亚洲免费av电影一区二区三区,日韩爱爱视频,51精品视频一区二区三区,91视频爱爱,日韩欧美在线播放视频,中文字幕少妇AV,亚洲电影中文字幕,久久久久亚洲av成人网址,久久综合视频网站,国产在线不卡免费播放

        ?

        NRF1抑制RNA病毒誘導(dǎo)的抗病毒天然免疫反應(yīng)

        2019-10-09 01:55:58韓旭凌李鵬程武舫伊
        關(guān)鍵詞:干擾素抗病毒質(zhì)粒

        齊 飛,周 斌,韓旭凌,李鵬程,武舫伊,錢 峰

        (1.復(fù)旦大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,上海 200438; 2.復(fù)旦大學(xué) 現(xiàn)代人類學(xué)教育部重點實驗室,上海 200438)

        病毒感染所誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答由宿主和病原體之間的特異性信號傳導(dǎo)級聯(lián)形成.宿主細(xì)胞配備有多種模式識別受體(Pattern-Recognition Receptors, PRR),以識別病原體相關(guān)分子模式.病毒相關(guān)分子模式通常以核酸為基礎(chǔ),包括雙鏈(ds)RNA,單鏈(ss)RNA和病毒DNA[1].RIG-Ⅰ樣受體(RIG-Ⅰ Like Receptor, RLR)是PRR中關(guān)鍵的成員[2],包括視黃酸誘導(dǎo)基因Ⅰ(Retinoic acid-Inducible Gene Ⅰ, RIG-Ⅰ)和黑素瘤分化相關(guān)蛋白5(Melanoma Differentiation-Associated protein 5, MDA5).RIG-Ⅰ識別ssRNA病毒,而MDA5主要負(fù)責(zé)識別微核糖核酸病毒家族成員[3-5],通過下游信號分子激活免疫應(yīng)答.

        病毒感染細(xì)胞會激活細(xì)胞免疫反應(yīng)產(chǎn)生Ⅰ型干擾素(Interferon, IFN).大多數(shù)有核細(xì)胞具有產(chǎn)生和響應(yīng)Ⅰ型干擾素的能力[6].Ⅰ型干擾素以非常低的水平組成型表達(dá),受病毒感染誘導(dǎo)至高水平[7].RIG-Ⅰ和MDA5檢測細(xì)胞質(zhì)中的RNA結(jié)構(gòu),激活下游信號通路,導(dǎo)致干擾素調(diào)節(jié)因子3(Interferon Regulatory Factor 3, IRF3)磷酸化入核,磷酸化的轉(zhuǎn)錄因子IRF3與IFN基因特定啟動子元件結(jié)合激活轉(zhuǎn)錄.釋放到胞外的干擾素進(jìn)一步與細(xì)胞膜表面受體結(jié)合啟動更多的干擾素和干擾素誘導(dǎo)基因的表達(dá),發(fā)揮抗病毒效應(yīng)[8-10].

        核呼吸因子(Nuclear Respiratory Factor 1, NRF1)是由核基因編碼的能調(diào)控線粒體呼吸鏈表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子.人的NRF1基因與海膽和果蠅翅膀中的P3A2基因同源[11].基因位于染色體7q32.2,編碼出大小為68 kDa的核蛋白[12].NRF1激活線粒體呼吸鏈蛋白組份的表達(dá),調(diào)節(jié)線粒體運輸?shù)鞍缀途€粒體氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白,參與雌激素介導(dǎo)的線粒體生物合成和細(xì)胞代謝[13].NRF1與乳腺癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)[14],其動態(tài)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)與癌癥風(fēng)險的預(yù)測、療效預(yù)判密切相關(guān)[15].NRF1還參與調(diào)控端粒的轉(zhuǎn)錄,影響人體健康[16].

        NRF1在免疫應(yīng)答領(lǐng)域尚未被研究.文獻(xiàn)報道NRF1在流感疫苗接種的免疫應(yīng)答人群中活性增強(qiáng)[17],暗示NRF1參與了機(jī)體的免疫反應(yīng).本研究發(fā)現(xiàn)了NRF1在抗病毒天然免疫領(lǐng)域的新功能.實驗發(fā)現(xiàn)NRF1參與細(xì)胞抗病毒免疫反應(yīng),調(diào)節(jié)了干擾素的產(chǎn)生.

        1 材料與方法

        1.1 材料

        HEK293T細(xì)胞為本實驗室保存;TRI Reagent試劑購自Sigma公司;實時定量PCR試劑購自Biomake公司;RIPA蛋白裂解液購自碧云天;NRF1和GAPDH抗體購自Proteintech公司;雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自全式金公司;轉(zhuǎn)染試劑購自翊圣生物公司;Protein A/G agarose beads購自Santa Cruz公司.

        1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與熒光成像

        HEK293T細(xì)胞培養(yǎng)于10%FBS和1%的青霉素-鏈霉素雙抗DMEM培養(yǎng)基,于37℃,5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng).細(xì)胞感染VSV-GFP病毒(MOI=0.01)8h后,LEICA DFC310 FX熒光顯微鏡成像.

        1.3 慢病毒感染建立敲低細(xì)胞系

        慢病毒包裝時,取生長狀態(tài)良好的HEK293T細(xì)胞,鋪于六孔板細(xì)胞培養(yǎng)皿中,利用轉(zhuǎn)染試劑共轉(zhuǎn)shRNA的慢病毒載體質(zhì)粒、psPAX2(病毒包裝質(zhì)粒)和pMD2.G(病毒衣殼質(zhì)粒),12h后換液,48h后收集病毒上清,4000r/min離心10min,取上清感染生長狀態(tài)良好的HEK293T細(xì)胞,感染24h后傳代并用含有2μg/mL的嘌呤霉素培養(yǎng)基篩選.

        表1 shRNA引物設(shè)計

        1.4 Western blot

        細(xì)胞棄去培養(yǎng)基,用PBS(137mmol/L NaCl,2.7mmol/L KCl,10mmol/L Na2HPO4,2mmol/L KH2PO4)洗干凈后,加入RIPA裂解液將細(xì)胞重懸置于冰上裂解25min,4℃離心10min后取上清,加入相應(yīng)量蛋白上樣緩沖液,煮沸5min,取適量進(jìn)行SDS-PAGE電泳,電泳結(jié)束后300mA恒流轉(zhuǎn)膜90min至PVDF膜,5%BSA封閉1h,TBST洗3次(每次5min),加入一抗(1∶1000,5%BSA稀釋)4℃孵育過夜,TBST洗3次,再加相應(yīng)二抗(1∶1000,5%BSA稀釋)室溫孵育1h,加入顯色液拍照.

        1.5 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?/h3>

        將細(xì)胞接種于24孔板中,待細(xì)胞密度達(dá)到80%,進(jìn)行轉(zhuǎn)染實驗;每孔內(nèi)加入50ng海參熒光素酶報告質(zhì)粒、50ng的螢火蟲熒光素酶報告基因質(zhì)粒和適量的目的基因質(zhì)粒,對照組用空載體配平,16h后用雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒檢測.用吸引泵吸去上清,加入裂解液,置于常溫?fù)u床裂解15min,吹打混勻裂解產(chǎn)物,將樣品吸至96孔酶標(biāo)板中,分別依次加入試劑盒中的底物,上機(jī)檢測.

        1.6 RNA抽提

        細(xì)胞棄去培養(yǎng)基后使用PBS將培養(yǎng)基洗干凈,加入TRI Reagent裂解,充分震蕩打勻后,加入三氯甲烷震蕩,4℃離心取上清,加入等量異丙醇充分混勻后15000r/min離心10min,沉淀用75%乙醇洗滌,離心,棄上清,晾干,加入適量DEPC處理的水溶解,保存于-80℃冰箱.

        表2 qPCR引物設(shè)計

        1.7 實時熒光定量PCR

        RNA通過反轉(zhuǎn)錄試劑盒去基因組和反轉(zhuǎn)錄步驟獲得cDNA.在CFX-96系統(tǒng)(Bio-Rad)中使用SYBR Green和基因特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增,Actin基因作為內(nèi)參.定量PCR引物根據(jù)表2序列合成.

        1.8 免疫共沉淀實驗

        實驗前將Protein A/G agarose beads用NETN(100mmol/L NaCl,20mmol/L Tris-Cl(pH 8.0),0.5mmol/L EDTA,0.5%P-40)清洗5次;細(xì)胞用PBS清洗后,置于冰上加入NETN裂解液充分裂解;4℃,15000r/min離心10min,收取上清,取少量做全細(xì)胞裂解液,剩余上清用適量Protein A/G Agarose Beads,4℃孵育過夜封閉,封閉后4℃ 1000g/min離心5min;沉淀用NETN清洗5次,加入適量的蛋白上樣緩沖液,煮沸5min,-80℃冰箱凍存,上清加入相應(yīng)抗體4℃搖床孵育2h;加入適量Protein A/G agarose Beads,孵育1h,棄上清,NETN清洗5次,加入適量的蛋白上樣緩沖液,煮沸5min,-80℃冰箱凍存.

        1.9 統(tǒng)計分析

        研究中數(shù)值用“均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示,實驗均重復(fù)3次以上,組間通過GraphPad Prism 6軟件的t-檢驗進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析.

        2 結(jié) 果

        2.1 NRF1參與細(xì)胞抗病毒反應(yīng)

        為了研究NRF1在病毒感染下的表達(dá)情況,通過水皰性口炎病毒(VSV)感染HEK293T細(xì)胞.結(jié)果顯示NRF1的蛋白表達(dá)水平隨病毒感染上升(圖1(a)).表明NRF1可能受病毒誘導(dǎo)表達(dá),并參與到抗病毒天然免疫應(yīng)答.

        為了探索NRF1在細(xì)胞抗病毒反應(yīng)中的潛在作用,構(gòu)建NRF1敲低的HEK293T細(xì)胞系.內(nèi)源性的NRF1蛋白的敲低水平通過Western blot的方法進(jìn)行檢測(圖1(b))所示.利用NRF1敲低HEK293T細(xì)胞系進(jìn)行病毒復(fù)制實驗,用帶有GFP熒光的VSV病毒感染8h.結(jié)果表明NRF1敲低組相比較于對照組,熒光強(qiáng)度明顯減弱,說明在敲低NRF1的細(xì)胞中病毒復(fù)制能力減弱(圖1(c))所示.同時利用qPCR的方法進(jìn)行VSV RNA定量檢測,發(fā)現(xiàn)病毒的復(fù)制量在NRF1敲低的細(xì)胞中明顯少于對照組(圖1(d))所示.以上結(jié)果表明,NRF1參與細(xì)胞的抗病毒反應(yīng).

        圖1 NRF1參與細(xì)胞抗病毒反應(yīng)Fig.1 NRF1 is involved in cellular antiviral response(a) VSV(MOI=0.1)病毒刺激0h,2h,8h,12h,Western blot檢測NRF1蛋白水平變化;(b) Western blot檢測NRF1敲低細(xì)胞系中NRF1的蛋白表達(dá)量;(c) VSV-GFP(MOI=0.01)感染正常組和NRF1敲低組細(xì)胞,8h后熒光顯微鏡拍攝(標(biāo)尺: 200μm);(d) qPCR檢測VSV RNA水平.**P<0.01,***P<0.001.

        2.2 NRF1抑制病毒誘導(dǎo)的細(xì)胞因子和趨化因子的產(chǎn)生

        通過在HEK293T細(xì)胞中過表達(dá)NRF1研究其對病毒誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答的影響.Western blot檢測NRF1-Flag質(zhì)粒的表達(dá)(圖2(a),@@@470頁).用VSV病毒感染過表達(dá)NRF1的HEK293T細(xì)胞,qPCR檢測誘導(dǎo)產(chǎn)生的細(xì)胞因子IFN-βRNA和趨化因子CCL5RNA的表達(dá)水平.結(jié)果顯示過表達(dá)NRF1后細(xì)胞受病毒刺激所產(chǎn)生的IFN-βRNA和CCL5RNA顯著下降(圖2(b)).表明NRF1抑制病毒誘導(dǎo)的細(xì)胞因子和趨化因子的產(chǎn)生.

        圖2 NRF1抑制病毒誘導(dǎo)的細(xì)胞因子和趨化因子的產(chǎn)生Fig.2 NRF1 inhibits virus-induced production of cytokines and chemokines(a) Western blot實驗檢測NRF1過表達(dá)質(zhì)粒表達(dá)情況;(b) 將NRF1過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入HEK293T細(xì)胞中16h后,用VSV病毒(MOI=0.1)刺激12h,qPCR檢測細(xì)胞因子IFN-β RNA和趨化因子CCL5 RNA的表達(dá)變化.*P<0.05.

        2.3 NRF1抑制SeV誘導(dǎo)的干擾素信號激活

        已知仙臺病毒(SeV)能被RIG-Ⅰ識別,而RIG-Ⅰ介導(dǎo)的RLR抗病毒信號通路是關(guān)鍵的抗病毒天然免疫信號通路.為了驗證NRF1是否對RLR信號通路有影響,通過雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灧謩e對RLR通路相關(guān)下游靶基因的啟動子(IFN-β-luc、ISRE-luc和NF-κB-luc)活性進(jìn)行檢測.在HEK293T細(xì)胞中過表達(dá)NRF1,同時分別轉(zhuǎn)入IFN-β-luc、ISRE-luc和NF-κB-luc報告基因質(zhì)粒,16h后,用SeV病毒刺激12h,裂解細(xì)胞加入試劑盒底物通過雙熒光素酶檢測儀檢測.結(jié)果發(fā)現(xiàn)病毒誘導(dǎo)的IFN-β-luc、ISRE-luc和NF-κB-luc活性都隨著NRF1表達(dá)量的增加而降低(圖3),說明NRF1抑制SeV誘導(dǎo)的干擾素信號激活.

        圖3 NRF1抑制SeV誘導(dǎo)的干擾素信號激活Fig.3 NRF1 inhibits SeV-induced interferon signaling activationNRF1抑制SeV誘導(dǎo)的RLR信號通路下游靶基因啟動子(a) IFN-β-luc, (b) ISRE-luc, (c) NF-κB-luc的激活.在HEK293T細(xì)胞中共轉(zhuǎn)NRF1(100~200ng)、pRL-TK(50ng)和如圖所示啟動子報告基因質(zhì)粒(50ng),16h后,用SeV病毒(MOI=1)刺激12h,收集樣品上機(jī)檢測,所有實驗均用空載質(zhì)粒配平.

        2.4 NRF1抑制RLR信號通路的激活

        在RLR信號通路中,RIG-Ⅰ首先識別病毒的RNA,招募下游位于線粒體外膜的接頭蛋白MAVS,MAVS接受信號后多聚化將信號傳遞給下游激酶TBK1,TBK1和IKKε形成復(fù)合物磷酸化轉(zhuǎn)錄因子IRF3,磷酸化激活的IRF3入核結(jié)合到IFN-β特定的結(jié)構(gòu)域,啟動IFN-β的表達(dá),發(fā)揮抗病毒天然免疫功能.

        為了探究NRF1在RLR信號通路中作用的靶點.在HEK293T細(xì)胞系中分別過表達(dá)RLR信號通路中關(guān)鍵分子RIG-Ⅰ、MAVS、TBK1、IKKε和IRF3,激活RLR信號通路.同時過表達(dá)NRF1檢測其對該信號通路的影響.結(jié)果如圖4所示,顯示NRF1抑制IRF3或其上游信號分子所介導(dǎo)的IFN-β報告基因的激活.表明IRF3是NRF1在RLR信號通路中潛在的作用靶點.

        圖4 NRF1抑制RLR信號通路的激活Fig.4 NRF1 inhibits activation of the RLR signaling pathwayNRF1抑制RLR信號通路中關(guān)鍵分子(a) RIG-Ⅰ,(b) MAVS,(c) TBK1,(d) IKKε和(e) IRF3所介導(dǎo)的IFN-β報告基因的激活.在HEK293T細(xì)胞中共轉(zhuǎn)NRF1(100~200ng)、IFN-β-luc(50ng)、pRL-TK(50ng)和如圖所示關(guān)鍵分子質(zhì)粒,16h后檢測IFN-β-luc的活性,所有實驗均用空載質(zhì)粒配平.

        2.5 NRF1與轉(zhuǎn)錄因子IRF3的相互作用

        圖5 NRF1與轉(zhuǎn)錄因子IRF3的相互作用Fig.5 Interaction between NRF1 and transcription factor IRF3在HEK293T細(xì)胞中共轉(zhuǎn)NRF1-Flag和IRF3-HA,16h后收樣,通過免疫共沉淀實驗檢測二者的相互作用.

        雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灡砻鱊RF1潛在的作用靶點是IRF3.通過免疫共沉淀的實驗方法,將帶有Flag標(biāo)簽的NRF1質(zhì)粒與帶有HA標(biāo)簽的IRF3質(zhì)粒共轉(zhuǎn)入HEK293T細(xì)胞中,16h后收取樣品,進(jìn)行免疫共沉淀實驗.結(jié)果發(fā)現(xiàn)NRF1與IRF3存在相互作用.該實驗結(jié)果表明NRF1可能通過與IRF3互作來抑制RLR信號通路的激活.

        3 討 論

        NRF1蛋白可以通過同源二聚的形式結(jié)合到特定的DNA識別序列來調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄[12].研究人員發(fā)現(xiàn)NRF1在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤衍生的細(xì)胞中調(diào)控691個基因轉(zhuǎn)錄,這些基因參與調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、代謝能量產(chǎn)生、蛋白質(zhì)翻譯和DNA復(fù)制/修復(fù)[18-19].此外,NRF1調(diào)節(jié)線粒體相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄,特別是調(diào)控線粒體氧化呼吸鏈中重要基因的表達(dá).

        本研究首次揭示NRF1參與抗病毒天然免疫.通過病毒感染實驗發(fā)現(xiàn)NRF1受病毒誘導(dǎo)上調(diào).在細(xì)胞中敲低NRF1,用帶GFP熒光的VSV進(jìn)行感染,結(jié)果發(fā)現(xiàn)敲低組細(xì)胞病毒載量變少.過表達(dá)NRF1抑制病毒誘導(dǎo)的細(xì)胞因子和趨化因子的產(chǎn)生.這些結(jié)果表明NRF1在機(jī)體免疫系統(tǒng)中扮演著至關(guān)重要的角色.

        在RLR信號通路中,RIG-Ⅰ識別病毒的RNA后,招募接頭蛋白MAVS,接受信號的MAVS多聚化,繼續(xù)將信號傳遞給下游激酶TBK1,TBK1和IKKε形成復(fù)合物磷酸化轉(zhuǎn)錄因子IRF3,磷酸化激活的IRF3入核結(jié)合到IFN-β特定的結(jié)構(gòu)域,啟動IFN-β的表達(dá),發(fā)揮抗病毒天然免疫功能.通過過表達(dá)NRF1抑制了IRF3或其上游信號分子介導(dǎo)的干擾素的激活.利用免疫共沉淀的方法發(fā)現(xiàn)NRF1與IRF3存在相互作用.結(jié)果表明NRF1是通過RLR信號通路下游的轉(zhuǎn)錄因子IRF3來發(fā)揮其抑制功能.NRF1可能通過影響NRF1影響IRF3與IFN-β啟動子的結(jié)合抑制其轉(zhuǎn)錄活性.

        天然免疫反應(yīng)受到細(xì)胞內(nèi)信號分子的精確調(diào)控,過強(qiáng)的免疫反應(yīng)會誘導(dǎo)細(xì)胞因子風(fēng)暴,對機(jī)體造成免疫病理損傷.本研究表明NRF1是作為RLR信號通路的抑制因子,它的作用可能是為了控制免疫過激.對于防止機(jī)體免疫病理損傷具有重要作用.

        猜你喜歡
        干擾素抗病毒質(zhì)粒
        慢性乙型肝炎抗病毒治療是關(guān)鍵
        肝博士(2022年3期)2022-06-30 02:48:52
        抗病毒治療可有效降低HCC的發(fā)生及改善患者預(yù)后
        肝博士(2021年1期)2021-03-29 02:32:14
        抗病毒藥今天忘吃了,明天要多吃一片嗎?
        肝博士(2020年4期)2020-09-24 09:21:26
        對抗病毒之歌
        短乳桿菌天然質(zhì)粒分類
        α-干擾素聯(lián)合利巴韋林治療慢性丙型肝炎
        霧化吸入γ干擾素對免疫低下肺炎的療效觀察
        重組質(zhì)粒rAd-EGF構(gòu)建并轉(zhuǎn)染hDPSCs對其增殖的影響
        干擾素α-1b治療成人麻疹療效初步觀察
        Survivin-siRNA重組質(zhì)粒對人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH-SY5Y的作用
        夜夜躁狠狠躁2021| 日本免费一区二区在线看片| 一本大道道久久综合av| 久久无码av一区二区三区| av网站免费线看| 亚洲人成网线在线播放va蜜芽| 99re热视频这里只精品| 人妻精品丝袜一区二区无码AV | 国产精品亚洲一区二区在线观看| 欧美人妻日韩精品| 亚洲AⅤ永久无码精品AA| 91蜜桃国产成人精品区在线| 久久精品亚洲成在人线av乱码| 免费人成网站在线观看欧美| 老熟女多次高潮露脸视频| 老肥熟女老女人野外免费区| 中文字幕av永久免费在线| 国产精品久久久久9999吃药| 最好看2019高清中文字幕视频| 日本人妻少妇精品视频专区| 青青草激情视频在线播放| 在线精品无码字幕无码av| 国产精品久久久久久久久KTV| 亚洲综合久久一本久道| 成人自拍小视频在线看| 国产成+人欧美+综合在线观看| 国产精品福利影院| 蜜桃av噜噜一区二区三区免费| 国产小视频在线看不卡| 夜夜高潮夜夜爽夜夜爱爱| 加勒比在线一区二区三区| 手机在线免费观看的av| 亚洲欧美一区二区成人片| 亚洲AV成人无码久久精品老人| 日韩精品极品视频在线观看蜜桃| av免费播放网站在线| 欧美饥渴熟妇高潮喷水水| 亚洲ⅤA中文字幕无码| 宅男视频一区二区三区在线观看| 国产精品久久久久精品一区二区 | 亚洲粉嫩视频在线观看|