孫勛勛，楊宏宇，周軼楠，劉吉平

（華南農業(yè)大學動物科學學院，廣東 廣州 510642）

【研究意義】雙生病毒科（Geminiviridae）擁有400多種植物病毒，主要分布在熱帶和亞熱帶地區(qū)，能夠侵染木瓜、棉花、豆類和蔬菜等經濟作物，導致巨大的經濟損失。Geminiviridae病毒為單鏈DNA病毒，有單組份和雙組份兩種，主要有菜豆金色花葉病毒屬（Begomovirus）、玉米線條病毒屬（Mastrevirus）、甜菜曲頂病毒屬（Becurtovirus）、曲頂病毒屬（Curtovirus）、番茄偽曲頂病毒屬（Topocuvirus）、蕪菁曲頂病毒屬（Turncurtovirus）、畫眉草線條病毒屬（Eragrovirus）、冠狀病毒屬（Capulavirus）和葡萄藤紅斑病毒屬（Grablovirus）等9個屬，主要通過煙粉虱、葉蟬、樹虱和蚜蟲等昆蟲傳播［1］。桑花葉型萎縮病相關病毒（Mulberry Mosaic Dwarf associated Virus，MMDaV）和橘褪綠矮縮相關病毒（Citrus Chlorotic Dwarf associated Virus，CCDaV）是兩種木本雙生病毒，具有獨特的基因組結構，但因未明確其媒介昆蟲和病毒粒子形態(tài)，所以將它們歸為未定屬［2］。桑花葉型萎縮病相關病毒（MMDaV）是在皺縮和花葉狀的桑葉中發(fā)現，并未確定該病毒與?；ㄈ~型萎縮病具有相關性［3］。桑花葉型萎縮病主要導致桑樹植株矮化，葉片皺縮畸形并存在褪綠斑等癥狀，在我國各蠶區(qū)普遍發(fā)生且危害嚴重［4］。但是由于柯赫氏法則驗證困難，至今還未能確定MMDaV與?；ㄈ~型萎縮病之間的關系?！厩叭搜芯窟M展】對于雙生病毒CCDaV，已有實時熒光定量PCR［5］和環(huán)介導等溫核酸擴增技術（LAMP）［6］兩種檢測方法檢測CCDaV，可對CCDaV進行快速定量和可視化的檢測。而針對MMDaV，雖然已建立了PCR［7］以及核酸斑點雜交（nucleic acid spot hybridization，NASH）檢測技術［8］檢測MMDaV，但這些方法無法對MMDaV進行快速定量檢測?！颈狙芯壳腥朦c】與PCR 相比，實時熒光定量PCR具有特異性強、靈敏度高、可定量和快速等特點，在植物病害檢測上具有廣泛的應用［9］。本研究以MMDaV保守的外殼蛋白基因序列為引物設計靶點，構建有效的MMDaV實時熒光定量PCR檢測方法，并以廣東、廣西、海南、重慶、陜西和江西采集的桑病葉樣品為檢測對象，驗證MMDaV實時熒光定量PCR檢測方法的有效性?！緮M解決的關鍵問題】快速定量的檢測桑樹中的MMDaV，能進一步用于桑樹、MMDaV和昆蟲三者間互作關系的研究。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

帶有皺縮和花葉狀的桑病葉材料（圖1）采集于廣東、廣西、海南、重慶、陜西和江西等地，樣品信息見表1。桑葉污葉病病原真菌桑球針殼（Phyllactinia moricola）和桑葉常見真菌疣孢青霉（Penicillium verruculosum），桑椹菌核病病原真菌肉阜狀杯盤菌（Ciboria carunculoides），桑樹青枯病病原細菌茄科勞爾式菌（Ralstonia solanacearum），桑樹青枯病病原細菌假單胞菌（Pseudomonadaceaespp.）和陰溝腸桿菌（Enterobacter cloacaesp.），家蠶微粒子病病原家蠶微孢子（Nosema bombycis）和家蠶白僵病病原真菌白僵菌（Beauveriabassiana）保存于華南農業(yè)大學亞太地區(qū)蠶桑培訓中心微生物實驗室。

圖1 ?；ㄈ~型萎縮病癥狀Fig.1 Symptom of mulberry mosaic dwarf disease

1.2 CTAB法抽提植物基因組DNA

在CTAB法提取植物DNA［10］的基礎上，為提高DNA的純度，在加入600 mL異丙醇后，將全部液體吸入核酸純化吸附柱套件中，12 000 r/min離心30 s過濾，棄濾液；加入70%乙醇500 μL洗滌，12 000 r/min離心30 s，棄濾液，洗滌2次，最后空離1次；將吸附柱放置于新的1.5 mL EP管中，加50 μL ddH2O，12 000 r/min離心30 s獲得桑葉總DNA。

1.3 引物的設計與合成

NCBI上獲得桑花葉型萎縮病相關病毒的全基因組序列（KP303687.1）為靶序列，篩選擴增外殼蛋白基因序列引物MCP581F/MCP1464R，并以保守外殼蛋白基因為靶序列，設計特異實時熒光定量PCR檢測引物MCP981F/MCP1148R。MMDaV外殼蛋白基因的PCR檢測引物MCP746F/MCP1148R［7］用于對照，以上引物序列信息見表2。

表1 各地桑病葉樣品信息Table 1 Information of diseased mulberry leaf sample

表2 引物信息Table 2 Primer information

1.4 構建陽性質粒

以皺縮和花葉狀的桑病葉總DNA為模板，使用引物MCP581F/MCP1464R擴增包含病毒外殼蛋白基因序列。反應體系（20 μL）：北京擎科生物科技有限公司金牌PCR Mix（TSE101） 10 μL，ddH2O 7 μL，桑病葉總DNA模板2 μL，上下游引物各0.5 μL，PCR條件為98 ℃預變性30 s，98 ℃變性 8 s，58 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 20 s，35個循環(huán)，最后72℃延伸10 min。擴增目的條帶使用TaKaRa膠回收試劑盒（MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit）純化，純化的片段使用北京全式金生物有限公司克隆試劑盒pEASYBlunt Cloning Kit（CB101）構建陽性質粒，使用生工SanPrep柱式質粒DNA小量抽提試劑盒（B518191-0050）提取質粒，質粒濃度使用分光光度計檢測。將質粒濃度計算成拷貝數計數，計數公式：拷貝數=（6.02×1023×質粒質量）/（堿基數×660）。本實驗以1.93×109copies/μL為初始濃度進行10倍梯度稀釋。

1.5 實時熒光定量PCR引物檢測

PCR特異性檢測以皺縮和花葉狀的桑病葉、桑球針殼（P.moricola）、肉阜狀杯盤菌（C.carunculoides）、白僵菌（B.bassiana）、疣孢青霉（P.verruculosum）、茄科勞爾式菌（R.solanacearum）、假單胞菌（P.spp.）、陰溝腸桿菌（E.cloacaesp.）、家蠶微孢子（N.bombycis）和健康桑葉總DNA為模板對引物的特異性進行驗證。PCR靈敏度檢測將質粒濃度從1.93×106copies/μL到1.93×101copies/μL以10倍稀釋作為模板進行檢測。檢測引物反應體系（20 μL）：2×TaqMaster Mix（Microanalysis Inc）10 μL，ddH2O 7 μL，DNA 模板 2 μL，上下游引物各0.5 μL，PCR條件：95 ℃預變性5 min，95 ℃變性 30 s，60 ℃退火 30 s，72 ℃延伸10 s，35個循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。擴增的片段經1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

實時熒光定量PCR特異性檢測的DNA模板參照PCR檢測模板，其靈敏度檢測將陽性質粒從1.93×105copies/μL 到 1.93×101copies/μL 濃 度以10倍梯度稀釋制成標準參照液，每個濃度重復檢測3次。反應體系（20 μL），SYBR Green Realtime PCR Master Mix（QPK-201，東 洋 紡 生物有限公司）10 μL，ddH2O 7 μL，DNA模板2 μL，上下游引物各0.5 μL，實時熒光定量PCR條件：95℃預變性5 min，95℃變性10 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸10 s，35個循環(huán)。儀器為MYGOmini熒光定量PCR儀（3OY-XT4-7NN，IT-IS Life Science Ltd）。

2 結果與分析

2.1 構建MMDaV陽性質粒

擴增獲得包含MMDaV外殼蛋白基因的序列，成功構建MMDaV外殼蛋白基因克隆質粒MCP14-pEASY-Blunt，質粒中包含外殼蛋白基因長度為884bp，NCBI上blast僅對比到桑花葉型萎縮病相關病毒（KR131749.1），最大相似率為97.96%。

2.2 檢測引物PCR的特異性及靈敏性檢測

檢測引物MCP981F/MCP1148R的PCR特異性及靈敏度（圖2）。特異性檢測結果除了花葉皺縮狀的桑病葉總DNA及陽性質粒存在大小為168 bp左右的目的條帶，其他參照樣品和陰性對照均無目的條帶，說明該引物的PCR特異性良好。靈敏度檢測結果質粒濃度從1.93×106copies/μL到1.93×103copies/μL存在明顯條帶，其余泳道無條帶，說明該引物的PCR最低檢測限為1.93×103copies/μL。

圖2 引物特異性及靈敏性PCR檢測Fig.2 PCR detection for specificity and sensitivity of primers

2.3 實時熒光定量PCR標準曲線

成功構建陽性質粒標準曲線，從熒光曲線（圖3）可以看出，不同濃度之間存在明顯的梯度，且重復性良好。以質粒濃度為橫坐標，3次Cq平均值為縱坐標制作標準曲線（圖4），結果濃度與Cq值之間線性關系良好，標準曲線為y= -3.3739x+ 33.083，其 中R2= 0.9992，斜 率為 -3.3739，擴增效率（E=10^（-1/標準曲線斜率）-1）為97.88%。以Cq值≤30的作為檢測敏感區(qū)間，檢測的最低有效質粒濃度為8 copies/μL。

2.4 實時熒光定量PCR特異性檢測

對該引物的實時熒光定量PCR檢測的特異性進行驗證，結果（圖5）除了對陽性質粒和花葉皺縮狀的桑病葉檢測出現曲線，其他樣品均未出現曲線，說明該引物在實時熒光定量PCR檢測上的特異性良好。

2.5 實時熒光定量PCR檢測各地樣品

使用構建的實時熒光定量PCR檢測方法對采集于廣東、廣西、海南、重慶、陜西和江西等6個省區(qū)花葉皺縮狀的桑病葉樣品進行檢測。對比引物MCP746F/MCP1148R的PCR檢測與實時熒光定量PCR檢測，結果（圖6）PCR對各地桑病葉樣品檢測均有條帶，條帶強弱不一，實時熒光定量PCR對各地桑病葉樣品檢測 均有相應的曲線（圖7），檢測的Cq值在9.69～26.17之間。并且實時熒光定量PCR與普通PCR電泳條帶強弱程度存在對應的Cq值，普通PCR條帶亮度強的，其實時熒光定量PCR檢測的Cq值越小，反之越大。說明實時熒光定量PCR對各地桑病葉樣品均具檢測結果，且檢測結果穩(wěn)定可靠且可量化。

圖3 不同濃度質粒的實時熒光定量PCRFig.3 The real-time fluorescence quantitative PCR for plasmids with different concentrations

圖4 標準曲線Fig.4 Standard curve

圖5 引物實時熒光定量PCR特異性驗證Fig.5 Real-time fluorescence quantitative PCR for primer-specific detection

圖6 各地樣品PCR檢測電泳結果Fig.6 PCR detection results of samples from different provinces

3 討論

圖7 各地樣品的實時熒光定量PCR檢測Fig.7 Real-time fluorescence quantitative PCR detection of samples from different provinces

實時熒光定量PCR比普通PCR和LAMP檢測技術的靈敏度高［11］，該技術可生產成診斷試劑盒［12］。在植物病毒檢測上，實時熒光定量PCR被廣泛應用于我國產量最高的蘋果、梨、柑橘、葡萄和香蕉等5種果樹中病毒的檢測，其中病毒外殼蛋白基因為最常用的檢測靶標［13］。本研究采用應用最廣的非特性性染料SYBR Green I構建MMDaV的實時熒光定量PCR，以MMDaV外殼蛋白基因序列為靶序列。在驗證植物病毒檢測引物的特異性時，大多數研究者使用以相同植物上的不同病毒作為參照［12-13］。目前已報道過多種桑樹病毒，但都未能明確與桑樹之間的關系，也不能穩(wěn)定的檢出，因此無法獲得其他桑樹病毒作為參照。因為桑樹主要用來養(yǎng)蠶、采桑葉和采桑椹，所以本實驗以桑葉、桑椹和家蠶常見病原微生物作為對照檢測特異性也具有一定的實踐意義。

可重復性方面，建立的標準曲線擴增效率為97.88%，在90%～105%之間且接近1，說明重復性好。標準曲線R2=0.9992，接近1，說明該檢測方法可靠性高。實時熒光定量PCR可用于檢測不同時期帶病植株和昆蟲體內的病毒量［14-15］，本研究建立的MMDaV實時熒光定量PCR能夠定量的檢測MMDaV，該檢測方法最低有效質粒檢測濃度為8 copie/μL，與凌薇等［14］構建的櫻桃葉斑駁病毒實時熒光定量PCR檢測方法有效質粒檢測濃度為23 copies/μL均具有較高靈敏度，并且其靈敏度是MMDaV常規(guī)PCR的24倍［7］。

雖然?；ㄈ~型萎縮病在全國各大蠶區(qū)均有發(fā)生，但至今僅在江蘇鎮(zhèn)江［8］和陜西安康學院［16］兩地有MMDaV的報道，此次在廣東、廣西、海南、陜西、重慶和江西等地皺縮和花葉的桑病葉中均檢測到MMDaV，MMDaV的檢出地點增加。

4 結論

本研究建立的MMDaV實時熒光定量PCR檢測方法具有特異性強、靈敏度高、可重復性和可定量等特點，可應用于廣東、廣西、海南、陜西、重慶和江西等多個地方桑病葉MMDaV的定量檢測。