張玉琪 張瑾如 王鋒 李家冬 司睿 呂麗珊 沈玉棟 王弘 HAMMOCK Bruce D 孫遠(yuǎn)明

摘 要 ：對硫磷是一種廣譜的有機(jī)磷酸酯類殺蟲、殺螨劑， 毒性極強(qiáng)， 可對環(huán)境和人類健康造成嚴(yán)重危害。盡管我國已禁止使用對硫磷， 但仍存在違禁使用現(xiàn)象， 加強(qiáng)對其監(jiān)測十分必要。納米抗體是已知最小的與抗原結(jié)合的片段（15 kDa）， 來源于駱駝科動物體內(nèi)重鏈抗體的可變區(qū)， 具有穩(wěn)定性強(qiáng)、靈敏度高、易表達(dá)、水溶性好等特性。本研究基于噬菌體展示技術(shù)構(gòu)建了抗對硫磷納米抗體庫， 其庫容為2.41 × 107 cfu/mL， 經(jīng)抗原抗體固相親和篩選及噬菌體酶聯(lián)免疫法（Phage ELISA）鑒定， 獲得5種抗對硫磷納米抗體VHH1、VHH6、VHH13、VHH21和VHH24。以結(jié)合能力最強(qiáng)的VHH1為基礎(chǔ)， 采用同源建模和分子對接技術(shù)探討VHH1與對硫磷分子的識別機(jī)制， 發(fā)現(xiàn)VHH1與對硫磷存在氫鍵和疏水間分子作用力， 關(guān)鍵氨基酸是Ser60、Lys104、Phe105、Gly106和Arg107。本研究為抗體的進(jìn)化改造和半抗原的設(shè)計提供了新思路。

關(guān)鍵詞 ：納米抗體; 對硫磷; 噬菌體展示; 分子模擬

1 引 言

對硫磷是一種廣泛使用的有機(jī)磷酸酯類農(nóng)藥，具有高毒性、持久性，可抑制乙酰膽堿酯酶的活性，導(dǎo)致體內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿的大量堆積，從而引起一系列的中毒反應(yīng)[1]。我國從2007年開始禁止使用對硫磷，但誤用、濫用和違禁使用的現(xiàn)象仍時有發(fā)生[2～6]。因此，對其加強(qiáng)監(jiān)測十分必要。

檢測對硫磷的免疫分析試劑主要包括傳統(tǒng)抗體（多克隆抗體和單克隆抗體）、重組抗體片段（單鏈抗體（Singlechain variable fragment，scFv）和抗原結(jié)合片段（Antigenbinding fragment，F(xiàn)ab））和噬菌體展示多肽[7～11]。納米抗體是來源于駱駝科動物的重鏈抗體的重鏈可變區(qū)域，是一種獨(dú)特的基因工程抗體，與傳統(tǒng)抗體相比，具有穩(wěn)定性強(qiáng)、易表達(dá)、易于基因工程操作、靈敏度高等特性[2]。目前，采用納米抗體檢測的小分子污染物主要包括毒素類（微囊藻毒素，赭曲霉毒素，黃曲霉毒素，嘔吐毒素，橘青霉素）、激素類、有機(jī)污染物及農(nóng)藥類（嘧菌酯，毒莠定）[3～18]。Pírezschirmer等[6]利用固相篩選獲得寬譜特異性的抗微囊藻毒素（Microcystins）的納米抗體（Variable domain of the H chain of heavychain antibodies，VHH）A2.3，建立的ELISA半數(shù)抑制濃度（Half maximal inhibitory concentration，IC50）為0.28 μg/L。 Liu等[9]以O(shè)TAKLH免疫羊駝，構(gòu)建了2×107 cfu/mL的納米抗體庫，采用固相親和篩選獲得抗OTA的靈敏的VHH28，其phageELISA和免疫PCR法的IC50為0.31 ng/mL和3.7 pg/L，檢測效果良好。Bever等[20]將VHH于95 ℃熱擊10和60 min后，納米抗體仍具有約65%和30%的活性，而相同條件下的多克隆抗體則失去活性。納米抗體水溶性好，不易聚集趨勢，這可能是由于骨架區(qū)FR2的疏水性氨基酸替換為親水性氨基酸（V37F或V37Y，G44E，L45R和W47G），該區(qū)域在VH通常與VL區(qū)域結(jié)合，且進(jìn)化過程中非常保守[21]。

分子模擬技術(shù)為抗體與小分子識別機(jī)制的研究提供了一條途徑，同時也為抗體的分子進(jìn)化提供了理論依據(jù)[22]。Qiu等[23]利用同源建模和分子對接技術(shù)證實(shí)VHH 28的CDR3區(qū)Thr102與抗嘔吐毒素抗體（antiDON antibody）形成氫鍵，起著關(guān)鍵的結(jié)合作用。Jiao等[24]使用分子模擬獲得結(jié)合5種Cry1毒素（Cry1Aa，Cry1Ab，Cry1B，Cry1C和Cry1E）的VHH A8 CDR3區(qū)的關(guān)鍵氨基酸，分別為第105位天冬酰胺、第106位精氨酸、第107位纈氨酸和第114位精氨酸。

目前，有關(guān)對硫磷的納米抗體尚未見報道。本研究采用對硫磷結(jié)構(gòu)類似物H1KLH抗原免疫羊駝，構(gòu)建噬菌體展示納米抗體庫，基于固相親和篩選獲得特異性識別對硫磷的納米抗體。分析了納米抗體的氨基酸序列特性，通過同源建模和分子對接方法，探討納米抗體與對硫磷分子的識別機(jī)制，為后期抗體的進(jìn)化改造和半抗原的設(shè)計提供參考。

拉氏圖可用于分析蛋白質(zhì)骨架結(jié)構(gòu)，氨基酸殘基的二面角（φ， ψ）歸屬于拉式圖的不同區(qū)域?qū)?yīng)不同的結(jié)構(gòu)，且結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性也不同[31]。拉氏圖的結(jié)果主要分成4個區(qū)域：紅色的核心區(qū)域（Most favoured regions）[A， B， L]、黃色的額外允許區(qū)（Additional allowed regions）[a， b， l， p]、淺黃色的大致允許區(qū)（Generously allowed regions）[～a， ～b， ～l， ～p]及空白的禁阻區(qū)（Disallowed regions）。VHH1模型的拉氏圖顯示（電子版文后支持信息圖S1A），氨基酸的二面角坐標(biāo)點(diǎn)100%落在有利的區(qū)域（核心區(qū)域占92.5%，額外允許區(qū)占6.6%，大致允許區(qū)占0.9%）。根據(jù)拉氏圖評分標(biāo)準(zhǔn)（>90%的氨基酸落在核心區(qū)域），認(rèn)為VHH1的模型是合理的，此模型可用于后續(xù)研究。

ERRAT指標(biāo)（電子版文后支持信息圖S1B）解釋了0.35 nm范圍內(nèi)，不同原子類型對之間形成的非鍵相互作用的數(shù)目（側(cè)鏈），理論上，得分>85分比較好，VHH1模型得分85.97，符合要求。

用Verify3D模塊（電子版文后支持信息圖S1C）對模型的三維結(jié)構(gòu)與任一氨基酸序列的兼容性進(jìn)行評分[32]，結(jié)果表明，91.06%殘基的3D1D分值≥0.2，超過合格線80%，說明模型具有較好的可靠性。