齊 飛，周 斌，韓旭凌，李鵬程，武舫伊，錢 峰

(1.復(fù)旦大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，上海 200438； 2.復(fù)旦大學(xué) 現(xiàn)代人類學(xué)教育部重點實驗室，上海 200438)

病毒感染所誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答由宿主和病原體之間的特異性信號傳導(dǎo)級聯(lián)形成.宿主細(xì)胞配備有多種模式識別受體(Pattern-Recognition Receptors, PRR)，以識別病原體相關(guān)分子模式.病毒相關(guān)分子模式通常以核酸為基礎(chǔ)，包括雙鏈(ds)RNA，單鏈(ss)RNA和病毒DNA[1].RIG-Ⅰ樣受體(RIG-Ⅰ Like Receptor, RLR)是PRR中關(guān)鍵的成員[2]，包括視黃酸誘導(dǎo)基因Ⅰ(Retinoic acid-Inducible Gene Ⅰ, RIG-Ⅰ)和黑素瘤分化相關(guān)蛋白5(Melanoma Differentiation-Associated protein 5, MDA5).RIG-Ⅰ識別ssRNA病毒，而MDA5主要負(fù)責(zé)識別微核糖核酸病毒家族成員[3-5]，通過下游信號分子激活免疫應(yīng)答.

病毒感染細(xì)胞會激活細(xì)胞免疫反應(yīng)產(chǎn)生Ⅰ型干擾素(Interferon, IFN).大多數(shù)有核細(xì)胞具有產(chǎn)生和響應(yīng)Ⅰ型干擾素的能力[6].Ⅰ型干擾素以非常低的水平組成型表達(dá)，受病毒感染誘導(dǎo)至高水平[7].RIG-Ⅰ和MDA5檢測細(xì)胞質(zhì)中的RNA結(jié)構(gòu)，激活下游信號通路，導(dǎo)致干擾素調(diào)節(jié)因子3(Interferon Regulatory Factor 3, IRF3)磷酸化入核，磷酸化的轉(zhuǎn)錄因子IRF3與IFN基因特定啟動子元件結(jié)合激活轉(zhuǎn)錄.釋放到胞外的干擾素進(jìn)一步與細(xì)胞膜表面受體結(jié)合啟動更多的干擾素和干擾素誘導(dǎo)基因的表達(dá)，發(fā)揮抗病毒效應(yīng)[8-10].

核呼吸因子(Nuclear Respiratory Factor 1, NRF1)是由核基因編碼的能調(diào)控線粒體呼吸鏈表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子.人的NRF1基因與海膽和果蠅翅膀中的P3A2基因同源[11].基因位于染色體7q32.2，編碼出大小為68 kDa的核蛋白[12].NRF1激活線粒體呼吸鏈蛋白組份的表達(dá)，調(diào)節(jié)線粒體運輸?shù)鞍缀途€粒體氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白，參與雌激素介導(dǎo)的線粒體生物合成和細(xì)胞代謝[13].NRF1與乳腺癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)[14]，其動態(tài)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)與癌癥風(fēng)險的預(yù)測、療效預(yù)判密切相關(guān)[15].NRF1還參與調(diào)控端粒的轉(zhuǎn)錄，影響人體健康[16].

NRF1在免疫應(yīng)答領(lǐng)域尚未被研究.文獻(xiàn)報道NRF1在流感疫苗接種的免疫應(yīng)答人群中活性增強(qiáng)[17]，暗示NRF1參與了機(jī)體的免疫反應(yīng).本研究發(fā)現(xiàn)了NRF1在抗病毒天然免疫領(lǐng)域的新功能.實驗發(fā)現(xiàn)NRF1參與細(xì)胞抗病毒免疫反應(yīng)，調(diào)節(jié)了干擾素的產(chǎn)生.

1 材料與方法

1.1 材料

HEK293T細(xì)胞為本實驗室保存；TRI Reagent試劑購自Sigma公司；實時定量PCR試劑購自Biomake公司；RIPA蛋白裂解液購自碧云天；NRF1和GAPDH抗體購自Proteintech公司；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自全式金公司；轉(zhuǎn)染試劑購自翊圣生物公司；Protein A/G agarose beads購自Santa Cruz公司.

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與熒光成像

HEK293T細(xì)胞培養(yǎng)于10%FBS和1%的青霉素-鏈霉素雙抗DMEM培養(yǎng)基，于37℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng).細(xì)胞感染VSV-GFP病毒(MOI=0.01)8h后，LEICA DFC310 FX熒光顯微鏡成像.

1.3 慢病毒感染建立敲低細(xì)胞系

慢病毒包裝時，取生長狀態(tài)良好的HEK293T細(xì)胞，鋪于六孔板細(xì)胞培養(yǎng)皿中，利用轉(zhuǎn)染試劑共轉(zhuǎn)shRNA的慢病毒載體質(zhì)粒、psPAX2(病毒包裝質(zhì)粒)和pMD2.G(病毒衣殼質(zhì)粒)，12h后換液，48h后收集病毒上清，4000r/min離心10min，取上清感染生長狀態(tài)良好的HEK293T細(xì)胞，感染24h后傳代并用含有2μg/mL的嘌呤霉素培養(yǎng)基篩選.

表1 shRNA引物設(shè)計

1.4 Western blot

細(xì)胞棄去培養(yǎng)基，用PBS(137mmol/L NaCl，2.7mmol/L KCl，10mmol/L Na2HPO4，2mmol/L KH2PO4)洗干凈后，加入RIPA裂解液將細(xì)胞重懸置于冰上裂解25min，4℃離心10min后取上清，加入相應(yīng)量蛋白上樣緩沖液，煮沸5min，取適量進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電泳結(jié)束后300mA恒流轉(zhuǎn)膜90min至PVDF膜，5%BSA封閉1h，TBST洗3次(每次5min)，加入一抗(1∶1000，5%BSA稀釋)4℃孵育過夜，TBST洗3次，再加相應(yīng)二抗(1∶1000，5%BSA稀釋)室溫孵育1h，加入顯色液拍照.

1.5 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?/h3>

將細(xì)胞接種于24孔板中，待細(xì)胞密度達(dá)到80%，進(jìn)行轉(zhuǎn)染實驗；每孔內(nèi)加入50ng海參熒光素酶報告質(zhì)粒、50ng的螢火蟲熒光素酶報告基因質(zhì)粒和適量的目的基因質(zhì)粒，對照組用空載體配平，16h后用雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒檢測.用吸引泵吸去上清，加入裂解液，置于常溫?fù)u床裂解15min，吹打混勻裂解產(chǎn)物，將樣品吸至96孔酶標(biāo)板中，分別依次加入試劑盒中的底物，上機(jī)檢測.

1.6 RNA抽提

細(xì)胞棄去培養(yǎng)基后使用PBS將培養(yǎng)基洗干凈，加入TRI Reagent裂解，充分震蕩打勻后，加入三氯甲烷震蕩，4℃離心取上清，加入等量異丙醇充分混勻后15000r/min離心10min，沉淀用75%乙醇洗滌，離心，棄上清，晾干，加入適量DEPC處理的水溶解，保存于-80℃冰箱.

表2 qPCR引物設(shè)計

1.7 實時熒光定量PCR

RNA通過反轉(zhuǎn)錄試劑盒去基因組和反轉(zhuǎn)錄步驟獲得cDNA.在CFX-96系統(tǒng)(Bio-Rad)中使用SYBR Green和基因特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增，Actin基因作為內(nèi)參.定量PCR引物根據(jù)表2序列合成.

1.8 免疫共沉淀實驗

實驗前將Protein A/G agarose beads用NETN(100mmol/L NaCl，20mmol/L Tris-Cl(pH 8.0)，0.5mmol/L EDTA，0.5%P-40)清洗5次；細(xì)胞用PBS清洗后，置于冰上加入NETN裂解液充分裂解；4℃，15000r/min離心10min，收取上清，取少量做全細(xì)胞裂解液，剩余上清用適量Protein A/G Agarose Beads，4℃孵育過夜封閉，封閉后4℃ 1000g/min離心5min；沉淀用NETN清洗5次，加入適量的蛋白上樣緩沖液，煮沸5min，-80℃冰箱凍存，上清加入相應(yīng)抗體4℃搖床孵育2h；加入適量Protein A/G agarose Beads，孵育1h，棄上清，NETN清洗5次，加入適量的蛋白上樣緩沖液，煮沸5min，-80℃冰箱凍存.

1.9 統(tǒng)計分析

研究中數(shù)值用“均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，實驗均重復(fù)3次以上，組間通過GraphPad Prism 6軟件的t-檢驗進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析.

2 結(jié) 果

2.1 NRF1參與細(xì)胞抗病毒反應(yīng)

為了研究NRF1在病毒感染下的表達(dá)情況，通過水皰性口炎病毒(VSV)感染HEK293T細(xì)胞.結(jié)果顯示NRF1的蛋白表達(dá)水平隨病毒感染上升(圖1(a)).表明NRF1可能受病毒誘導(dǎo)表達(dá)，并參與到抗病毒天然免疫應(yīng)答.

為了探索NRF1在細(xì)胞抗病毒反應(yīng)中的潛在作用，構(gòu)建NRF1敲低的HEK293T細(xì)胞系.內(nèi)源性的NRF1蛋白的敲低水平通過Western blot的方法進(jìn)行檢測(圖1(b))所示.利用NRF1敲低HEK293T細(xì)胞系進(jìn)行病毒復(fù)制實驗，用帶有GFP熒光的VSV病毒感染8h.結(jié)果表明NRF1敲低組相比較于對照組，熒光強(qiáng)度明顯減弱，說明在敲低NRF1的細(xì)胞中病毒復(fù)制能力減弱(圖1(c))所示.同時利用qPCR的方法進(jìn)行VSV RNA定量檢測，發(fā)現(xiàn)病毒的復(fù)制量在NRF1敲低的細(xì)胞中明顯少于對照組(圖1(d))所示.以上結(jié)果表明，NRF1參與細(xì)胞的抗病毒反應(yīng).

圖1 NRF1參與細(xì)胞抗病毒反應(yīng)Fig.1 NRF1 is involved in cellular antiviral response(a) VSV(MOI=0.1)病毒刺激0h，2h，8h，12h，Western blot檢測NRF1蛋白水平變化；(b) Western blot檢測NRF1敲低細(xì)胞系中NRF1的蛋白表達(dá)量；(c) VSV-GFP(MOI=0.01)感染正常組和NRF1敲低組細(xì)胞，8h后熒光顯微鏡拍攝(標(biāo)尺: 200μm)；(d) qPCR檢測VSV RNA水平.**P<0.01，***P<0.001.

2.2 NRF1抑制病毒誘導(dǎo)的細(xì)胞因子和趨化因子的產(chǎn)生

通過在HEK293T細(xì)胞中過表達(dá)NRF1研究其對病毒誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答的影響.Western blot檢測NRF1-Flag質(zhì)粒的表達(dá)(圖2(a)，@@@470頁）.用VSV病毒感染過表達(dá)NRF1的HEK293T細(xì)胞，qPCR檢測誘導(dǎo)產(chǎn)生的細(xì)胞因子IFN-βRNA和趨化因子CCL5RNA的表達(dá)水平.結(jié)果顯示過表達(dá)NRF1后細(xì)胞受病毒刺激所產(chǎn)生的IFN-βRNA和CCL5RNA顯著下降(圖2(b)).表明NRF1抑制病毒誘導(dǎo)的細(xì)胞因子和趨化因子的產(chǎn)生.

圖2 NRF1抑制病毒誘導(dǎo)的細(xì)胞因子和趨化因子的產(chǎn)生Fig.2 NRF1 inhibits virus-induced production of cytokines and chemokines(a) Western blot實驗檢測NRF1過表達(dá)質(zhì)粒表達(dá)情況；(b) 將NRF1過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入HEK293T細(xì)胞中16h后，用VSV病毒(MOI=0.1)刺激12h，qPCR檢測細(xì)胞因子IFN-β RNA和趨化因子CCL5 RNA的表達(dá)變化.*P<0.05.

2.3 NRF1抑制SeV誘導(dǎo)的干擾素信號激活

已知仙臺病毒(SeV)能被RIG-Ⅰ識別，而RIG-Ⅰ介導(dǎo)的RLR抗病毒信號通路是關(guān)鍵的抗病毒天然免疫信號通路.為了驗證NRF1是否對RLR信號通路有影響，通過雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灧謩e對RLR通路相關(guān)下游靶基因的啟動子(IFN-β-luc、ISRE-luc和NF-κB-luc)活性進(jìn)行檢測.在HEK293T細(xì)胞中過表達(dá)NRF1，同時分別轉(zhuǎn)入IFN-β-luc、ISRE-luc和NF-κB-luc報告基因質(zhì)粒，16h后，用SeV病毒刺激12h，裂解細(xì)胞加入試劑盒底物通過雙熒光素酶檢測儀檢測.結(jié)果發(fā)現(xiàn)病毒誘導(dǎo)的IFN-β-luc、ISRE-luc和NF-κB-luc活性都隨著NRF1表達(dá)量的增加而降低(圖3)，說明NRF1抑制SeV誘導(dǎo)的干擾素信號激活.

圖3 NRF1抑制SeV誘導(dǎo)的干擾素信號激活Fig.3 NRF1 inhibits SeV-induced interferon signaling activationNRF1抑制SeV誘導(dǎo)的RLR信號通路下游靶基因啟動子(a) IFN-β-luc, (b) ISRE-luc, (c) NF-κB-luc的激活.在HEK293T細(xì)胞中共轉(zhuǎn)NRF1(100～200ng)、pRL-TK(50ng)和如圖所示啟動子報告基因質(zhì)粒(50ng)，16h后，用SeV病毒(MOI=1)刺激12h，收集樣品上機(jī)檢測，所有實驗均用空載質(zhì)粒配平.

2.4 NRF1抑制RLR信號通路的激活

在RLR信號通路中，RIG-Ⅰ首先識別病毒的RNA，招募下游位于線粒體外膜的接頭蛋白MAVS，MAVS接受信號后多聚化將信號傳遞給下游激酶TBK1，TBK1和IKKε形成復(fù)合物磷酸化轉(zhuǎn)錄因子IRF3，磷酸化激活的IRF3入核結(jié)合到IFN-β特定的結(jié)構(gòu)域，啟動IFN-β的表達(dá)，發(fā)揮抗病毒天然免疫功能.

為了探究NRF1在RLR信號通路中作用的靶點.在HEK293T細(xì)胞系中分別過表達(dá)RLR信號通路中關(guān)鍵分子RIG-Ⅰ、MAVS、TBK1、IKKε和IRF3，激活RLR信號通路.同時過表達(dá)NRF1檢測其對該信號通路的影響.結(jié)果如圖4所示，顯示NRF1抑制IRF3或其上游信號分子所介導(dǎo)的IFN-β報告基因的激活.表明IRF3是NRF1在RLR信號通路中潛在的作用靶點.

圖4 NRF1抑制RLR信號通路的激活Fig.4 NRF1 inhibits activation of the RLR signaling pathwayNRF1抑制RLR信號通路中關(guān)鍵分子(a) RIG-Ⅰ，(b) MAVS，(c) TBK1，(d) IKKε和(e) IRF3所介導(dǎo)的IFN-β報告基因的激活.在HEK293T細(xì)胞中共轉(zhuǎn)NRF1(100～200ng)、IFN-β-luc(50ng)、pRL-TK(50ng)和如圖所示關(guān)鍵分子質(zhì)粒，16h后檢測IFN-β-luc的活性，所有實驗均用空載質(zhì)粒配平.

2.5 NRF1與轉(zhuǎn)錄因子IRF3的相互作用

圖5 NRF1與轉(zhuǎn)錄因子IRF3的相互作用Fig.5 Interaction between NRF1 and transcription factor IRF3在HEK293T細(xì)胞中共轉(zhuǎn)NRF1-Flag和IRF3-HA，16h后收樣，通過免疫共沉淀實驗檢測二者的相互作用.

雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灡砻鱊RF1潛在的作用靶點是IRF3.通過免疫共沉淀的實驗方法，將帶有Flag標(biāo)簽的NRF1質(zhì)粒與帶有HA標(biāo)簽的IRF3質(zhì)粒共轉(zhuǎn)入HEK293T細(xì)胞中，16h后收取樣品，進(jìn)行免疫共沉淀實驗.結(jié)果發(fā)現(xiàn)NRF1與IRF3存在相互作用.該實驗結(jié)果表明NRF1可能通過與IRF3互作來抑制RLR信號通路的激活.

3 討 論

NRF1蛋白可以通過同源二聚的形式結(jié)合到特定的DNA識別序列來調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄[12].研究人員發(fā)現(xiàn)NRF1在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤衍生的細(xì)胞中調(diào)控691個基因轉(zhuǎn)錄，這些基因參與調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、代謝能量產(chǎn)生、蛋白質(zhì)翻譯和DNA復(fù)制/修復(fù)[18-19].此外，NRF1調(diào)節(jié)線粒體相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，特別是調(diào)控線粒體氧化呼吸鏈中重要基因的表達(dá).

本研究首次揭示NRF1參與抗病毒天然免疫.通過病毒感染實驗發(fā)現(xiàn)NRF1受病毒誘導(dǎo)上調(diào).在細(xì)胞中敲低NRF1，用帶GFP熒光的VSV進(jìn)行感染，結(jié)果發(fā)現(xiàn)敲低組細(xì)胞病毒載量變少.過表達(dá)NRF1抑制病毒誘導(dǎo)的細(xì)胞因子和趨化因子的產(chǎn)生.這些結(jié)果表明NRF1在機(jī)體免疫系統(tǒng)中扮演著至關(guān)重要的角色.

在RLR信號通路中，RIG-Ⅰ識別病毒的RNA后，招募接頭蛋白MAVS，接受信號的MAVS多聚化，繼續(xù)將信號傳遞給下游激酶TBK1，TBK1和IKKε形成復(fù)合物磷酸化轉(zhuǎn)錄因子IRF3，磷酸化激活的IRF3入核結(jié)合到IFN-β特定的結(jié)構(gòu)域，啟動IFN-β的表達(dá)，發(fā)揮抗病毒天然免疫功能.通過過表達(dá)NRF1抑制了IRF3或其上游信號分子介導(dǎo)的干擾素的激活.利用免疫共沉淀的方法發(fā)現(xiàn)NRF1與IRF3存在相互作用.結(jié)果表明NRF1是通過RLR信號通路下游的轉(zhuǎn)錄因子IRF3來發(fā)揮其抑制功能.NRF1可能通過影響NRF1影響IRF3與IFN-β啟動子的結(jié)合抑制其轉(zhuǎn)錄活性.

天然免疫反應(yīng)受到細(xì)胞內(nèi)信號分子的精確調(diào)控，過強(qiáng)的免疫反應(yīng)會誘導(dǎo)細(xì)胞因子風(fēng)暴，對機(jī)體造成免疫病理損傷.本研究表明NRF1是作為RLR信號通路的抑制因子，它的作用可能是為了控制免疫過激.對于防止機(jī)體免疫病理損傷具有重要作用.