蔣曉梅，劉翀

（麗水市中心醫(yī)院 藥學部，浙江 麗水 323000）

非酒精性脂肪性肝?。╪onalcoholic fatty liver disease，NAFLD）是與胰島素抵抗和遺傳易感性密切相關的獲得性代謝應激性肝損傷[1-2]。隨著肥胖及其相關代謝綜合征全球化的流行趨勢，NAFLD在我國的發(fā)病率日益升高，據不完全統計，脂肪肝發(fā)病率在2型糖尿病患者中約占50%，且多以NAFLD為主[3]。利拉魯肽是一種人胰高血糖素樣肽-1（human glucagons-like peptide-1，GLP-1）類似物，具有降低血糖、血脂，改善胰島素抵抗等作用，在臨床上被廣泛應用于治療2型糖尿病[4]。研究發(fā)現，利拉魯肽可降低NAFLD大鼠的總膽固醇（total cholesterol，TC）和甘油三酯（trilaurin，TG）水平，發(fā)揮對肝臟的保護作用[5]。巨噬細胞廣泛參與人體的各項免疫活動[6-7]，巨噬細胞被極化后會釋放炎癥趨化因子和細胞因子，發(fā)揮抗感染和修復組織的功能[8]，最近的研究表明，M2型巨噬細胞在治療2型糖尿病中起到了非常重要的作用[9]。然而目前未見研究報道利拉魯肽能否通過影響M2巨噬細胞極化發(fā)揮治療2型糖尿病NAFLD的作用。故本研究通過構建NAFLD小鼠模型，探討利拉魯肽對改善2型糖尿病伴隨的NAFLD的潛在作用機制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物及試劑：SPF級健康6～8周齡雄性C57BL/6J小鼠購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司，動物許可證號：SCXK（滬）2017-0005；利拉魯肽購自丹麥諾和諾德公司；高糖高脂飼料（10%豬油、10%蔗糖、2%膽固醇、10%蛋黃粉、68%基礎飼料）購自南京協同生物有限公司；鏈脲佐菌素（streptozocin，STZ）購自美國Sigma公司；丙氨酸轉氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、谷草轉氨酶（aspartate aminotransferase，AST）、TG檢測試劑盒購自南京建成生物科技有限公司；IL-4和IL-10 ELISA試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.1.2 實驗儀器：MK-500C電子天平購自日本YMC公司；Beckman Coulter流式細胞儀購自美國Beckman公司；7070型全自動生化分析儀購自日本Hitachi公司；TS-100光學顯微鏡購自日本奧林巴斯公司。

1.2 方法

1.2.1 NAFLD模型制備：將小鼠適應性喂養(yǎng)1周后，隨機分為2組，分別為正常組（n=15），高糖高脂飼料組（n=40）。正常組普通飼料喂養(yǎng)；高糖高脂飼料組高糖高脂飼料喂養(yǎng)4周，尾靜脈注射0.1 mol/L的無菌枸櫞酸（35 mg/kg），腹腔注射STZ溶液200 mg/kg，72 h后測定血糖，初測血糖≥16.5 mmol/L，穩(wěn)定5 d后，進行復測，以16.7 mmol/L≤血糖≤25.0 mmol/L為2型糖尿病NAFLD造模成功。

1.2.2 分組及給藥：從造模成功的小鼠中隨機選取30只，分為模型組和利拉魯肽組，每組15只。利拉魯肽組皮下注射利拉魯肽（100 μg/kg），每日1次，正常組和模型組注射相同體積的0.9%氯化鈉溶液，連續(xù)給藥4周，隔天測量體質量和肝臟質量（打開腹腔充分暴露肝臟，取新鮮肝臟，迅速稱濕重），計算肝臟指數=肝臟重量/體質量×100%。

1.2.3 肝組織HE染色：將肝組織置于4%中性甲醛固定，進行石蠟包埋，常規(guī)4 μm切片，將切片烘干后用二甲苯脫蠟，乙醇脫水，HE染色，乙醇脫水，透明，最后用中性樹膠封片，在光學顯微鏡下觀察肝組織病變情況。

1.2.4 肝組織油紅O染色：將肝組織置于蔗糖中冰凍切片，將切片烘干后用二甲苯脫蠟，用乙醇梯度水化，將切片放入油紅O染色液中，最后用甘油明膠進行封片，在光學顯微鏡下觀察肝組織病變情況。

1.2.5 血清指標檢測：對小鼠進行心臟取血，3 000 r/min，離心15 min，分離血清，用全自動生化分析儀檢測ALT、AST和TG含量。

1.2.6 流式細胞術檢測：頸椎脫臼處死小鼠后，在無菌條件下向腹部注入含雙抗（100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素）的DMEM培養(yǎng)基，抽取腹腔液約4 mL；常溫1 000 r/min離心8 min，棄去上清液，用含10% FBS和含雙抗的DMEM培養(yǎng)液調整細胞濃度，接種于12孔培養(yǎng)板，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)3 h。棄上清液，將細胞置于含10% FBS和含雙抗的DMEM培養(yǎng)液中24 h后，收集上清液及細胞，將細胞用PBS洗后將濃度調至5×105個/管，加1 μL FITC-抗小鼠CD206抗體常溫下避光孵育30 min，PBS重懸，用流式細胞儀檢測，分析M2型巨噬細胞的比例。

1.2.7 ELISA法檢測：取肝組織剪碎，冰浴下研磨制備組織勻漿，離心后吸取上清液，根據ELISA試劑盒的說明書檢測IL-4和IL-10的含量。

1.2.8 RT-PCR檢測：從冷凍的肝臟標本中分離提取總RNA，反轉錄合成cDNA。IL-4、IL-10、CD206、CD301、MGL-1、MGL-2和Arg-1等采用RT-PCR實驗測定。以β-actin為內參，采用2-ΔΔCt法對定量結果進行分析，獲得上述基因mRNA的相對表達量，引物序列如表1所示。

1.3 統計學處理方法 所有數據采用SPSS19.0統計軟件進行分析。正態(tài)分布計量資料以表示，2組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

表1 RT-PCR引物序列表

2 結果

2.1 小鼠體質量及肝臟重量變化情況 模型組小鼠的體質量顯著高于正常組，而利拉魯肽處理后小鼠體質量明顯減輕（P＜0.01）。與正常組比，模型組的肝指數顯著升高（P＜0.01）；與模型組相比，利拉魯肽組小鼠的肝指數顯著降低（P＜0.01）。見圖1。

2.2 小鼠肝組織病理染色結果 HE染色結果表明，正常組肝細胞排列整齊，細胞中間有大而圓的細胞核，細胞質均勻，無脂肪滴浸潤；與正常組比，模型組小鼠肝組織內出現大量大小不等的脂肪空泡，肝細胞排列紊亂，部分可見炎性細胞浸潤；與模型組比，利拉魯肽組肝臟組織病變減輕，肝細胞排列整齊，脂肪滴明顯減少。油紅O染色結果表明，正常組肝組織中幾乎無脂肪滴；與正常組比，模型組脂肪滴增多且在肝組織中分布廣泛；與模型組比，利拉魯肽組的脂肪滴明顯減少。見圖2。

2.3 小鼠血清中TG、AST、ALT的表達 與正常組比，模型組血清中的TG、AST、ALT顯著升高；與模型組比，利拉魯肽組的TG、AST、ALT顯著降低，差異均有統計學意義（P＜0.01）。見圖3。

圖1 小鼠體質量（A）和肝指數（B）及3組小鼠肝臟外觀圖（C）

圖2 肝組織病理染色結果（×20）

圖3 各組小鼠血清中TG、AST、ALT的表達

2.4 小鼠肝組織中抗炎細胞因子IL4和IL-10 的表達 與模型組比，利拉魯肽組IL-4（P＜0.05）和IL-10（P＜0.01）mRNA表達水平顯著上升，且IL-4（P＜0.01）和IL-10（P＜0.01）濃度也顯著上升，差異均有統計學意義。見圖4。

2.5 利拉魯肽對M2型巨噬細胞及標志物mRNA表達的影響 與模型組比，利拉魯肽組M2型巨噬細胞比例顯著上升，且CD206、CD301、MGL-1、MGL-2和Arg-1 mRNA表達量也顯著升高，差異均有統計學意義（P＜0.01）。見圖5。

3 討論

NAFLD在我國是除病毒性肝炎外的第二大肝病，可增加患者肝臟相關病死率和心血管疾病風險，其發(fā)病機制與胰島素抵抗和代謝綜合征密切相關[2]。目前臨床上對于2型糖尿病NAFLD患者主要治療方式為注射胰島素或口服降血糖的藥物，但經常令患者出現肥胖或血脂代謝紊亂等不良反應[10]。GLP-1是由腸道L細胞受營養(yǎng)素刺激而分泌的多肽類激素，已有研究發(fā)現GLP-1類似物利拉魯肽可降低2型糖尿病患者的TG、TC水平[11]。RAHMAN等[12]也發(fā)現GLP-1在脂肪肝疾病的小鼠模型中改善胰島素抵抗，提高胰島素敏感性，且胰島素抵抗與NAFLD密切相關[11，13]，提示利拉魯肽對NAFLD具有治療作用。在本研究中，模型組小鼠的體質量、肝指數、TG、AST、ALT明顯升高，肝臟組織病變程度明顯加重，證實NAFLD模型成立。與之前的研究結果[11，14]一致，本研究結果表明利拉魯肽可以顯著降低高脂飲食誘導的NAFLD小鼠的體質量、肝指數、TG、AST、ALT。一項小型早期試驗表明利拉魯肽改善肝臟組織學特征和肝功能[15]，本研究病理結果也顯示脂肪性降低，這些結果證實了利拉魯肽對2型糖尿病NAFLD具有降脂保肝的作用。

圖4 小鼠肝組織中IL4和IL-10的表達

圖5 利拉魯肽對M2巨噬細胞及極化標志物mRNA的影響

巨噬細胞是人體非常重要的免疫細胞，可增強機體防御功能，不同亞型的巨噬細胞具有的功能也不一樣，目前公認的巨噬細胞亞型為M1型巨噬細胞和M2型巨噬細胞，前者促炎作用，后者具有抗炎作用[16]。NAFLD主要的病理學特征為脂質以脂肪滴形式沉積于肝細胞中，肝臟內脂質的大量堆積[17]。研究發(fā)現，巨噬細胞可對肝臟細胞中的脂質代謝發(fā)揮重要作用[18]。在肝臟中，脂質的過氧化產物可激活NF-κB，活化后的NF-κB可促進多種炎性因子的表達，如IL-6可誘導機體產生胰島素抵抗，TNF-α促進肝臟的氧化應激，令肝細胞發(fā)生凋亡；而M2型巨噬細胞可分泌抗炎細胞因子，增強肝細胞脂質分解，減少脂質的沉積，從而改善NAFLD的病理學特征[19]。MAINA等[20]研究發(fā)現，在NAFLD小鼠的肝臟組織中出現Ml/M2型巨噬細胞比例的增加，且WAN等[16]研究發(fā)現M2型巨噬細胞可誘導M1型巨噬細胞凋亡，減輕炎癥反應和細胞損傷，說明M2巨噬細胞可對NAFLD發(fā)揮治療作用。為了探究利拉魯肽對M2巨噬細胞的影響，本研究檢測了NAFLD小鼠肝臟組織中M2型巨噬細胞及其標志物的表達，結果顯示利拉魯肽可顯著促進M2型巨噬細胞及其標志物的表達，且本研究結果還表明利拉魯肽顯著促進了NAFLD小鼠IL-4和IL-10 的表達水平。IL-4和IL-10 作為是機體重要的抗炎細胞因子，能誘導巨噬細胞極化成M2型巨噬細胞[21-22]。以上結果說明利拉魯肽可通過促進IL-4和IL-10的表達極化M2巨噬細胞，提高NAFLD小鼠肝臟組織中M2巨噬細胞的比例。

綜上所述，利拉魯肽能顯著降低高脂飲食誘導的NAFLD小鼠的體質量、肝指數、TG、AST和ALT的增加，改善肝臟組織的脂肪變性，說明利拉魯肽對2型糖尿病NAFLD具有治療作用；其作用機制可能通過促進IL-4和IL-10的表達極化M2型巨噬細胞從而改善2型糖尿病NAFLD。