李秀麗，馬川川，陳劍華，潘 敦，賀 林，伊琦忠，師詠勇

(1.安徽醫(yī)科大學 生命科學學院 遺傳學系，安徽 合肥 230031; 2.Bio-X研究院，發(fā)育和神經(jīng)精神疾病 遺傳學重點實驗室(教育部)和上海交通大學腦科學協(xié)同創(chuàng)新中心，上海 200030; 3.上海交通大學醫(yī)學院 上海市精神衛(wèi)生中心上海市精神病學重點實驗室，上海 200030; 4.新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院心理醫(yī)學中心，新疆烏魯木齊 830054)

精神分裂癥是一種慢性嚴重致殘的精神疾病，在全世界人群中普遍存在，終生患病率約為0.5%～1%[1].精神分裂癥給患者、親屬及整個社會帶來了極大的痛苦與沉重的負擔[2].這種疾病的臨床癥狀復雜多樣，常見癥狀有幻覺，妄想，溝通混亂，計劃不周，動機減少和情緒紊亂等[3].精神分裂癥的病因迄今為止尚不明確，且病程多種多樣，發(fā)病年齡大多在16至40歲之間.雙生子、領養(yǎng)子和核心家系的流行病研究表明，它是一種高度遺傳性的精神疾病(遺傳率約為70%～85%)[4-6].在過去十幾年中，全基因組關聯(lián)研究(GWAS)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)許多精神分裂癥的風險基因，這些基因在預測疾病風險、精神分裂癥藥物的研發(fā)方面顯示出獨特的臨床價值.超極化激活的環(huán)核苷酸門控(HCN)通道是一種非選擇性的電壓門控陽離子通道，由4個編碼基因(HCN1、HCN2、HCN3、HCN4)組成，該通道在神經(jīng)元的產(chǎn)生和心臟自律性方面起著重要作用[7-8].相關研究發(fā)現(xiàn)HCN通道的轉錄水平和蛋白水平在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中廣泛表達[9-10].在這4種編碼基因中，HCN1基因是鉀通道亞基和大腦內(nèi)向超極化激活的電流(Ih)的主要貢獻者，Ih廣泛參與神經(jīng)系統(tǒng)的生理功能，如靜息膜電位的穩(wěn)定、神經(jīng)遞質(zhì)的釋放、調(diào)節(jié)神經(jīng)元興奮性、節(jié)律活動和突觸可塑性[11-13].隨后的研究相繼發(fā)現(xiàn)在大腦中HCN1基因是HCN通道的主要成分，且在新皮質(zhì)、海馬CA1區(qū)域、小腦皮質(zhì)和腦干中高度表達[14-15].相關的研究發(fā)現(xiàn)，HCN1在海馬區(qū)廣泛表達，對大鼠該基因敲除后，會導致嚴重運動學習和記憶障礙[16].顯然，這些學習和記憶的認知障礙都可能導致精神疾病.此外，一些研究發(fā)現(xiàn)HCN1蛋白可用作治療焦慮和抑郁的潛在藥物靶標[17].更重要的是，將HCN1轉染到培養(yǎng)的海馬神經(jīng)細胞中，發(fā)現(xiàn)原代培養(yǎng)的海馬神經(jīng)細胞和轉染后的海馬細胞中HCN1的表達量均具有谷氨酸依賴性: 隨著谷氨酸與其受體結合，HCN1的表達量會相應增加.隨后還發(fā)現(xiàn)HCN通道的突觸后電流Ih可抑制谷氨酸和γ-氨基丁酸(GABA)的突觸傳遞[18-19].而近年來許多研究者將突觸上的谷氨酸和γ-氨基丁酸(GABA)以及突觸外的氨基酸能遞質(zhì)受體作為參與精神分裂癥疾病的病因?qū)W假說進行研究，從而進一步支持了HCN1基因可能與精神分裂癥有關聯(lián)的假說[20].在2014年，一項精神分裂癥全基因組關聯(lián)研究聯(lián)盟(Schizophrenia Psychiatric GWAS Consortium, PGC)在歐洲和東亞人群中新發(fā)現(xiàn)108個精神分裂癥相關的位點，其中HCN1基因是首次發(fā)現(xiàn)與精神分裂癥可能存在著關聯(lián)(P=5.05×10-9)[21].在2017年，我們課題組基于36180份樣本，完成了中國漢族人群全基因組關聯(lián)分析及驗證，同時結合PGC2的歐洲樣本數(shù)據(jù)，開展了大樣本跨種族分析以及精細定位研究，發(fā)現(xiàn)了30個新的精神分裂癥易感位點.此項研究中也發(fā)現(xiàn)了歐洲人群中HCN1內(nèi)含子區(qū)域上的位點rs9292918，與精神分裂癥顯著相關(P=4.47×10-11)[22].這些研究強有力地證明了該基因可能是精神分裂癥的風險基因.

自從2006年以來，精神疾病的GWAS已經(jīng)在歐洲和亞洲不同種群間超過10萬個樣本進行研究，到目前為止我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了數(shù)百種新的疾病易感位點[6，21-29].之前的研究證明HCN1基因在歐洲人群中與精神分裂癥有關.然而，由于潛在的遺傳異質(zhì)性，在一個群體中發(fā)現(xiàn)的遺傳變異可能在其他群體中并沒有顯著關聯(lián).因此，本研究探索了中國新疆維吾爾族人群中精神分裂癥與HCN1基因之間的關系.新疆自古以來就是歐亞大陸東西方人群的融匯之地，也是古“絲綢之路”的必經(jīng)之地，在歐亞大陸人群遷徙和演化史上扮演著重要的角色，同時也造就了新疆人群的復雜多樣性[30].之前的報道認為維吾爾族人群是漢族和西歐人群基因交流的混合結果[31].最近一項研究分析了涵蓋新疆全境近千例維吾爾族樣本的基因組數(shù)據(jù)，從遺傳學角度對維吾爾族的群體結構、祖源構成和人群融合歷史做了一個較為全面的解析，發(fā)現(xiàn)維吾爾族人口的遺傳成分主要來自歐亞大陸東、南、西、北4個方向的分化群體[32].

鑒于HCN1基因研究的現(xiàn)狀，本研究是第一次在中國維吾爾族人群探索HCN1中的常見變異是否會導致精神分裂癥的風險.在本文中，為了研究HCN1是否在精神分裂癥中發(fā)揮重要作用，我們對985名患者和1218名正常對照中的5個位點rs12519313，rs10060015，rs16902112，rs16902197和rs12659024進行了全面的基因分型，并且還分析了兩個推算的SNPs(rs1501357，rs9292918).

1 材料和方法

1.1 研究對象

本研究的對象是中國新疆維吾爾族人群，其中包括985例精神分裂癥患者(612例男性和373例女性，平均發(fā)病年齡為(39.45±12.12)歲)和1218例健康對照(629例男性和589例女性，平均發(fā)病年齡為(43.07±13.14)歲).精神分裂癥患者是由兩位主任級精神科醫(yī)生依據(jù)DSM-4診斷標準獨立診斷.正常對照是由精神科醫(yī)生通過簡單的訪談從正常維吾爾族人群中隨機挑選，年齡和性別與患者大致相匹配，并且沒有心理健康問題或神經(jīng)疾病史.該研究獲得了所有參與者的知情同意，并得到了當?shù)貍惱砦瘑T會的支持.

1.2 DNA提取、SNP的選擇和分型

基因組DNA樣本是通過Quick Gene DNA whole blood試劑盒(Fujifilm, Life Sciences Products, Tokyo, Japan)根據(jù)制造商提供的標準化方案來提取.使用Nano drop ND-1000(Thermo Scientific, DE, USA)分光光度計來進行評估基因組DNA的質(zhì)量.HCN1基因位于5號染色體上，大小為441.38bp；它由6個外顯子和5個內(nèi)含子組成.標簽SNPs的選取是通過Haploview軟件4.2版本，按照R2≥0.5和最小等位基因頻率(MAF)≥0.05的原則進行篩選[33].對5個標簽SNPs(rs12519313, rs10060015, rs16902112, rs16902197, rs12659024)進行基因分型.此外，這5個標簽SNPs和兩個推算SNPs(rs1501357，rs9292918)均位于基因的內(nèi)含子區(qū)域.7個位點的詳細信息位于表1中.本研究采用Mass ARRAY iPLEX Gold平臺(Sequenom Inc., San Diego, CA)對SNP進行分型.基因分型的實驗步驟與之前研究中所描述的常規(guī)方法相同[34].所有的樣本都有相對較高的分型結果且檢出率高于95%.

表1 HCN1基因中7個SNP的位點信息

1.3 數(shù)據(jù)分析

我們在SHEsis軟件平臺上進行了哈迪-溫伯格平衡(Hardy-Weinberg Equilibrium, HWE)檢驗、連鎖不平衡(LD)檢驗、等位基因關聯(lián)分析、基因型關聯(lián)分析和單倍型分析(http:∥analysis.bio-x.cn/SHEsis.html)[35-36].通過擬合優(yōu)度的卡方檢驗來測試每組中的HWE，以及病例和對照之間的等位基因和基因型分布差異.此外，使用D′和R2值去衡量連鎖不平衡程度.當雙端P<0.05，并且在Bonferroni校正后P<0.05，結果才被認為有統(tǒng)計學意義.

2 結 果

2.1 Hardy-Weinberg平衡和連鎖不平衡

表2 病例組和對照組檢出率和HWE值

我們不僅在病例組和對照組中進行HWE檢驗，還分析了這5個位點間的連鎖不平衡.HWE檢驗結果顯示對照組中除了位點rs16902112的P<0.05外，其余位點的P值均大于0.05，故rs16902112偏離HWE，在后續(xù)的研究中舍棄該位點.所有位點HWE檢驗的詳細信息見表2.連鎖不平衡的結果表明在5個位點中，rs12519313與rs16902112、rs16902197、rs12659024, rs10060015與rs16902112，rs16902112與rs12659024，rs16902197與rs12659024之間具有強烈的連鎖不平衡，且位于同一個區(qū)塊內(nèi)(D′>0.95)，如圖1(a)所示.

此外，我們基于本次研究的數(shù)據(jù)和以前GWAS研究的數(shù)據(jù)來分析兩個推算的SNPs(rs9292918和rs1501357)與本研究的5個SNPs之間的連鎖不平衡.連鎖不平衡的結果見圖1(b)，在這些位點中，rs9292918與rs10060015，rs9292918與rs1501357，rs16902112與rs10060015以及rs10060015與rs1501357之間具有強烈的連鎖不平衡，且位于同一個區(qū)塊內(nèi).

圖1 HCN1基因上SNPs位點之間的連鎖不平衡Fig.1 Linkage disequilibrium among SNPs of the HCN1 gene(a) 中國維吾爾族人群HCN1基因中5個標簽SNPs之間的連鎖不平衡.區(qū)塊中的數(shù)字是兩點之間的D′值.當數(shù)值越大時，連鎖不平衡越強.當值越小時，連鎖不平衡越弱.(b) 基于該研究的結果和先前的GWAS結果在中國人群中，兩個推定的SNP(rs1501357，rs9292918)和5個標簽SNP之間的連鎖不平衡.區(qū)塊中的數(shù)字是兩點之間的R2值.當數(shù)值越大時，連鎖不平衡越強.當數(shù)值越小時，連鎖不平衡越弱.

2.2 單個位點和單倍型分析

5個SNPs的基因分型結果見表3、表4、表5、表6中.在表3中，我們未發(fā)現(xiàn)在健康對照與精神分裂癥病例之間的等位基因或基因型分布有顯著差異(在Bonferroni校正之前P>0.05).為了進一步驗證結果，我們對研究對象進行了性別分組分析.詳細的分析結果示于表4和5中，結果顯示男性和女性組之間也沒有顯著統(tǒng)計學意義.此外，表6顯示所有位點在病例和對照之間的單倍型分布也沒有顯著統(tǒng)計學意義.

表3 病例組和對照組中等位基因和基因型的分布

表4 男性組等位基因和基因型的分布

表5 女性組等位基因和基因型的分布

(續(xù)表)

表6 HCN1基因單倍型的分析

3 討 論

在過去的幾十年中，很多研究已經(jīng)證明HCN通道介導超極化激活電流(Ih)，而且在神經(jīng)系統(tǒng)中廣泛表達，在調(diào)控神經(jīng)興奮和網(wǎng)絡活動方面具有顯著作用[37-38].最近研究還發(fā)現(xiàn)HCN1通道可調(diào)節(jié)靈長類動物背外側前額葉皮層(PFC)中神經(jīng)元的興奮性，而且脊柱中的HCN1通道與環(huán)磷酸腺苷(cAMP)相關蛋白(DISC1: 精神分裂癥斷裂基因1，D1R: 多巴胺D1受體)共表達，這與精神分裂癥中學習記憶失調(diào)有關[39].此外，許多研究報道了HCN1通道調(diào)控許多腦認知的生理過程，例如睡眠、學習和記憶等[12，16，40].而近年一些研究者發(fā)現(xiàn)HCN通道電流Ih與疾病癲癇發(fā)生中表達的上調(diào)，功能的增強有關，且突觸上的NMDA和GABAA受體以及突觸外的氨基酸能遞質(zhì)受體可能與癲癇的發(fā)病機制有關[19，41].其他研究表明，在神經(jīng)系統(tǒng)中HCN通道的異常調(diào)節(jié)可能與許多神經(jīng)系統(tǒng)疾病有關，如心律失常，癲癇，阿爾茨海默病和神經(jīng)性疼痛，這使HCN通道成為治療探索的新目標[11，42-45].在2014年，精神病學基因組協(xié)會-精神分裂癥工作組(PGC-SCZ)發(fā)表一項GWAS研究，確定了一百多個遺傳基因位點，并且第一次發(fā)現(xiàn)歐洲人群中HCN1基因內(nèi)含子區(qū)域上rs1501357可能是精神分裂癥風險位點[21].在2017年，我們課題組一項GWAS研究發(fā)現(xiàn)30個新的精神分裂癥易感位點，并且在歐洲人群中發(fā)現(xiàn)HCN1上的rs9292918位點，這是繼rs1501357發(fā)現(xiàn)后的又一個與精神分裂癥可能相關的風險位點[22].這些研究都進一步支持了本文的假說HCN1基因可能與精神分裂癥風險有關.

本文的研究旨在探索HCN1在中國維吾爾族人群中與精神分裂癥的關系，但是并沒有發(fā)現(xiàn)兩者之間有顯著的相關.接下來，我們基于之前GWAS的研究結果與本實驗的結果，進行了HCN1基因上5個標簽SNPs之間的連鎖不平衡檢驗，和兩個推算SNPs與另外5個標簽SNPs之間的連鎖不平衡檢驗.如圖1(a)所示，5個標簽SNPs間存在連鎖不平衡，圖1(b)則展示了rs9292918與rs10060015, rs9292918與rs1501357, rs16902112與rs10060015以及rs10060015與rs1501357位點位于一個區(qū)塊內(nèi)，且存在連鎖不平衡.由于兩個推算的SNPs位點與另外5個標簽位點都位于同一染色體上，可通過連鎖不平衡(LD)來反映同一染色體上不同基因座上等位基因的非隨機關聯(lián)情況.根據(jù)LD的結果，我們可以推算出在維吾爾族人群中，這兩個推算的位點也可能與精神分裂癥的風險無關.

我們目前的研究存在以下3方面的局限性，這些局限性可能會導致結果呈現(xiàn)出陰性.(1) 考慮到HCN1的分子大小為441.38bp，本實驗選擇的標簽SNPs的數(shù)量相對較少，而且這些SNP都是HCN1基因內(nèi)含子中的常見等位基因(MAF>0.05)，其可能不直接影響該基因的功能或表達.(2) 精神分裂癥是復雜疾病且具有遺傳異質(zhì)性，新疆維吾爾族人群是一個混合的人群，有研究報道其祖先主要來自歐洲和亞洲，但具體的種群結構仍不清楚[32].HCN1基因多態(tài)性在不同群體中有顯著差異.例如，在千人基因組(1000 genomes)數(shù)據(jù)庫中，發(fā)現(xiàn)rs12519313-A在漢族人群(CHB)中的患病率較高(14.08%)，而歐洲人群(CEU)患病率較低(2.02%).rs10060015-G在CHB中等位基因頻率為33.98%，而在CEU中頻率為18.18%；rs16902112-C在CHB中等位基因頻率為14.56%，在CEU中頻率為0%；rs16902197-C在CHB中等位基因頻率為11.17%，在CEU中頻率為0%；rs12659024-T在CHB中等位基因頻率為13.59%，在CEU中頻率為7.58%.這些數(shù)據(jù)都表明了漢族和歐洲人群之間存在顯著的種族差異，從而解釋了該研究結論的不一致性.由于社會文化，生活習俗和環(huán)境暴露等因素的差異，漢族或歐洲人群中發(fā)現(xiàn)的精神分裂癥易感基因(CMYA5、ANK3、GRM7和親和素β3基因等)，在維吾爾族人群中并沒有得到驗證[46-49].(3)我們根據(jù)本研究的樣本量和最小等位基因頻率(MAF)用Quanto軟件(http:∥biostats.usc.edu/Quanto.html)計算了rs12519313、rs10060015、rs16902197、rs12659024 4個位點的統(tǒng)計檢驗能力，具體結果見表7.4個位點的統(tǒng)計效力均在99%以上，證明本研究的樣本量足以得出陰性結論.我們的研究雖然表明HCN1不是中國維吾爾族人群精神分裂癥的風險基因，但是不排除該基因可能通過與其他基因相互作用而導致精神分裂癥，或者可能與該病的某些內(nèi)表現(xiàn)有關.盡管本實驗沒有發(fā)現(xiàn)HCN1基因與中國維吾爾族人群精神分裂癥有關聯(lián)，但是對精神分裂癥藥物基因組學后續(xù)的研究有一定的參考價值.

表7 統(tǒng)計效力的分析