蔡霈 文曉柯 歐陽波 肖作奇

[摘要] 目的 研究地膚子總黃酮（FFK）對(duì)二硝基氯苯（DNBC）致大鼠變態(tài)反應(yīng)性接觸性皮炎（ACD）的抗炎作用。方法 SPF級(jí)SD大鼠40只，雌雄各半，按隨機(jī)數(shù)字表法分為五組，每組8只，即空白對(duì)照組、ACD模型組、陽性藥對(duì)照組（醋酸潑尼松龍2.5 mg/kg）、FFK低劑量組（75 mg/kg）、FFK高劑量組（150 mg/kg）;以DNBC建立大鼠ACD模型后，予以FFK灌胃給藥，連續(xù)10 d。觀察皮膚變態(tài)性反應(yīng)和腫脹度，同時(shí)測(cè)定血清中白細(xì)胞介素-6（IL-6）、白細(xì)胞介素-10（IL-10）和γ干擾素（IFN-γ）表達(dá)水平，并通過免疫組化檢測(cè)耳組織中核因子κB p65（NF-κB p65）表達(dá)水平。 結(jié)果 與空白對(duì)照組比較，ACD模型組大鼠皮膚腫脹度明顯增高，血清中IL-6、IFN-γ含量與耳組織中NF-κB p65蛋白表達(dá)明顯增高，而血清中IL-10含量明顯降低（P < 0.01）;與ACD模型組比較，F(xiàn)FK低劑量組與FFK高劑量組大鼠的耳腫脹度、血清中IL-6、IFN-γ含量、耳組織中NF-κB p65蛋白表達(dá)水平顯著降低（P < 0.01），而血清中IL-10含量顯著升高（P < 0.01）。 結(jié)論 FFK對(duì)于DNBC致大鼠ACD具有抗炎作用，其機(jī)制可能是通過抑制NF-κB p65蛋白發(fā)揮作用。

[關(guān)鍵詞] 地膚子總黃酮;炎癥;接觸性皮炎;核轉(zhuǎn)錄因子-κB p65

[中圖分類號(hào)] R758.22? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1673-7210（2019）07（b）-0017-04

Anti-inflammatory effect of the total flavonoids of Fructus Kochiae in DNBC-induced allergic contact dermatitis rats

CAI Pei? ?WEN Xiaoke? ?OUYANG Bo? ?XIAO Zuoqi

Department of Pharmaceutical Research， Hu′nan Provincial Maternal and Child Health Care Hospital， Hu′nan Province， Changsha? ?410008， China

[Abstract] Objective To investigate the anti-inflammatory effect of the total flavonoids of Fructus Kochiae （FFK） on DNBC-induced allergic contact dermatitis （ACD） rats. Methods According to random number table method， 40 half male and half female SPF grade SD rats were randomly divided into 5 groups， with 8 rats in each group， including blank control group， ACD model group， positive control group （Splash Methylprednisolone 2.5 mg/kg）， FFK low-dose group （75 mg/kg）， FFK high-dose group （150 mg/kg）. After ACD model were established by treatment of DNCB on right ear for 10 days， rats were treated with FFK in 10 d and the allergic reaction and swelling degree of ears were observed， the content of IL-6， IL-10 and IFN-γ in serum and the level of NF-κB p65 in ears were determined. Results Compared with the blank control group， the swelling of ears in ACD model group was significantly increased， the content of IL-6， IFN-γ in serum and the level of NF-κB p65 in ears were up-regulated， while the content of IL-10 was down-regulated in serum （P < 0.01）. Compared with the ACD model group， the ears swelling degree of rats in FFK low-dose group and FFK high-dose group was significantly decreased， the content of IL-6， IFN-γ in serum and the level of NF-κB p65 in ears were significantly down-regulated， while the content of IL-10 in serum was significantly up-regulated （P < 0.01）. Conclusion FFK has anti-inflammatory effect on DNBC-induced ADC rats and its mechanism involved in down-regulate the NF-κB p65.

[Key words] Total flavonoids of Fructus Kochiae; Inflammation; Allergic contact dermatitis; NF-κB p65

地膚子為黎科植物地膚Kochia Scoparia （L.） Schrad.的干燥成熟果實(shí)，其性寒、味甘苦，具有清熱利濕、祛風(fēng)止癢等功效，常用于小便澀痛、陰癢帶下、皮膚瘙癢、濕疹等病癥[1]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究證明，地膚子具有抗氧化、抗過敏、抗病原微生物等作用[3-7]。地膚子主要含有黃酮及皂苷類成分，皂苷類成分近年來研究較多，而對(duì)于黃酮類的成分卻鮮見報(bào)道。目前，地膚子黃酮類成分的藥理作用研究?jī)H限于其體外抗氧化活性[8-9]。本研究通過建立二硝基氯苯（DNBC）誘導(dǎo)的大鼠變態(tài)反應(yīng)性接觸性皮炎（ACD）評(píng)價(jià)地膚子總黃酮（total flavonoids of Fructus Kochiae，F(xiàn)FK）對(duì)其治療作用，觀察FFK對(duì)于大鼠ACD的治療作用并對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行初步探討。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物? SPF級(jí)SD大鼠，雌雄各半，體重50～60 g，購(gòu)于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，許可證號(hào)：SCXK（湘）2011-0003。動(dòng)物合格證號(hào)為：NO.4300470013754。飼養(yǎng)于湖南師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，自由進(jìn)食及飲水，實(shí)驗(yàn)室溫度（22±2）℃，濕度60%～80%，人工光照約12 h∶12 h明暗周期。

1.1.2 藥品與試劑? 醋酸潑尼松龍片（規(guī)格1片∶5 mg）購(gòu)于天方藥業(yè)有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：180211135;2，4-硝基氯苯（2，4-DNCB），購(gòu)于山東西亞化學(xué)股份有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：W5784;IL-6（貨號(hào)：F3066-A）、白細(xì)胞介素-10（IL-10，貨號(hào)：F3071-A）、TNF-α（貨號(hào)：F3056-A）均購(gòu)于上?？婆d生物科技有限公司;核轉(zhuǎn)錄因子-κB p65（NF-κB p65）大鼠抗體（貨號(hào)：ARG65677）購(gòu)于上海雅吉生物科技有限公司;蘆丁購(gòu)自上海詩(shī)丹德生物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：153-18-4，純度為99.8%;乙醇、丙酮均為國(guó)產(chǎn)分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán);地膚子購(gòu)于湖南衡東縣中藥飲片廠，生產(chǎn)批號(hào)：20170428，經(jīng)湖南省中醫(yī)院藥學(xué)部王竹鑫主任藥師鑒定為黎科植物地膚的干燥成熟果實(shí)，各項(xiàng)規(guī)定均符合2015年版《中華人民共和國(guó)藥典》[1]。

1.1.3 儀器設(shè)備? Leica RM2235型萊卡石蠟切片機(jī)（德國(guó)萊卡）;SEN-CO W201恒溫水浴鍋（上海申生科技有限公司）;5424R高速離心機(jī)（Eppendorf）;DP72奧林巴斯顯微成像系統(tǒng);RT-6100酶標(biāo)分析儀（深圳雷杜生命科學(xué)股份有限公司）;XS205型電子天平（德國(guó)梅特勒-托利多）。

1.2 方法

1.2.1 地膚子總黃酮的制備? 地膚子粉碎后經(jīng)80%乙醇提取，經(jīng)大孔樹脂富集減壓干燥所得棕色粉末即為FFK，以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品，應(yīng)用NaNO2-Al（NO3）3-NaOH反應(yīng)體系測(cè)得其含量為85.64%總黃酮有效部位。

1.2.2 DNCB誘導(dǎo)的大鼠ACD模型建立? 將丙酮與橄欖油按4∶1的體積比混合均勻，加入不同質(zhì)量的DNCB使其溶解，最后配制成1%和7%的DNCB溶液。首先將7% DNCB溶液涂抹于大鼠腹部除毛處進(jìn)行腹部致敏，之后改用1% DNCB溶液增強(qiáng)致敏。5 d后將1% DNCB溶液涂抹于大鼠右耳，連續(xù)3 d，即建立DNCB誘導(dǎo)的ACD大鼠模型[10]。

1.2.3 地膚子總黃酮對(duì)ACD大鼠的抗炎作用? 取8只正常大鼠為空白對(duì)照組，取40只ACD大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為ACD模型組、陽性藥對(duì)照組（醋酸潑尼松龍2.5 mg/kg）、FFK低劑量組（75 mg/kg）、FFK高劑量組（150 mg/kg），每組8只;各組灌胃給藥10 d后（空白對(duì)照組與DNCB模型組予以等體積1% CMC-Na，其余各組藥物均以1% CMC-Na混懸），以8 mm穿孔器右耳組織，并用千分尺測(cè)量厚度評(píng)價(jià)鼠耳腫脹程度。同時(shí)各組取4只大鼠耳組織石蠟包埋切片然后進(jìn)行HE染色分析。

1.2.4 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）測(cè)定大鼠血液中的炎癥因子? 腹主動(dòng)脈采集上述給藥10 d后的大鼠血液樣本2 mL，室溫靜置30 min后，于4℃，3000 r/min離心10 min，收集血清樣本于-80℃冰箱保存。參照試劑盒說明書用ELISA法檢測(cè)血清中白細(xì)胞介素-6（IL-6）、IL-10和γ干擾素（IFN-γ）含量。

1.2.5 免疫組化評(píng)價(jià)? 檢測(cè)大鼠耳組織中的NF-κB p65的蛋白表達(dá)水平。取“1.2.2”石蠟切片進(jìn)行免疫組化分析。即經(jīng)脫蠟固定后，加入NF-κB p65一抗（1∶500）、二抗孵育，之后染色封片，應(yīng)用Image-Pro Plus 6.0對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以各組積分光密度均值與空白對(duì)照組比值表示。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA）和Dunnett′s t檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 FFK對(duì)ACD大鼠耳腫脹度的影響

經(jīng)10 d的藥物治療后，與空白對(duì)照組比較，ACD模型組大鼠右耳仍呈明顯的紅腫狀態(tài)，而陽性藥對(duì)照組大鼠經(jīng)潑尼松治療后基本恢復(fù)正常，F(xiàn)FK低、高劑量組均有效改善了大鼠右耳的紅腫狀態(tài)。與空白對(duì)照組比較，ACD模型組大鼠耳厚和耳重明顯增加（P < 0.01）;與ACD模型組比較，F(xiàn)FK高、低劑量組大鼠耳厚和耳重顯著降低（P < 0.01）。見表1。

2.2 大鼠耳組織病理學(xué)觀察

與空白對(duì)照組比較，經(jīng)DNCB誘導(dǎo)的ACD模型大鼠耳組織切片HE染色顯示其單核細(xì)胞出現(xiàn)明顯浸潤(rùn)，表皮細(xì)胞呈角質(zhì)化，耳組織可見明顯腫脹，而FFK高、低劑量組與陽性藥對(duì)照組可見其耳組織的紅腫與炎癥狀態(tài)有明顯改善。見圖1。

2.3 FFK對(duì)ACD大鼠血清中炎癥因子IL-6、IL-10與IFN-γ的影響

免疫共沉淀結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組比較，ACD模型組大鼠血清中IL-6、IFN-γ的含量顯著升高（P < 0.01），而IL-10的含量明顯降低（P < 0.01），提示ACD模型大鼠發(fā)生了嚴(yán)重的炎性反應(yīng)。而經(jīng)過FFK治療后的ACD模型大鼠其血清中IL-6與IFN-γ含量顯著降低（P < 0.01），IL-10顯著升高（P < 0.01），提示FFK能夠有效治療ACD模型大鼠的炎性反應(yīng)。見圖2。

2.4 FFK對(duì)ACD大鼠NF-κB p65表達(dá)的影響

免疫組化分析結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組比較，ACD模型組大鼠耳組織NF-κB p65蛋白表達(dá)顯著上調(diào)，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）;與ACD模型組比較，F(xiàn)FK低、高劑量組能夠下調(diào)由DNCB誘導(dǎo)的大鼠耳組織NF-κB p65表達(dá)，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。見圖3～4。

3 討論

炎癥是多種疾病的基本病理過程，人類的許多常見疾病如各種病原體感染（肝炎、結(jié)核病等）、自身免疫性疾病、皮炎濕疹等都屬于炎癥范疇。炎癥的發(fā)生過程不僅與炎癥相關(guān)酶、炎癥介質(zhì)、細(xì)胞因子有關(guān)，還涉及核因子-κB、一氧化氮、自由基的參與。NF-κB是細(xì)胞炎癥以及多種自身免疫性疾病調(diào)節(jié)的關(guān)鍵蛋白[11-13]。它在應(yīng)激條件下能夠刺激輔助性T細(xì)胞產(chǎn)生IL-2、IL-6、IL-10以及IFN-γ等炎癥因子[14-17]，如IFN-γ能夠活化巨噬細(xì)胞，繼而釋放多種炎癥介質(zhì)[18-19]。DNCB能夠與上皮蛋白可溶性部分共價(jià)結(jié)合成為完全抗原，已廣泛應(yīng)用于建立ACD模型，其機(jī)制為誘導(dǎo)皮膚組織的T細(xì)胞浸潤(rùn)，包括Th1誘導(dǎo)的遲發(fā)型超敏反應(yīng)和Th2誘導(dǎo)的過敏反應(yīng)，而這一反應(yīng)激活了下游的IL-6、IFN-γ等炎癥因子[20-22]。

對(duì)于炎癥的治療，常用糖皮質(zhì)激素類甾體抗炎藥和非甾體抗炎藥，前者易產(chǎn)生依賴性，且易引起腎上腺皮質(zhì)功能衰退等不良反應(yīng)，后者的胃腸道不良反應(yīng)普遍，因此從天然藥物中開發(fā)抗炎藥物受到廣泛關(guān)注。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)DNCB誘導(dǎo)的ACD模型大鼠，其耳組織厚度、重量以及HE染色結(jié)果均表明耳組織發(fā)生腫脹與炎性反應(yīng)，ACD模型大鼠血清中檢測(cè)到IL-6和IFN-γ含量升高，IL-10含量降低，而耳組織中同樣可見NF-κB p65蛋白表達(dá)上調(diào)，這說明大鼠處于應(yīng)激狀態(tài)發(fā)生了嚴(yán)重的炎性反應(yīng)。FFK能夠顯著降低ACD大鼠的耳組織腫脹，下調(diào)血清中IL-6和IFN-γ，上調(diào)IL-10，同時(shí)抑制耳組織中NF-κB p65蛋白的表達(dá)，提示FFK對(duì)于NF-κB p65具有顯著的下調(diào)作用，而這一下調(diào)作用在ACD模型大鼠中表現(xiàn)為抗炎藥理活性。上述結(jié)果提示，F(xiàn)FK對(duì)于DNCB誘導(dǎo)的ACD大鼠炎性反應(yīng)具有明顯的改善作用，其可能通過下調(diào)NF-κB p65表達(dá)，抑制炎癥相關(guān)因子從而發(fā)揮抗炎作用。

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