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        對硫磷納米抗體篩選及分子識別機(jī)制研究

        2019-10-09 00:00:00張玉琪張瑾如王鋒李家冬司睿呂麗珊沈玉棟王弘HAMMOCKBruceD孫遠(yuǎn)明
        分析化學(xué) 2019年9期

        張玉琪 張瑾如 王鋒 李家冬 司睿 呂麗珊 沈玉棟 王弘 HAMMOCK Bruce D 孫遠(yuǎn)明

        摘 要 :對硫磷是一種廣譜的有機(jī)磷酸酯類殺蟲、殺螨劑, 毒性極強(qiáng), 可對環(huán)境和人類健康造成嚴(yán)重危害。盡管我國已禁止使用對硫磷, 但仍存在違禁使用現(xiàn)象, 加強(qiáng)對其監(jiān)測十分必要。納米抗體是已知最小的與抗原結(jié)合的片段(15 kDa), 來源于駱駝科動物體內(nèi)重鏈抗體的可變區(qū), 具有穩(wěn)定性強(qiáng)、靈敏度高、易表達(dá)、水溶性好等特性。本研究基于噬菌體展示技術(shù)構(gòu)建了抗對硫磷納米抗體庫, 其庫容為2.41 × 107 cfu/mL, 經(jīng)抗原抗體固相親和篩選及噬菌體酶聯(lián)免疫法(Phage ELISA)鑒定, 獲得5種抗對硫磷納米抗體VHH1、VHH6、VHH13、VHH21和VHH24。以結(jié)合能力最強(qiáng)的VHH1為基礎(chǔ), 采用同源建模和分子對接技術(shù)探討VHH1與對硫磷分子的識別機(jī)制, 發(fā)現(xiàn)VHH1與對硫磷存在氫鍵和疏水間分子作用力, 關(guān)鍵氨基酸是Ser60、Lys104、Phe105、Gly106和Arg107。本研究為抗體的進(jìn)化改造和半抗原的設(shè)計提供了新思路。

        關(guān)鍵詞 :納米抗體; 對硫磷; 噬菌體展示; 分子模擬

        1 引 言

        對硫磷是一種廣泛使用的有機(jī)磷酸酯類農(nóng)藥,具有高毒性、持久性,可抑制乙酰膽堿酯酶的活性,導(dǎo)致體內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿的大量堆積,從而引起一系列的中毒反應(yīng)[1]。我國從2007年開始禁止使用對硫磷,但誤用、濫用和違禁使用的現(xiàn)象仍時有發(fā)生[2~6]。因此,對其加強(qiáng)監(jiān)測十分必要。

        檢測對硫磷的免疫分析試劑主要包括傳統(tǒng)抗體(多克隆抗體和單克隆抗體)、重組抗體片段(單鏈抗體(Singlechain variable fragment,scFv)和抗原結(jié)合片段(Antigenbinding fragment,F(xiàn)ab))和噬菌體展示多肽[7~11]。納米抗體是來源于駱駝科動物的重鏈抗體的重鏈可變區(qū)域,是一種獨(dú)特的基因工程抗體,與傳統(tǒng)抗體相比,具有穩(wěn)定性強(qiáng)、易表達(dá)、易于基因工程操作、靈敏度高等特性[2]。目前,采用納米抗體檢測的小分子污染物主要包括毒素類(微囊藻毒素,赭曲霉毒素,黃曲霉毒素,嘔吐毒素,橘青霉素)、激素類、有機(jī)污染物及農(nóng)藥類(嘧菌酯,毒莠定)[3~18]。Pírezschirmer等[6]利用固相篩選獲得寬譜特異性的抗微囊藻毒素(Microcystins)的納米抗體(Variable domain of the H chain of heavychain antibodies,VHH)A2.3,建立的ELISA半數(shù)抑制濃度(Half maximal inhibitory concentration,IC50)為0.28 μg/L。 Liu等[9]以O(shè)TAKLH免疫羊駝,構(gòu)建了2×107 cfu/mL的納米抗體庫,采用固相親和篩選獲得抗OTA的靈敏的VHH28,其phageELISA和免疫PCR法的IC50為0.31 ng/mL和3.7 pg/L,檢測效果良好。Bever等[20]將VHH于95 ℃熱擊10和60 min后,納米抗體仍具有約65%和30%的活性,而相同條件下的多克隆抗體則失去活性。納米抗體水溶性好,不易聚集趨勢,這可能是由于骨架區(qū)FR2的疏水性氨基酸替換為親水性氨基酸(V37F或V37Y,G44E,L45R和W47G),該區(qū)域在VH通常與VL區(qū)域結(jié)合,且進(jìn)化過程中非常保守[21]。

        分子模擬技術(shù)為抗體與小分子識別機(jī)制的研究提供了一條途徑,同時也為抗體的分子進(jìn)化提供了理論依據(jù)[22]。Qiu等[23]利用同源建模和分子對接技術(shù)證實(shí)VHH 28的CDR3區(qū)Thr102與抗嘔吐毒素抗體(antiDON antibody)形成氫鍵,起著關(guān)鍵的結(jié)合作用。Jiao等[24]使用分子模擬獲得結(jié)合5種Cry1毒素(Cry1Aa,Cry1Ab,Cry1B,Cry1C和Cry1E)的VHH A8 CDR3區(qū)的關(guān)鍵氨基酸,分別為第105位天冬酰胺、第106位精氨酸、第107位纈氨酸和第114位精氨酸。

        目前,有關(guān)對硫磷的納米抗體尚未見報道。本研究采用對硫磷結(jié)構(gòu)類似物H1KLH抗原免疫羊駝,構(gòu)建噬菌體展示納米抗體庫,基于固相親和篩選獲得特異性識別對硫磷的納米抗體。分析了納米抗體的氨基酸序列特性,通過同源建模和分子對接方法,探討納米抗體與對硫磷分子的識別機(jī)制,為后期抗體的進(jìn)化改造和半抗原的設(shè)計提供參考。

        拉氏圖可用于分析蛋白質(zhì)骨架結(jié)構(gòu),氨基酸殘基的二面角(φ, ψ)歸屬于拉式圖的不同區(qū)域?qū)?yīng)不同的結(jié)構(gòu),且結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性也不同[31]。拉氏圖的結(jié)果主要分成4個區(qū)域:紅色的核心區(qū)域(Most favoured regions)[A, B, L]、黃色的額外允許區(qū)(Additional allowed regions)[a, b, l, p]、淺黃色的大致允許區(qū)(Generously allowed regions)[~a, ~b, ~l, ~p]及空白的禁阻區(qū)(Disallowed regions)。VHH1模型的拉氏圖顯示(電子版文后支持信息圖S1A),氨基酸的二面角坐標(biāo)點(diǎn)100%落在有利的區(qū)域(核心區(qū)域占92.5%,額外允許區(qū)占6.6%,大致允許區(qū)占0.9%)。根據(jù)拉氏圖評分標(biāo)準(zhǔn)(>90%的氨基酸落在核心區(qū)域),認(rèn)為VHH1的模型是合理的,此模型可用于后續(xù)研究。

        ERRAT指標(biāo)(電子版文后支持信息圖S1B)解釋了0.35 nm范圍內(nèi),不同原子類型對之間形成的非鍵相互作用的數(shù)目(側(cè)鏈),理論上,得分>85分比較好,VHH1模型得分85.97,符合要求。

        用Verify3D模塊(電子版文后支持信息圖S1C)對模型的三維結(jié)構(gòu)與任一氨基酸序列的兼容性進(jìn)行評分[32],結(jié)果表明,91.06%殘基的3D1D分值≥0.2,超過合格線80%,說明模型具有較好的可靠性。

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