付東旭 鄭令娜 劉金輝 汪冰 竺云 王萌 豐偉悅

摘 要 ：采用激光剝蝕電感耦合等離子體質譜技術（Laser ablationinductively coupled plasmamass spectrometry，? LAICPMS）， 建立了定量分析單細胞中銀納米顆粒（AgNP）的方法。利用噴墨打印機制備出與細胞基體相似的皮升級液滴， 作為單細胞定量標準， 再利用LAICPMS定量分析暴露AgNP的小鼠巨噬細胞。結果表明， 95個單細胞中AgNP含量為19.1～1682 fg， 呈對數正態(tài)分布， 平均值為（166±188） fg， 與酸消解分析得到的細胞群體AgNP平均含量（（175±2） fg）相符。LAICPMS在單細胞分析方面具有巨大潛力， 有望進一步應用于單細胞水平的金屬納米顆粒的生物效應和安全性研究。

關鍵詞 ：銀納米顆粒; 激光剝蝕電感耦合等離子體質譜; 單細胞分析; 定量分析

1 引 言

銀納米顆粒（AgNP）由于其獨特的抗菌性能， 被廣泛應用于生物醫(yī)學研究和工業(yè)產品[1]， 但是其在生物系統(tǒng)中的吸收、轉運、生物效應和毒理風險仍亟需深入研究[2]。細胞是生命的基本單元， 定量檢測細胞中的AgNP對于研究其生物效應及安全性具有重要意義。

細胞中金屬納米顆粒的傳統(tǒng)分析方法是消解大量細胞， 然后用原子光譜技術（如原子吸收光譜[3]和電感耦合等離子體發(fā)射光譜[4]）檢測。但是， 這類方法只能提供細胞群體的平均值， 不能獲得細胞準確的個體信息。單細胞分析可以獲得準確的個體信息， 更好地了解和闡述細胞的多樣性和異質性。目前用于測定單細胞中納米顆粒的方法主要有熒光顯微鏡[5]、電子顯微鏡[6]＼， 流式細胞儀[7]等。 上述方法有的要求分析對象具有熒光信號， 有的分析通量較低， 在分析單細胞中金屬納米顆粒時往往受到限制。

近年來， 電感耦合等離子體質譜（ICPMS）開始應用于單細胞分析[8～10]和單顆粒分析[1，12]。Tsang等[9]分析了單個幽門螺桿菌中的金屬鉍， 為研究鉍類藥物提供了新途徑; Zheng等[0]在單細胞水平上研究了量子點的吸收過程。但是， 上述應用只局限于分析懸浮液中的單細胞， 而不能對細胞進行原位分析。與上述基于溶液的單細胞分析不同， 激光剝蝕電感耦合等離子體質譜（Laser ablationinductively coupled plasmamass spectrometry， LAICPMS）具有微米級空間分辨率， 利用激光剝蝕固體樣品， 將產生的氣溶膠引入ICPMS完成檢測， 因此可以實現快速的原位、微區(qū)分析[1，12]。文獻中已有LAICPMS用于單細胞分析的報道[3～17]， 但在實際分析時， 由于缺少基體匹配的定量標準， 常常難以實現準確的定量分析。為了解決這個問題， van Malderen等[6]用微加工技術制備了明膠基體的單細胞標準， 定量分析了單細胞中的Cu，? 得到了單細胞中銅的分布圖; Wang等[7]利用噴墨打印機技術制備了單細胞標準， 定量分析了單細胞中金納米顆粒（AuNP）。

噴墨打印機可以在基底上精確打印皮升量級的小液滴， 其體積與細胞大小相近。 本研究利用噴墨打印機制備得到的小液滴作為單細胞的定量標準， 結合LAICPMS， 實現了對單細胞中AgNP的定量分析。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

Perkin Elmer NexION 300D電感耦合等離子體質譜儀（美國Perkin Elmer公司）; 配有雙體樣品池的New Wave NWR 213激光剝蝕系統(tǒng)（美國ESL公司）; MicroFab Jetlab Ⅱ噴墨打印機（美國MicroFab Technologies公司）; Binder C150細胞培養(yǎng)箱（德國Binder公司）; MilliQ超純水系統(tǒng)（美國Millipore公司）; Sartorius BS210S電子天平（德國Sartorius公司）。

銀納米顆粒（AgNP， 20 nm， 100 mg/L ， 南京納米東方生物技術有限公司）; 銀標準溶液（1000 mg/L， 中國計量科學研究院）; AgNO3（優(yōu)級純， 阿法埃莎公司）; 胎牛血清、DMEM/F12培養(yǎng)基、胰酶消化液（0.25%， TrypsinEDTA） （賽默飛世爾科技有限公司）; HNO3、HCl和H2O2（優(yōu)級純， 北京化學試劑公司）。磷酸鹽緩沖液（PBS， 碧云天生物技術研究所）; 實驗用水為超純水（MilliQ超純水系統(tǒng)制備）。

3 結果與討論

3.1 基體匹配的單細胞標準

本研究采用MicroFab JetLab II噴墨打印機制備基體匹配的Ag標準液滴點陣， 液滴的體積由噴墨打印機所用的噴頭口徑和壓電晶體電壓決定， 在優(yōu)化實驗條件下， 打印出液滴的質量偏差約為1%[8]。圖1是打印在載玻片上5 μg/g Ag液滴點陣的明場照片， 每個液滴直徑為（35 ±3） μm。由于液滴的直徑受到基底的表面性質、打印環(huán)境等因素的影響， 因此圖中液滴直徑的偏差大于液滴實際的質量偏差。通過ICPMS分析106個液滴的Ag含量， 計算出每個液滴中Ag的平均質量為21 ng。

LAICPMS測量時， 元素的信號強度與樣品基體的化學組成和物理性質等因素有關， 因此， 定量標準與待測樣品的基體要盡量相似[9]。本研究中的Ag標準液滴中含有2%羅丹明B， 含C量與單個細胞相近[7]; 銀標準液滴和單細胞樣品都置于玻璃片上， 干燥后用激光剝蝕， 因此得到氣溶膠基體元素主要為C和Si（來自玻璃）， 標準和樣品的基體相似。

3.2 LAICPMS定量分析單細胞中的AgNP

將制備得到的Ag標準液滴作為LAICPMS單細胞分析的定量標準， 激光的光斑大小為40 μm， 激光的能量為6.0 J/cm2， 以確保每個標準液滴或單細胞被完全剝蝕。圖2顯示了LAICPMS分析載玻片上不同濃度的Ag標準液滴， 可以看出Ag標準液滴的信號重復性很好， RSD≤8%， 標準曲線的線性相關系數R2=0.996， Ag元素的線性范圍為5～1051 fg。玻片上的空白區(qū)域未檢測到明顯的Ag信號， 檢出限和定量限分別按空白信號3倍和10倍的標準偏差計算， 分別為1.5 fg和4.7 fg Ag。

在對照組細胞未檢測出Ag的信號， 因此細胞中Ag的信號來自于暴露的AgNP。本研究采用LAICPMS分析了95個細胞， 發(fā)現單細胞中AgNP含量差別很大， 呈對數正態(tài)分布（圖4）。單細胞中Ag質量的范圍為19.1～1682 fg， Ag平均質量為（166±188 ）fg。同時用HNO3消解了7.1×106個細胞， 通過溶液ICPMS分析， 得到了細胞群體Ag質量的平均值為（175±2） fg， 兩種定量分析結果基本一致， 證明了建立的LAICPMS單細胞分析方法的可靠性。

與傳統(tǒng)的僅能得到細胞群體平均的方法不同， LAICPMS方法可以獲得單個細胞的信息， 在單細胞水平上研究細胞的異質性。本研究結果表明， 即使同一種細胞在相同培養(yǎng)條件下暴露同一劑量的AgNP， 單細胞中的AgNP含量也可能具有1～2數量級的差別。

在文獻中， 使用流式質譜儀[7]和X射線熒光[20]的方法， 定量分析單細胞中的金屬納米顆粒， 也得到了類似的結果。有很多原因可能造成單細胞中AgNP的差異： （1）由于基因的表達和蛋白的合成都是隨機的， 細胞群中存在細胞異質性[21]; （2）細胞生長的微環(huán)境不同（例如單個細胞周圍AgNP的團聚和沉積狀態(tài)不同）會影響單細胞對AgNP的吞噬能力[22]; （3）細胞周期也是影響細胞吞噬納米顆粒的關鍵因素[23]。目前基于LAICPMS的單細胞分析方法仍不成熟， 存在分析通量低、 不能區(qū)分單細胞中的納米顆粒和溶解態(tài)離子等缺點。未來可以通過優(yōu)化細胞制備過程（如將細胞排布成規(guī)整的陣列[24]）、使用新一代LAICPMS系統(tǒng)（如ICPTOFMS[25]）解決分析通量的問題。此外， 可以通過與其它能夠提供形態(tài)信息的方法（如同步輻射X射線吸收譜）聯用， 區(qū)分單細胞中的納米顆粒和溶解離子。

4 結 論

本研究利用噴墨打印機制備得到與細胞基體近似的單細胞定量分析標準， 并使用LAICPMS實現了對單細胞中AgNP的絕對定量分析。實驗結果表明， 在相同培養(yǎng)條件下小鼠巨噬細胞對AgNP具有不同的吞噬能力。單細胞中AgNP的準確定量分析， 有助于更好地理解細胞的異質性， 為在單細胞水平研究納米顆粒的生物效應和安全性提供新的途徑。與基于溶液的單細胞ICPMS分析方法相比， LAICPMS具有獨特的優(yōu)勢， 可以實現單細胞的原位分析， 只需要少量細胞就可以完成分析; 此外， 通過制備合適的單細胞標準， LAICPMS可以實現單細胞內納米顆粒的準確定量分析。

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Abstract In recent years， single cell analysis has become one of hot topics in analytical chemistry. In this work， a method was developed for quantitative analysis of silver nanoparticles （AgNP） in single cells by laser ablationinductively coupled plasmamass spectrometry （LAICPMS）. An inkjet printer was used to produce droplets of silver standards， which were similar to the matrixes of single cells. After exposed to AgNP， 95 single cells were quantitatively analyzed by LAICPMS using the droplet standards. The contents of AgNP in single cells showed a lognormal distribution， ranging from 19.1 fg to 1682 fg Ag per cell with an average of （166±188） fg Ag per cell， which was in good agreement with the average from cell population （（175±2） fg Ag per cell）. LAICPMS had great potential in single cell analysis and provided a new tool for studying biological effects of metal nanoparticles at a single cell level.

Keywords Sliver nanoparticles; Laser ablationinductively coupled plasmamass spectrometry; Single cell analysis; Quantitative analysis