朱 慧，朱文俠，黃廣智，馬小娜

(1.延安大學(xué)醫(yī)學(xué)院，陜西 延安 716000；2.延安大學(xué)附屬醫(yī)院皮膚科，陜西 延安 716000)

臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(umbilical cord mesenchymal stem cells,UCMSCs)生物活性好，次均取材量較大且無(wú)倫理限制。mUCMSCs具有自我更新和向骨、軟骨、脂肪、心肌、肌纖維等成熟細(xì)胞分化的潛能。除此之外，還具有MSC的以下生物學(xué)特性[1]，主要包括：①免疫調(diào)節(jié)：有低免疫原性，移植后免疫排斥反應(yīng)較小。②旁分泌功能[2]：MSCs可產(chǎn)生細(xì)胞因子、趨化因子、外泌體等，參與機(jī)體免疫調(diào)控。③歸巢特性：與趨化因子作用，靶向遷移向損傷組織。因此，UCMSCs現(xiàn)常用作治療疾病、組織工程、再生醫(yī)學(xué)等研究的種子細(xì)胞。在體內(nèi)及一些體外實(shí)驗(yàn)中，細(xì)胞示蹤是必要的實(shí)驗(yàn)手段。

增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(enhanced green fluorecent protein，eGFP)示蹤法是用慢病毒作為載體將eGFP基因轉(zhuǎn)染到細(xì)胞，表達(dá)GFP以顯示綠色熒光，該方法熒光特異性高，易于檢測(cè)并且對(duì)細(xì)胞生物學(xué)特性影響較小，是目前較理想的細(xì)胞示蹤方法，也可直接利用GFP基因小鼠直接培養(yǎng)原代細(xì)胞[3]，用于示蹤實(shí)驗(yàn)，原理一致。本研究擬用慢病毒介導(dǎo)的eGFP標(biāo)記小鼠臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(mouse umbilical cord mesenchymal stem cells,mUCMSCs)，確定合適的最佳感染復(fù)數(shù)(MOI)，為其示蹤等實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

C57BL/6雌性小鼠，8周齡，懷孕14～15天，體重30～35 g，由昆明醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供【SCXK(滇)2013-0001】，飼養(yǎng)于昆明總醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心【SYXK(滇)2014-0010】。DMEM/f12培養(yǎng)基、胎牛血清(Fetal bovine serum，F(xiàn)BS；Invitrogen，USA)和trypsin-EDTA(Invitrogen，USA)，流式細(xì)胞術(shù)抗體(ebioscience，USA)；eGFP慢病毒(吉滿生物公司)。相差顯微鏡、熒光顯微鏡(NIKON)；活體成像儀(MIIS，USA)。

1.2 mUCMSCs的分離培養(yǎng)

處死C57BL/6小鼠(孕16～17 d)，取子宮串珠置于無(wú)菌50 mL離心管內(nèi)，迅速帶至超凈工作臺(tái)，無(wú)菌生理鹽水清洗臍帶3次。剪碎于1.5 mL EP管中，肉眼觀成糊狀，加入含20%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液(250～500 μL，根據(jù)組織勻漿的量自行判斷)，移液槍輕輕吹吸至充分懸浮后，均勻鋪至25 cm2培養(yǎng)瓶瓶底，靜置于37℃、CO2培養(yǎng)箱，16～18 h后輕拿至倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)特性及形態(tài)特征并適當(dāng)補(bǔ)液。每2～3日用10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液換液，注意觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，組織塊周圍細(xì)胞較為聚集時(shí)可進(jìn)行第一次傳代，傳代時(shí)換75 cm2或更大底面積的培養(yǎng)瓶，約3～5 d達(dá)80%融合時(shí)進(jìn)行傳代。收集第3代mUCMSCs，用于下一步實(shí)驗(yàn)，若較多則凍存。

1.3 mUCMSCs增殖曲線繪制

消化收集的第3代mUCMSCs，計(jì)數(shù)后用10%FBS培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為2×104個(gè)/mL，取100 μL/孔接種于96孔培養(yǎng)板，每孔設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。第3天和第7天全部細(xì)胞換液。接種后24 h開始，每天同一時(shí)間點(diǎn)取一組復(fù)孔換液后加入200 μL CellTiter 96?Aqueous One Solution Reagent，加液后3 h用酶標(biāo)儀測(cè)吸光度值，連續(xù)測(cè)試8 d之內(nèi)細(xì)胞增殖情況。取各時(shí)間點(diǎn)吸光度的平均值，以時(shí)間為橫坐標(biāo)、吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1.4 mUCMSCs分化潛能檢測(cè)

消化收集第三代細(xì)胞完成體外誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)。成脂分化：接種細(xì)胞(4×104/孔)于12孔板中培養(yǎng)6 h后，更換培養(yǎng)液為成脂誘導(dǎo)分化培養(yǎng)液，3～4 d換液一次，連續(xù)培養(yǎng)14 d后，4%多聚甲醛固定后加入油紅O染色；成骨分化：按照上述成脂分化培養(yǎng)細(xì)胞，成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)21 d后，固定并加入茜素紅染色；成軟骨分化：收集細(xì)胞并調(diào)整細(xì)胞密度為1.6×107/mL，每孔加5 μL到12孔板的中心，形成一個(gè)細(xì)胞滴，2 h后再緩慢加入成軟骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)液，2～3 d換液一次，不斷培養(yǎng)細(xì)胞會(huì)形成一個(gè)細(xì)胞團(tuán)漂浮起來，連續(xù)培養(yǎng)14 d后，4%多聚甲醛固定后石蠟包埋作病理切片，脫蠟后加入阿新藍(lán)染色。

1.5 mUCMSCs的標(biāo)記

慢病毒載體介導(dǎo)GFP基因轉(zhuǎn)染mUCMSCs將第3代mUCSC計(jì)數(shù)，計(jì)算每孔細(xì)胞數(shù)及不同MOI值(MOI=50、100、150、200)對(duì)應(yīng)的病毒滴度的體積，分別平均滴入六孔板的四個(gè)孔，并留僅加培養(yǎng)液的空白對(duì)照孔，滴入對(duì)應(yīng)體積的病毒，補(bǔ)足培養(yǎng)液，使每孔總液量體積為2 mL，輕輕上下、左右搖板，混勻即使病毒懸液與細(xì)胞充分接觸，4～8 h換液。48 h左右進(jìn)行熒光顯微鏡下觀察和體外細(xì)胞信號(hào)強(qiáng)度測(cè)定。

2 結(jié)果

2.1 mUCMSCs的分離及培養(yǎng)

小鼠臍帶取材后靜置培養(yǎng)24～48 h，即可在倒置顯微鏡下觀察到少許梭形貼壁細(xì)胞由組織塊邊緣或以散在的方式長(zhǎng)出(見圖1A)，2～3 d可見少數(shù)細(xì)胞集落形成。經(jīng)過換液棄除未貼壁的組織，第7～10 d可見細(xì)胞快速生長(zhǎng)至80%融合狀態(tài)時(shí)傳代培養(yǎng)。鏡下可見這些細(xì)胞密集排列呈現(xiàn)漩渦狀生長(zhǎng)，顯示間充質(zhì)干細(xì)胞的典型特征(見圖1B)，初步判斷這些貼壁生長(zhǎng)的成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞就是mUCMSCs。

圖1 mUCMSCs的形態(tài)特征bar=400μm

2.2 mUCMSCs增殖曲線

原代細(xì)胞增殖較慢，經(jīng)過傳代的細(xì)胞增殖生長(zhǎng)較一致。第三代細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(見圖2)顯示：第1～3天細(xì)胞增殖緩慢，第4～6天為對(duì)數(shù)增殖期，以后進(jìn)入相對(duì)穩(wěn)定狀態(tài)。細(xì)胞潛伏期、快速增殖期和平穩(wěn)期體現(xiàn)了經(jīng)典的細(xì)胞周期各個(gè)階段，呈S型，符合間充質(zhì)干細(xì)胞的生長(zhǎng)特征。

圖2 P3mUCMSCs的生長(zhǎng)曲線

2.3 mUCMSC的成軟骨、成脂、成骨三向分化

體外誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)顯示：第三代mUCMSCs經(jīng)成軟骨分化，誘導(dǎo)培養(yǎng)14 d后，固定并行病理切片檢測(cè)，可觀察到大量氨基葡聚糖被阿新蘭染成藍(lán)色(見圖3A)，即成軟骨分化陽(yáng)性。同樣，成脂分化誘導(dǎo)培養(yǎng)14 d后，可觀察到大量脂滴的出現(xiàn)，油紅O染色后，可見脂滴被染成紅色(見圖3B)，即成脂分化陽(yáng)性；成骨分化誘導(dǎo)培養(yǎng)21 d后，可觀察到白色結(jié)節(jié)，茜素紅染色后，可見鈣質(zhì)結(jié)節(jié)被染成紅色(見圖3C)，即成骨分化陽(yáng)性。

圖A，圖B，bar=100μ；圖C，bar=40μm

圖3mUCMSCs的體外誘導(dǎo)分化

2.4 慢病毒載體介導(dǎo)GFP基因轉(zhuǎn)染mUCMSCs的MOI篩選

將含GFP基因的慢病毒與mUCMSCs共培養(yǎng)48 h后，觀察不同MOI值eGFP慢病毒對(duì)mUCMSC的轉(zhuǎn)染情況。熒光場(chǎng)下可見表達(dá)綠色熒光蛋白的細(xì)胞，明場(chǎng)下可見所有細(xì)胞，疊加后可見表達(dá)GFP，也就是被GFP標(biāo)記的細(xì)胞在所有細(xì)胞的占比，MOI=150比例最高，達(dá)95%以上(見圖4)。小動(dòng)物活體成像儀下，曝光5分鐘拍照檢測(cè)細(xì)胞信號(hào)強(qiáng)度，MOI值=150的細(xì)胞組高于MOI值=50、100、200(見圖5，數(shù)值見表1)。

圖4 不同MOI值eGFP慢病毒對(duì)mUCMSC的轉(zhuǎn)染熒光表達(dá)對(duì)比(A、B：bar=400μm)

圖5 不同MOI值轉(zhuǎn)染的mUCMSC體外信號(hào)強(qiáng)度

MOI50100150200ROI1.367×1081.491×1081.971×1081.373×108

3 討論

臍帶和骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞為目前研究較為關(guān)注的多能干細(xì)胞。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)特性易受供者年齡及身體狀況甚至取材部位影響[4]，且取材有倫理學(xué)限制，而UCMSC由胎兒臍帶分離培養(yǎng)得到，將臍帶變廢為寶，增殖等生物學(xué)活性較為穩(wěn)定，且不受倫理學(xué)限制[5]。目前MSC治療疾病多處于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)階段，且疾病的標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物模型多為小鼠，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)為研究的基本步驟，因此mUCMSC的有效標(biāo)記示蹤顯得尤為重要。

綠色熒光蛋白(Green fluorence protein，GFP)是從水母中獲得的一種發(fā)綠色熒光的蛋白，常用質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染、病毒載體轉(zhuǎn)染和綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)基因動(dòng)物3種主要的標(biāo)記細(xì)胞方式。本研究成功分離培養(yǎng)出mUCMSC，并根據(jù)貼壁生長(zhǎng)、形態(tài)特征及生長(zhǎng)曲線規(guī)律判斷，用誘導(dǎo)液成功將其向骨骼、脂肪和軟骨三個(gè)方向分化，可鑒定其為間充質(zhì)干細(xì)胞特性。利用慢病毒作為載體，將熒光蛋白基因轉(zhuǎn)染到mUCMSC，使其表達(dá)熒光蛋白，這種標(biāo)記方法可以利用顯影設(shè)備追蹤到移植入小鼠體內(nèi)被標(biāo)記的細(xì)胞，如果被標(biāo)記細(xì)胞增殖分裂，則熒光蛋白將會(huì)在子代表達(dá)；被標(biāo)記細(xì)胞死亡，則熒光消失，這就使得移植入小鼠體內(nèi)的MSC的去向、存活、代謝和增殖等情況能很好地被觀察到[6]。eGFP慢病毒攜帶的是表達(dá)增強(qiáng)型綠色熒光蛋白的基因，因其穩(wěn)定且毒性小，應(yīng)用范圍較廣。MOI(multiplicity of infection，復(fù)染指數(shù))是一個(gè)比值，當(dāng)MOI=1時(shí)，病毒滴度與細(xì)胞個(gè)數(shù)的比例是1：1，即一個(gè)滴度的病毒對(duì)應(yīng)一個(gè)細(xì)胞。病毒滴度指的是1 mL病毒液內(nèi)的活性病毒數(shù)。本實(shí)驗(yàn)中，MOI=150時(shí)，細(xì)胞的轉(zhuǎn)染率達(dá)95%以上，可不用嘌呤霉素篩選，直接輸入小鼠體內(nèi)，進(jìn)行細(xì)胞示蹤，為體內(nèi)示蹤實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。