由寄主植物介導(dǎo)的三者互作關(guān)系是決定昆蟲種群增長和田間病害流行的重要因素［11］。水稻矮縮病毒對其重要傳播介體黑尾葉蟬的直接和間接影響報道較少。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)相對于不攜帶水稻矮縮病毒的葉蟬，攜帶水稻矮縮病毒的黑尾葉蟬不育率增高，生殖力下降，推斷水稻矮縮病毒對黑尾葉蟬的直接影響是不利的［12-13］。但黑尾葉蟬取食感染水稻矮縮病毒的稻株后，產(chǎn)卵量、壽命、存活率、顯著高于對照［14］，種群增長更快［15］，推斷水稻矮縮病毒對黑尾葉蟬的間接影響是有利的。但不同水稻品種間影響結(jié)果是否一致有待進(jìn)一步驗(yàn)證。【本研究切入點(diǎn)】以秈稻TN1品種為試驗(yàn)材料，通過室內(nèi)觀測黑尾葉蟬取食健康與感病水稻后的生長發(fā)育、種群增長情況，并組建實(shí)驗(yàn)種群生命表，分析比較不同處理對黑尾葉蟬生長發(fā)育、種群增長等方面的影響。【擬解決的關(guān)鍵問題】明確水稻矮縮病毒對黑尾葉蟬生長發(fā)育及繁殖等生物學(xué)特征的影響，為分析病毒與介體昆蟲“雙重”為害提供佐證。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

健康昆蟲種群：無毒黑尾葉蟬第一代于2015年8月采自浙江大學(xué)紫金港校區(qū)西區(qū)試驗(yàn)農(nóng)場（杭州），在室內(nèi)盆栽TN1水稻上飼養(yǎng)3代以上供試驗(yàn)。

帶毒昆蟲種群：取若干無毒低齡黑尾葉蟬若蟲在感病TN1水稻上飼毒2 d后轉(zhuǎn)移至健康TN1水稻上度過約1周的傳毒潛伏期。隨后，將葉蟬單頭分別接到裝有TN1幼苗（10 d）的大試管內(nèi)（長25 cm，直徑3 cm）讓其取食傳毒。2 d后將水稻苗取出并換入新的健康水稻苗，換出的幼苗移栽到人工氣候室內(nèi)培養(yǎng)。約15 d后觀察水稻若有明顯病癥［16］并經(jīng)過RT-PCR檢測確認(rèn)感染水稻矮縮病毒［12］，對應(yīng)的傳毒葉蟬即為帶毒葉蟬，收集并用感病的TN1水稻飼養(yǎng)，建立帶毒種群3代以上供試驗(yàn)。

健康水稻：秈稻TN1，在人工氣候箱內(nèi)浸種培養(yǎng)10 d后移栽到人工氣候室內(nèi)，移栽后30 d的稻苗作為健康處理供試驗(yàn)。

感病水稻：方法與建立帶毒種群相似，從帶毒葉蟬種群中吸取4～5齡若蟲接入裝有TN1幼苗（10 d）的大試管中讓其取食傳毒，2 d后將水稻苗取出移栽到人工氣候室內(nèi)培養(yǎng)，30 d后選取癥狀明顯的感病水稻供試驗(yàn)。

供試水稻均以木村B營養(yǎng)液［17］進(jìn)行培養(yǎng)，控溫控光控濕智能人工氣候室培養(yǎng)條件為：溫度27（±1）℃、光周期（明∶暗）14 h∶10 h、光強(qiáng)度3 500～4 000 Lx、相對濕度75（±5）%。

1.2 黑尾葉蟬生長發(fā)育參數(shù)和生命表的構(gòu)建

將供試水稻移入裝有木村B營養(yǎng)液［17］的自制養(yǎng)蟲裝置內(nèi)（圖1），接入無毒的初孵若蟲，每裝置1頭。試驗(yàn)設(shè)置健康與感病水稻2個處理，每處理60個重復(fù)。逐日記錄若蟲的存活和蛻皮情況，至若蟲羽化為止。待若蟲羽化后稱量成蟲鮮重并記錄。

收集健康與感病水稻上的黑尾葉蟬成蟲，將其按雌雄比1∶1進(jìn)行配對，置于養(yǎng)蟲裝置內(nèi)相應(yīng)處理的稻苗上。逐日更換新鮮稻苗，更換下的水稻苗在解剖鏡下統(tǒng)計卵粒數(shù)，同時記錄葉蟬存活情況，若雄蟲死亡，則補(bǔ)充新的雄蟲，直到雌蟲死亡。

生命表參數(shù)根據(jù)以下公式計算：種群凈增殖率R0=∑lxmx，世代平均歷期T=∑lxmx/R0，內(nèi)稟增長率rm=（lnR0）/T，周限增長率λ=erm，種群加倍時間td=ln2/rm。其中，x為發(fā)育時間，lx為年齡特征存活率，表示任一個體在x期間得以存活的概率；mx為年齡特征繁殖力，表示在x期間平均每頭雌蟲日產(chǎn)卵量。

圖1 黑尾葉蟬的飼養(yǎng)裝置及感病、健康水稻葉片F(xiàn)ig.1 Experimental device for Nephotettix Cincticeps,RDV-infected rice leaf and healthy rice leaf

1.3 黑尾葉蟬種群增長情況

將羽化24 h內(nèi)的健康黑尾葉蟬成蟲經(jīng)饑餓處理6 h后，接入養(yǎng)蟲籠內(nèi)（50 cm×50 cm×50 cm）。每個養(yǎng)蟲籠接入一對雌雄蟲。接蟲后，每月定時調(diào)查成蟲數(shù)量。每周定期往養(yǎng)蟲籠內(nèi)添加新鮮水稻，待衰老水稻自然干枯后取出。試驗(yàn)設(shè)置健康與感病水稻2個處理，每個處理3次有效重復(fù)（雌蟲至少存活20 d的處理作為有效重復(fù)，若雄蟲死亡，則補(bǔ)充新的雄蟲）。

1.4 數(shù)據(jù)分析

黑尾葉蟬在健康與感病2個處理水稻上的若蟲期存活率采用SPSS（version 16.0）中的Kaplan-Meier法進(jìn)行分析［18］，若蟲發(fā)育歷期、壽命、鮮重、產(chǎn)卵量及種群數(shù)量等采用t測驗(yàn)進(jìn)行分析，生命表參數(shù)采用Maia等［19］編寫的SAS程序進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 水稻矮縮病毒對黑尾葉蟬生長繁殖的影響

黑尾葉蟬取食健康水稻時，13～31 d若蟲全部孵化為成蟲，期間若蟲期存活率為70.00%。而黑尾葉蟬取食感病水稻時，若蟲期存活率在28 d全部孵化為成蟲時降到66.67%。兩者進(jìn)行數(shù)據(jù)分析后得出P= 0.843，未達(dá)顯著水平（圖2）。

圖2 水稻矮縮病毒對黑尾葉蟬若蟲期存活率的影響Fig.2 Effect of RDV on nymph survival rate of Nephotettix Cincticeps

黑尾葉蟬取食感病水稻時雄性、雌性若蟲歷期分別為21.29 、22.57 d，與取食健康水稻相比均顯著縮短（雄性P= 0.034；雌性P= 0.001）。取食感病水稻發(fā)育而成的葉蟬雄性、雌性成蟲鮮重均略有增加，但未達(dá)顯著差異水平（雄性P= 0.588；雌性P= 0.907）。取食感病與健康水稻的雄性、雌性葉蟬成蟲壽命則表現(xiàn)出較大差異：健康水稻上雄性葉蟬壽命為28.70 d，感病水稻上的雄性葉蟬壽命顯著縮短為14.42 d（P＜0.001）；健康水稻上雌性葉蟬壽命為24.68 d，感病水稻上的雌性葉蟬壽命略有延長，但未達(dá)顯著差異水平（28.48 d，P= 0.183）；黑尾葉蟬取食感病水稻后產(chǎn)卵量增加為205.62粒，相比健康水稻上略有增加，但未達(dá)顯著差異水平（P=0.251，表1）。

表1 水稻矮縮病毒對黑尾葉蟬生物學(xué)參數(shù)的影響Table 1 Effects of RDV on biological parameters of Nephotettix Cincticeps

2.2 水稻矮縮病毒對黑尾葉蟬實(shí)驗(yàn)種群生命表參數(shù)的間接影響

黑尾葉蟬取食感病水稻時，成蟲的日產(chǎn)卵量很快達(dá)到高峰（35 d時達(dá)14.05粒/雌），以后逐漸下降；而取食健康水稻時，成蟲的日產(chǎn)卵量是逐漸達(dá)到產(chǎn)卵最高峰的，在36 d時達(dá)到最大值11.19粒/雌。黑尾葉蟬取食感病與健康水稻時的年齡特征存活率（lx）具有相似的趨勢（圖3）。

圖3 水稻矮縮病毒對黑尾葉蟬年齡特征存活率（lx）和年齡特征繁殖力（mx）的影響Fig.3 Effects of RDV on age-specific survival rate (lx) and age-specific fecundity (mx) of Nephotettix cincticeps

根據(jù)黑尾葉蟬在健康和感病2個處理水稻上取食時各發(fā)育階段的存活率和成蟲的繁殖力，組建實(shí)驗(yàn)種群生命表，并計算出黑尾葉蟬的生命表參數(shù)（表2）。結(jié)果表明黑尾葉蟬取食感病水稻時凈生殖率為138.29，顯著高于取食健康水稻時的97.21；而2個處理水稻上內(nèi)稟增長率、周限增長率、平均世代歷期、種群加倍時間等4個生命表群參數(shù)間無顯著差異。

表2 水稻矮縮病毒對黑尾葉蟬實(shí)驗(yàn)種群生命表參數(shù)的影響Table 2 Effects of RDV on life table parameters of tested population of Nephotettix Cincticeps

2.3 水稻矮縮病毒對黑尾葉蟬種群增長的影響

試驗(yàn)結(jié)果（表3）表明，隨著調(diào)查時間的延長，2個處理水稻上成蟲數(shù)量逐漸增大，前期增速較快，后增速逐漸放緩。接蟲后3、4、5、6個月感病水稻上總的成蟲數(shù)量分別為213.33、358.67、448.03、525.63頭，健康水稻上相應(yīng)的數(shù)據(jù)為136.33、235.71、292.34、351.67頭，同一調(diào)查時間2個處理之間均達(dá)到顯著差異水平（P= 0.032；P= 0.040；P= 0.032；P= 0.043）。說明黑尾葉蟬取食水稻矮縮病毒侵染的水稻后有利于種群的增長。

表3 水稻矮縮病毒對黑尾葉蟬種群增長情況的影響Table 3 Effects of RDV on population growth of Nephotettix Cincticeps

3 討論

Wang等研究發(fā)現(xiàn)黑尾葉蟬取食感病水稻后其產(chǎn)卵量顯著提高［14］，而本試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)產(chǎn)卵量略有增加，但未達(dá)顯著差異水平。以粳稻品種秀水11為供試水稻，研究發(fā)現(xiàn)葉蟬取食感病水稻時雌若蟲發(fā)育歷期顯著縮短，雄成蟲壽命顯著延長［15］，而本研究中發(fā)現(xiàn)雌雄若蟲發(fā)育歷期和雄性葉蟬壽命均顯著縮短。這些結(jié)果的差異推測是水稻品種不同所致，不同水稻品種對水稻矮縮病毒的抗性差異較大［20］，從而造成葉蟬的取食或營養(yǎng)利用有所不同。本研究發(fā)現(xiàn)黑尾葉蟬取食感病水稻時死亡率較低、產(chǎn)卵量較大，內(nèi)稟增長力、凈增殖率和周限增長率均有所提高，種群加倍時間縮短，且飼喂感病水稻時的葉蟬種群增長更快，種群數(shù)量更大，推斷水稻矮縮病毒對黑尾葉蟬產(chǎn)生有利的間接影響，感病水稻更適合黑尾葉蟬種群的生長發(fā)育及繁殖。

植物病毒病傳播過程涉及到昆蟲、病毒、寄主植物三者的互作。目前有關(guān)植物病毒對媒介昆蟲的影響報道較多，其中一些還對機(jī)理進(jìn)行了探索。如小西葫蘆黃花葉病毒（Zucchini yellow mosaic virus）造成介體棉蚜（Aphis gossypii）的壽命延長，生殖力顯著提高，推斷與感病植株汁液中氨基酸含量提高及糖分含量降低有關(guān)［21］。感染非洲木薯花葉病毒病毒（African cassava mosaec virus）的植株上煙粉虱（Bemisia tabaci）種群增長更快，推斷與感病植株中氨基酸含量增高有關(guān)［22］。Figbig 等發(fā)現(xiàn)麥長管蚜（Sitobion avenae）在感染大麥黃矮病毒（Barley yellow dwarf virus）的大麥上內(nèi)稟增長率rm顯著降低，測定發(fā)現(xiàn)感病植株汁液氨基酸的含量明顯降低，且對蚜蟲蜜露的分析結(jié)果表明，蚜蟲在感病植株上取食時對氨基酸的利用率較低，吸收的氨基酸含量相對較少［23］。另外，也有研究表明昆蟲在感病寄主植物上適合度的提高與植物防御途徑的改變有關(guān)，雙生病毒能抑制寄主植物茉莉酸途徑的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，從而調(diào)控萜烯類化合物，吸引煙粉虱（Bemisia tabaci）的取食，促進(jìn)雙生病毒與煙粉虱建立互惠關(guān)系［24-25］。植物病毒能抑制植物茉莉酸抗蟲信號途徑，可以大大提高介體昆蟲的適應(yīng)度，形成了病-蟲的互惠共生關(guān)系［26］。黑尾葉蟬是刺吸式口器昆蟲，依賴通過口針吸食寄主植物汁液存活，而水稻感染水稻矮縮病毒后導(dǎo)致汁液成分的改變可能對葉蟬的取食或營養(yǎng)利用造成影響，且病毒的入侵也有可能導(dǎo)致植物防御途徑的變化，從而導(dǎo)致其在感病水稻上的壽命、存活等生物學(xué)特性的變化。但水稻感染水稻矮縮病毒后導(dǎo)致汁液成分如何改變，植物防御途徑如何相關(guān)，這些改變又如何影響黑尾葉蟬生物學(xué)特性的變化有待進(jìn)一步研究闡明。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，水稻矮縮病毒（Rice dwarf virus）會促進(jìn)黑尾葉蟬若蟲的生長發(fā)育、加快種群增長速度，表明感病水稻更適合黑尾葉蟬種群的生長發(fā)育及繁殖。綜上所述，我們認(rèn)為水稻矮縮病毒對黑尾葉蟬會產(chǎn)生有利的間接影響。這種有利的間接影響可能是由于水稻感染水稻矮縮病毒后導(dǎo)致汁液成分的改變，或植物防御途徑的變化等，繼而對葉蟬的取食或營養(yǎng)利用造成改變的結(jié)果。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上，進(jìn)一步加強(qiáng)抗性品種的選育、加強(qiáng)蟲情病情的監(jiān)測對于水稻普通矮縮病的防治至關(guān)重要。