鄒瑜馳，陳珺，黃文婷，劉歡，胡健，劉斐，王冬雪，朱麗云，林麗

（1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 老年醫(yī)學(xué)科，浙江 溫州 325015；2.溫州醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院，浙江溫州 325035）

帕金森病（Parkinson’s disease，PD）是一種常見的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病[1]。PD的病理改變是腦部黑質(zhì)致密部紋狀體多巴胺（dopamine，DA）能神經(jīng)元發(fā)生進(jìn)行性變性，造成黑質(zhì)紋狀體內(nèi)DA及相似酶系統(tǒng)的單胺類神經(jīng)遞質(zhì)去甲腎上腺素（norepinephrine，NE）、5-羥色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）明顯減少。研究報(bào)道姜黃素具有神經(jīng)保護(hù)作用[2]，姜黃素類似物L(fēng)6H3[（E）-3-（4-羥基-3-甲氧基苯基）-1-（4-甲氧基苯基）丙-2-烯-1-酮]去除了姜黃素結(jié)構(gòu)中的不穩(wěn)定的β-二酮基團(tuán)，具有更好穩(wěn)定性的同時(shí)也能發(fā)揮與姜黃素相似的神經(jīng)保護(hù)作用[3]，而L6H3對PD及其腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)的影響鮮見報(bào)道。本研究探討姜黃素類似物L(fēng)6H3對PD大鼠腦部紋狀體細(xì)胞外液中7種單胺類神經(jīng)遞質(zhì)及其代謝物的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：35只SPF級雄性SD大鼠（6～8周齡），體質(zhì)量250～300 g，由溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號：SCXK（浙）2015-001。

1.1.2 儀器：腦立體定位儀購于德國KOPF公司；微透析系統(tǒng)包括CMA402型微透析泵、CMA/12型微透析探針（透析膜長度2.0 mm，直徑0.5 mm）、探針引導(dǎo)管、CMA120型清醒動(dòng)物活動(dòng)裝置均購于瑞典CMA/Microdialysis公司。Agilent1100型高效液相色譜儀和Aglient C18色譜柱（2.1 mm i.d.×150 mm，5 μm）均購于美國Aglient公司；Decade II SDC電化學(xué)分析儀購于荷蘭Antec Leyden公司；低溫離心機(jī)購于美國Thermo Fisher公司；XEVO TQ-S micro質(zhì)譜儀購于美國Waters公司。

1.1.3 試劑：6-羥基多巴胺（6-OHDA）、腎上腺素（epinephrine，E）、NE、DA、3，4-二羥基苯乙酸（3，4-Dihydroxyphenylaceticacid，DOPAC）、5-羥吲哚乙酸（5-HIAA）、高香草酸（homovanillic acid，HVA）、5-HT均購于美國Sigma-Aldrich公司。

1.2 方法

1.2.1 PD大鼠造模：大鼠腹腔注射10%水合氯醛（3 mL/kg）進(jìn)行麻醉，使用耳桿將其頭部水平固定于立體定位儀上，頭部剃毛消毒，在頭部做縱向切口，暴露前囟和人字點(diǎn)。參考《大鼠腦立體定位圖譜》，選取右側(cè)紋狀體作為注射區(qū)，定位坐標(biāo)為前囟0.7 mm、中線右旁3.0 mm、硬膜下5.5 mm，并使用臺式牙科鉆在顱骨上鉆出注射口。微量注射器吸取1.5 μg/μL的6-OHDA溶液10 μL（由含有2.0 g/L維生素C的0.9%氯化鈉溶液配制），并使用微量注射泵以10 nL/s的速度進(jìn)行緩慢注射，且為了使藥物充分彌散，每注射5 μL間隔留針5 min，注射完畢后也留針10 min，最后緩慢勻速退出注射器，縫合處理傷口，待其清醒后回籠正常飼養(yǎng)。

1.2.2 分組：手術(shù)后1周，對造模大鼠進(jìn)行行為學(xué)檢測，連續(xù)4周，每周1次，每次腹腔注射阿撲嗎啡溶液（0.5 mg/kg）誘發(fā)大鼠旋轉(zhuǎn)行為。取動(dòng)物置于干凈的盆地，觀察大鼠行為，并記錄每分鐘大鼠向未損傷一側(cè)旋轉(zhuǎn)的次數(shù)以及0.5 h內(nèi)旋轉(zhuǎn)的總次數(shù)。旋轉(zhuǎn)360°記為1圈/轉(zhuǎn)（r），普遍認(rèn)為30 min內(nèi)旋轉(zhuǎn)圈數(shù)穩(wěn)定≥7 r/min時(shí)，判定該帕金森大鼠模型建立成功[4]。將造模成功的大鼠隨機(jī)分為PD組，PD+L6H3組，每組10只。PD+L6H3組連續(xù)2周給予L6H3（腹腔注射，50 mg/kg）。另作15只假手術(shù)組大鼠，按上述同樣坐標(biāo)和操作方法，注射等體積含有2.0 g/L維生素C的0.9%氯化鈉溶液。定期觀察記錄大鼠狀態(tài)，并按時(shí)補(bǔ)充飼料和水分。

1.2.3 色譜條件：色譜柱Aglient C18柱（2.1 mm i.d.×150 mm，5 μm）；流動(dòng)相為pH=3.0的0.1 mol/L H3PO4-NaH2PO4緩沖液與甲醇的混合液（90:10，V/V；緩沖液中含2.0 mmol/L KCl、0.1 mmol/L Na2EDTA和0.74 mmol/L辛烷磺酸鈉），流速為0.3 mL/min，柱溫恒定37 ℃。電化學(xué)檢測為三電極系統(tǒng)：以玻碳電極作為工作電極，Ag/AgCl電極為參比電極，并以不銹鋼基體為輔助電極。工作電位為0.55 V，進(jìn)樣量為20 μL。

1.2.4 微透析活體取樣：在造模后的第4周后開始給藥，L6H3給藥后第1、2周（即造模后第5、6周）和停藥后第1周（即造模后第7周），用給藥時(shí)已埋入的引導(dǎo)管分別對假手術(shù)組、PD組和PD+L6H3組（每組10只）進(jìn)行腦部紋狀體組織活體微透析取得細(xì)胞外液。取樣時(shí)在大鼠輕度麻醉后將探針緩慢地插入引導(dǎo)管定位的紋狀體區(qū)，而在大鼠清醒自由活動(dòng)狀態(tài)下，使用Ringer試劑為灌流液，以1.0 L/min的微透析速率收集樣品。為了避免之前外科手術(shù)帶來的損傷，前60 min的樣品將會(huì)被棄去，收集的樣品被置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 LC-MS/MS檢測鼠大腦皮質(zhì)中L6H3的含量：L6H3給藥24 h后，取鼠大腦皮質(zhì)，稱重后置于1.5 mL的EP管中，按比例加入裂解液后勻漿，離心10 min（12 000 r/min，4 ℃），取100 μL上清液轉(zhuǎn)移至新EP管中，加入200 μL乙腈，渦旋1 min，再離心10 min（13 000 r/min，4 ℃），取上清液至內(nèi)襯管中，放入進(jìn)樣瓶中進(jìn)行LC-MS/MS檢測。

2 結(jié)果

2.1 大鼠腦內(nèi)L6H3含量的檢測 給藥后在鼠大腦皮層中能夠檢測到L6H3的存在，表明L6H3能透過大鼠的血腦屏障，見圖1。

圖1 L6H3的結(jié)構(gòu)示意圖及LC-MS/MS檢測L6H3的色譜圖

2.2 PD組大鼠腦部損傷側(cè)紋狀體中單胺類神經(jīng)遞質(zhì)檢測 PD組大鼠腦部紋狀體細(xì)胞外液中單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的色譜分離圖，各物質(zhì)在30 min內(nèi)能完全分離出來，見圖2。

圖2 PD組大鼠腦紋狀體微透析液中單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的色譜分離圖

2.3 3組大鼠腦部紋狀體中單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的檢測 與假手術(shù)組相比，PD組腦部損傷側(cè)紋狀體細(xì)胞外液中的DA、DOPAC、HVA、NE、E、5-HT和5-HIAA含量在造模4周后均顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。與PD組相比，PD+L6H3組的DA、NE和E含量于造模第6周（給藥第2周）和造模第7周（停藥第1周）后明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與PD組相比，PD+L6H3組的DOPAC、HVA、5-HT和5-HIAA的含量于造模第6周（給藥第2周）和造模第7周（停藥第1周）顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見圖3。

圖3 造模后第4周、第5、第6周（給藥后第1、第2周）及第7周（停藥后第1 周）3 組大鼠紋狀體中單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的變化

3 討論

PD手術(shù)治療費(fèi)用昂貴，目前還是以藥物治療為主。如臨床上較常使用的左旋多巴，只能通過外源性補(bǔ)充腦內(nèi)DA，緩解PD癥狀，但其不能改善DA能神經(jīng)元變性，對疾病的進(jìn)程沒有治療作用。近年來，PD藥物治療由直接補(bǔ)充DA轉(zhuǎn)向多環(huán)節(jié)治療，重點(diǎn)集中于對DA能神經(jīng)元的保護(hù)作用。

姜黃素是一種從姜科植物的根莖中提取的具有α，β-不飽和二酮的化合物[2]。該天然產(chǎn)物表現(xiàn)出降血脂、抗腫瘤、抗炎、抗氧化、保護(hù)DA能神經(jīng)元等功能[5]，但姜黃素也具有穩(wěn)定性差、生物利用度低、不能通過血腦屏障等不能成藥的缺點(diǎn)[6]。L6H3是去除姜黃素結(jié)構(gòu)中不穩(wěn)定的β-二酮基團(tuán)，同時(shí)保留了姜黃素的有效治療基團(tuán)的姜黃素類似物。L6H3能順利通過血腦屏障，具有不受給藥途徑限制的優(yōu)點(diǎn)。本研究表明，L6H3能提高PD大鼠腦紋狀體中單胺類神經(jīng)遞質(zhì)及其相關(guān)代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量，顯示其可能具有DA能神經(jīng)元保護(hù)作用，具體的作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

單胺類神經(jīng)遞質(zhì)是調(diào)控機(jī)體生物活動(dòng)的重要物質(zhì)，也是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮信息傳遞的物質(zhì)。目前研究認(rèn)為，PD病理表現(xiàn)的DA能神經(jīng)元變性、死亡，導(dǎo)致腦內(nèi)多種神經(jīng)遞質(zhì)失衡，其中在黑質(zhì)-紋狀體通路以DA為代表的單胺類神經(jīng)遞質(zhì)變化最為顯著。NE是由腦內(nèi)腎上腺素能神經(jīng)末梢合成及分泌的神經(jīng)遞質(zhì)，PD患者血清中NE的含量較低[7]。5-HT作為神經(jīng)遞質(zhì)參與痛覺、睡眠和體溫等生理功能調(diào)節(jié)。有研究顯示[8]，PD患者腦中5-HT出現(xiàn)輕到中度的降低，而持續(xù)性的5-HT降低可增加PD患者抑郁癥狀的發(fā)生。目前已有大量研究通過檢測紋狀體區(qū)域的單胺類神經(jīng)遞質(zhì)作為PD的病理生理狀態(tài)的評估[9]。

測定單胺類神經(jīng)遞質(zhì)常用的方法有熒光法、放射酶學(xué)法、毛細(xì)血管電泳法和高效液相色譜法等。熒光法存在樣品前處理復(fù)雜、結(jié)果重復(fù)性差等缺點(diǎn)。放射酶學(xué)法有較高的靈敏度，而操作條件嚴(yán)苛、技術(shù)難度高以及檢測速度慢等缺點(diǎn)限制其使用與推廣；色譜法具有分離效率高、選擇性好的特點(diǎn)；電化學(xué)檢測器具有靈敏度高、重現(xiàn)性好的特點(diǎn)。較HPLC-UV和HPLC-熒光，HPLC-ECD聯(lián)用后靈敏度更高、檢出值更低，更適用于檢測腦組織中微量的單胺類神經(jīng)遞質(zhì)及其代謝產(chǎn)物的含量[10]。目前HPLC-ECD已被廣泛應(yīng)用于檢測實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腦中以及臨床患者腦脊液中神經(jīng)遞質(zhì)的含量，并且能夠同時(shí)檢測多種單胺類神經(jīng)遞質(zhì)。

由于單胺類神經(jīng)遞質(zhì)及其代謝產(chǎn)物在腦中的含量極少，且對光、熱均不穩(wěn)定，有效的樣品處理方法同樣是測定腦中神經(jīng)遞質(zhì)的關(guān)鍵。而當(dāng)前大多檢測動(dòng)物實(shí)驗(yàn)樣品均是從已死亡的腦組織中提取的組織液，如液氮凍斃后的蜜蜂腦組織勻漿液[9]、大鼠腦組織勻漿液[11]、家兔腦組織勻漿液。動(dòng)物的麻醉狀態(tài)及后期樣品的收集過程，都會(huì)對組織液中神經(jīng)遞質(zhì)產(chǎn)生變化，因而其結(jié)果并不能真實(shí)地反映神經(jīng)遞質(zhì)的變化。微透析活體取樣為一種新型生物采樣技術(shù)，它是通過將一個(gè)尖端帶有可透過小分子物質(zhì)的半透膜探針插入活體動(dòng)物組織進(jìn)行生物采樣，能夠在不影響動(dòng)物正常生理活動(dòng)的情況下收集生理活性樣品，幫助動(dòng)態(tài)研究生物體的某些生化物質(zhì)的變化[12]。該方法收集的樣品已直接排除蛋白質(zhì)等大分子的干擾，具有處理操作快速簡單的優(yōu)點(diǎn)[13-14]，能在最大程度上保留樣品中神經(jīng)遞質(zhì)含量。也有研究報(bào)道測量血漿[15]、尿液[16]中單胺類神經(jīng)遞質(zhì)含量，但這只是通過檢測神經(jīng)遞質(zhì)代謝后的含量來間接反映神經(jīng)遞質(zhì)釋放情況；而紋狀體微透析液中的細(xì)胞外神經(jīng)遞質(zhì)主要來自于神經(jīng)末梢的釋放，因此紋狀體細(xì)胞外液能夠直接反映神經(jīng)遞質(zhì)的釋放情況。將微透析活體取樣與HPLC-ECD相結(jié)合具有靈敏度高、分離有效和所需樣品量小等特點(diǎn)。本研究采用微滲透活體取樣與HPLC-ECD聯(lián)用檢測大鼠腦部紋狀體細(xì)胞外液中7種單胺類神經(jīng)遞質(zhì)及其代謝物，結(jié)果顯示，6-OHDA造模后腦部紋狀體細(xì)胞外液中單胺類神經(jīng)遞質(zhì)及其代謝物的含量顯著降低，再次驗(yàn)證了PD腦紋狀體中單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的含量降低。給予L6H3 2周后，L6H3能使單胺類神經(jīng)遞質(zhì)及其代謝物的含量升高。單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的變化是遞質(zhì)代謝疾病PD研究治療藥物的指標(biāo)。更值得注意的是，在L6H3停藥1周后單胺類神經(jīng)遞質(zhì)及其代謝物的含量沒有因?yàn)橥Ｋ幎档停潜３衷黾于厔?，說明L6H3的治療作用可能不是單純的通過給藥時(shí)上調(diào)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)含量，可能是通過發(fā)揮其DA能神經(jīng)元的修復(fù)作用，其主要作用機(jī)制也值得進(jìn)一步深入研究。