林志雄，魚(yú)海瓊，王 瑩，佟鐵鑄，溫肖會(huì)，張 利，翟建新

（1.廣州海關(guān)檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心/廣東省動(dòng)植物與食品進(jìn)出口技術(shù)措施研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510623；2.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物衛(wèi)生研究所，廣東 廣州 510640；3.深圳澳東檢驗(yàn)檢測(cè)科技有限公司，廣東 深圳 518000）

【研究意義】馬鼻肺炎是描述馬屬動(dòng)物呼吸道病、流產(chǎn)、新生駒肺炎或腦脊髓炎等幾種疾病的總稱，在全世界分布廣泛。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）將其列為法定報(bào)告動(dòng)物疫?。?］，我國(guó)農(nóng)業(yè)部也將馬鼻肺炎列為二類動(dòng)物傳染病，國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫局與其他國(guó)家簽訂的檢疫條款也將其列為出入境馬屬動(dòng)物檢驗(yàn)檢疫的疫病之一［2］。馬皰疹病毒1型（Equine herpesvirus，EHV1）和馬皰疹病毒4型（Equine herpesvirus，EHV4）是引起馬鼻肺炎的主要病原。EHV1是馬呼吸道疾病、病毒性流產(chǎn)的主要病因［3］，EHV4主要引起急性呼吸道感染［4］，從致病性來(lái)看，區(qū)分EHV1與EHV4意義重大?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】馬鼻肺炎的診斷一般采用病毒分離培養(yǎng)、血清學(xué)檢測(cè)、核酸檢測(cè)［5］。由于EHV1與EHV4之間存在嚴(yán)重的血清交叉反應(yīng)，目前我國(guó)還沒(méi)有從血清學(xué)角度區(qū)分EHV1與EHV4的標(biāo)準(zhǔn)方法［6］，以PCR與熒光定量PCR為代表的核酸檢測(cè)，對(duì)樣品有較好的生物安全性，適合于早期檢測(cè)［7］。ELISA檢測(cè)方法靈敏度高，但操作復(fù)雜，不適合快速篩查。【本研究切入點(diǎn)】相對(duì)于上述幾種檢測(cè)方法，實(shí)時(shí)熒光PCR（real-time PCR）檢測(cè)速度快、靈敏度高、特異性強(qiáng)［8］，與傳統(tǒng)PCR相比具有省時(shí)、高效、成本低等優(yōu)勢(shì)，且結(jié)果易于觀察?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】通過(guò)設(shè)計(jì)特異性引物和探針、優(yōu)化反應(yīng)條件等手段，建立一種靈敏、特異、快速的雙重real-time PCR檢測(cè)方法，對(duì)EHV1與EHV4進(jìn)行快速檢測(cè)和分型確認(rèn)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 毒株和標(biāo)本 選擇EHV1和EHV4陽(yáng)性標(biāo)本各5份，馬流感病毒（EIV）、馬動(dòng)脈炎病毒（EAV）、馬日本腦炎病毒（EVJ）和馬傳染性貧血病毒（EIAV）陽(yáng)性標(biāo)本各5份，臨床采集馬鼻咽喉拭子共64份。由于試驗(yàn)所用的病毒株涉及保存條件要求和樣本信息保密性，故病毒株測(cè)試實(shí)驗(yàn)和臨床樣本測(cè)試實(shí)驗(yàn)主要在廣東省動(dòng)植物與食品進(jìn)出口技術(shù)措施研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成。

1.1.2 主要試劑及儀器 病毒核酸提取試劑購(gòu)自凱杰生物工程（深圳）有限公司（QIAGEN），熒光PCR試劑購(gòu)自美國(guó)VitaNavi Technology 公司，pMD-18-T載體購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司，探針引物由寶生物工程（大連）有限公司合成，7500型熒光定量PCR儀購(gòu)自美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)（ABI）公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)和篩選 分別下載GenBank報(bào)道的不同國(guó)家和地區(qū)的EHV1和EHV4基因序列，進(jìn)行核苷酸序列同源性比對(duì)，根據(jù)比對(duì)結(jié)果將比較保守的糖蛋白B區(qū)（gB）基因作為擴(kuò)增序列，根據(jù)熒光定量PCR引物和探針設(shè)計(jì)原則，使用primer5.0軟件分別對(duì)EHV1和EHV4設(shè)計(jì)多套引物和探針，并對(duì)設(shè)計(jì)出的引物進(jìn)行序列比對(duì)分析和特殊結(jié)構(gòu)分析，再根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果對(duì)幾套引物探針和擴(kuò)增程序進(jìn)行篩選，最終選擇1套最佳引物探針，并確定引物探針間的最佳比例。引物探針序列信息見(jiàn)表1。

1.2.2 陽(yáng)性質(zhì)粒制備 通過(guò)比對(duì)EHV1和EHV4參考毒株，擴(kuò)增含有g(shù)B序列的基因片段，PCR產(chǎn)物回收后與 Peasy-T3載體連接構(gòu)建成重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞，通過(guò)氨芐藍(lán)白斑篩選轉(zhuǎn)化成功的菌株［9］，測(cè)序鑒定目的片段，提取質(zhì)粒制備陽(yáng)性對(duì)照。

1.2.3 病毒核酸提取 EHV1和EHV4 DNA提取選擇QIAGEN公司的DNA提取試劑盒，EIV、EAV、EVJ和EIAV RNA提取選擇QIAGEN公司的RNA提取試劑盒，病毒核酸提取按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。對(duì)EIV、EAV、EVJ和EIAV標(biāo)準(zhǔn)毒株的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，所有核酸-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 real-time PCR反應(yīng)體系的建立和優(yōu)化 根據(jù)Vitanavi Technology公司PCR試劑盒設(shè)定real-time PCR的基本反應(yīng)體系25 μL。設(shè)定基本反應(yīng)條件為：50 ℃ 15 min；95℃ 15 min，95 ℃ 10 s，55 ℃ 40 s，45個(gè)循環(huán)；40 ℃ 20 s；退火時(shí)采集熒光信號(hào)。摸索各組分對(duì)EHV1和EHV4標(biāo)準(zhǔn)毒株擴(kuò)增的影響，設(shè)置了Mg2+濃度（2、3、4、5、6mmol/L）、dNTP濃度（0.2、0.3、0.4、0.5 mmol/L）、引物和探針的比例（1∶1、1.5∶1、2∶1）和退火溫度（52、55、60 ℃），分別以EHV1和EHV4標(biāo)準(zhǔn)毒株的混合核酸為模板，根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果選擇最佳反應(yīng)體系和擴(kuò)增條件。

1.2.5 敏感性試驗(yàn) 分別對(duì)EHV1和EHV4陽(yáng)性對(duì)照進(jìn)行10倍稀釋，共稀釋10個(gè)梯度，每個(gè)梯度5次重復(fù)，進(jìn)行real-time PCR檢測(cè)，確定EHV1和EHV4檢測(cè)濃度的最低限以及分析方法的靈敏性。

1.2.6 特異性試驗(yàn) 用建立的real-time PCR方法分別對(duì)5份EHV1、5份EHV4標(biāo)準(zhǔn)毒株和逆轉(zhuǎn)錄后的EIV、EAV、EVJ和EIAV標(biāo)準(zhǔn)毒株（各5份）的cDNA進(jìn)行檢測(cè)，驗(yàn)證該方法的特異性。

1.2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 分別以1.47×105copies/μL的EHV1和EHV4陽(yáng)性對(duì)照為模板，3次重復(fù)，記錄Ct值，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)差（S）和變異系數(shù)（CV），驗(yàn)證該方法的穩(wěn)定性。將上述3管樣本保存于-20℃保存4 d和7 d后重復(fù)檢測(cè)，記錄Ct值，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)差（S）和變異系數(shù)（CV）以驗(yàn)證該陽(yáng)性對(duì)照的穩(wěn)定性和重復(fù)性。

1.2.8 臨床樣本檢測(cè) 對(duì)已有的64份臨床樣本分別用本研究建立的EHV1/EHV4 real-time PCR、常規(guī)PCR和病毒分離方法同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)，比較3種方法結(jié)果的符合率。

2 結(jié)果與分析

2.1 gB基因擴(kuò)增及標(biāo)準(zhǔn)品制備

應(yīng)用設(shè)計(jì)的EHV引物進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增，結(jié)果（圖1）顯示，從EHV中擴(kuò)增到850 bp的gB基因特異性片段。產(chǎn)物回收后構(gòu)建成重組質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化至DH5a感受態(tài)細(xì)胞，細(xì)菌培養(yǎng)后提取重組質(zhì)粒進(jìn)行核苷酸序列測(cè)定，測(cè)序結(jié)果與原始序列片段的同源性為99.8%，表明構(gòu)建重組質(zhì)粒成功。抽提質(zhì)粒DNA，經(jīng)超微核酸蛋白濃度儀測(cè)定，OD260/OD280=1.92，質(zhì)粒濃度為 1.373 μg/μL，根據(jù)公式換算的拷貝數(shù)為1.47×109copies/μL。

圖 1 gB基因擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 Amplification result of gB gene

2.2 Real-time PCR方法的建立

2.2.1 Real-time PCR反應(yīng)體系的建立和優(yōu)化 通過(guò)對(duì)Mg2+濃度、dNTP濃度、引物和探針的比例進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明，Mg2+濃度為4 mmol/L，dNTP濃度為0.4 mmol/L，引物探針比例為2∶1，退火溫度為55℃時(shí)，擴(kuò)增效果最佳，重復(fù)性好。最佳體系擴(kuò)增效果見(jiàn)圖2。

圖2 EHV1、EHV4實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)結(jié)果Fig.2 Results of duplex real-time PCR of EHV1 and EHV4

2.2.2 敏感性試驗(yàn) 對(duì)陽(yáng)性對(duì)照進(jìn)行10個(gè)濃度梯度稀釋，圖3所示藍(lán)色為EHV1擴(kuò)增曲線，紅色為EHV4擴(kuò)增曲線，均出現(xiàn)7個(gè)稀釋梯度擴(kuò)增曲線；質(zhì)?？截悢?shù)為1.47×102copies/μL時(shí)，均能檢測(cè)到特異性擴(kuò)增；當(dāng)質(zhì)?？截悢?shù)為1.47×101copies/μL時(shí)，則不能檢測(cè)到特異性擴(kuò)增，陰性對(duì)照也不能檢測(cè)到擴(kuò)增曲線。因此樣本的最小檢測(cè)濃度為1.47×102copies/μL。擴(kuò)增線性方程為：Ct=20.907-3.214 LogC，擴(kuò)增效率E為104.687%，相關(guān)系數(shù)r2=1，證實(shí)擴(kuò)增指標(biāo)正常。

圖3 EHV1、EHV4 雙重實(shí)時(shí)熒光 PCR敏感性檢測(cè)結(jié)果Fig.3 Sensitivity detection of EHV1 and EHV 4 by using duplex real-time PCR

2.2.3 特異性實(shí)驗(yàn) 采用本研究建立的EHV1、EHV4 real-time PCR方法分別對(duì)EHV1、EHV4、EIV、EAV、EVJ和EIAV各5份標(biāo)準(zhǔn)毒株進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果（圖4）只有EHV1、EHV4出現(xiàn)特異性擴(kuò)增，其他病毒未出現(xiàn)擴(kuò)增。

圖4 EHV1、EHV4 雙重實(shí)時(shí)熒光PCR特異性檢測(cè)結(jié)果Fig.4 Specific detection of EHV1 and EHV 4 by using duplex real-time PCR

2.2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)中，相同濃度樣本，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表2，EHV1批內(nèi)變異系數(shù)為1.68%，EHV4批內(nèi)變異數(shù)為2.04%。批間重復(fù)性試驗(yàn)中，相同模板不同檢測(cè)時(shí)間結(jié)果見(jiàn)表3，EHV1批間變異系數(shù)為2.10%，EHV4批間變異數(shù)為2.08%。批間和批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)中Ct值變異系數(shù)均小于3%，表明該方法重復(fù)性良好，能夠滿足實(shí)際檢測(cè)的要求。

表2 批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Result of Intra-assay repetitive experiment

表3 批間重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Result of Inter-assay repetitive experiment

2.2.5 臨床樣本檢測(cè) 本研究建立的real-time PCR方法以Ct值＜35并且擴(kuò)增曲線呈“S”型為陽(yáng)性判定標(biāo)準(zhǔn)。若Ct值＜35且擴(kuò)增曲線良好可直接判定為陽(yáng)性；Ct值在35～38之間需重復(fù)試驗(yàn)，2次試驗(yàn)均能得到良好“S”型擴(kuò)增曲線方可判定為陽(yáng)性；Ct值＞38判定為陰性。對(duì)臨床樣本進(jìn)行常規(guī)PCR、real-time PCR和病毒分離，結(jié)果顯示，64份臨床樣本中，常規(guī)PCR檢出率為9.38%（6/64）、real-time PCR檢出率為14.06%（9/64）、病毒分離陽(yáng)性率為14.06%（9/64）。證實(shí)realtime PCR比常規(guī)PCR檢測(cè)靈敏度更高。

3 討論

EHV1和EHV4引起的馬鼻肺炎可導(dǎo)致妊娠馬流產(chǎn)、胎兒死亡等傳染性疾病，是影響我國(guó)養(yǎng)馬業(yè)健康發(fā)展的巨大威脅，建立快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)方法對(duì) EHV1、EHV4 的鑒別診斷和流行病學(xué)調(diào)查具有重要意義［10］。SYBR Green染料的熒光定量 PCR 方法是目前采用的快速檢測(cè)方法之一，鑒于SYBR Green 熒光染料的特異性欠佳，該方法對(duì)引物的設(shè)計(jì)要求很高：引物設(shè)計(jì)中不可出現(xiàn)反向重復(fù)序列和發(fā)夾結(jié)構(gòu)，引物避免形成二聚體，更不能與模板發(fā)生錯(cuò)配擴(kuò)增等［11］。特異性篩選實(shí)驗(yàn)既要保證引物的特異性，又要保證引物的各項(xiàng)參數(shù)符合熒光定量PCR 反應(yīng)的要求［12］。因此，設(shè)計(jì)常規(guī)引物，建立成熟的SYBR Green 染料的熒光定量 PCR 方法有一定的挑戰(zhàn)性。

為避免因常規(guī)引物特異性差造成檢測(cè)結(jié)果假陽(yáng)性等不利因素［13］，本研究設(shè)計(jì)了具有強(qiáng)特異性的引物和探針，并建立了檢測(cè)EHV1、EHV4的雙重?zé)晒舛?PCR 方法。該方法可在1 h內(nèi)分別檢測(cè)EHV1與EHV4，從而達(dá)到在同一反應(yīng)體系內(nèi)對(duì)EHV進(jìn)行分型的要求。在設(shè)計(jì)引物過(guò)程中，我們選取gB基因中GC含量較高的區(qū)域，提高引物Tm值，從而有效防止引物二聚體的產(chǎn)生，并高概率地減少了非特異性擴(kuò)增。

4 結(jié)論

本研究建立的雙重?zé)晒舛縋CR的檢測(cè)方法對(duì)EHV1與EHV4有特異性檢出，且與其他幾種馬屬動(dòng)物易感病毒 （EIV、EAV、EIAV及EVJ）無(wú)交叉反應(yīng)。該方法最低檢出限為1.47×102copies/μL，可用于檢測(cè)目的基因拷貝數(shù)較低的樣品，實(shí)際應(yīng)用前景廣闊。