翁苓苓 高玲 張閩光

肝癌本身快速增殖的生物學(xué)特征造成了缺氧的微環(huán)境，其與腫瘤發(fā)展、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移等惡性生物學(xué)行為密切相關(guān)，導(dǎo)致腫瘤治療失敗和預(yù)后不良[1]。缺氧誘導(dǎo)因子-1(HIF-1)在肝癌的侵襲、轉(zhuǎn)移中起著重要的作用，但因HIF-1α在常氧下易降解[2]，使這種研究遇到困難。因此，建立體外細(xì)胞穩(wěn)定的缺氧模型可為肝癌的缺氧環(huán)境及防治血管新生等實(shí)驗(yàn)研究提供平臺(tái)。常規(guī)的缺氧模型為物理性缺氧如低張性低氧，其模型特點(diǎn)需要低氧的狀態(tài)平衡與維持，而化學(xué)模擬誘導(dǎo)缺氧環(huán)境簡(jiǎn)單易行，更利于快速建立急性缺氧的模型。本研究就CoCl2作用常見(jiàn)的肝癌細(xì)胞系模擬化學(xué)性缺氧的最佳條件展開(kāi)探索。

資料與方法

一、實(shí)驗(yàn)細(xì)胞和材料

(一)細(xì)胞 人肝癌細(xì)胞系HepG2、Hep3B、SMMC-7721和 Bel-7402，購(gòu)于美國(guó)菌種保藏中心(ATCC)。

(二)試劑 胎牛血清(Gibco公司)；DMEM培養(yǎng)基(美國(guó)Hyclone)；雙抗(青霉素-鏈霉素)(美國(guó)Gibco公司)；胰酶(美國(guó)Sigma公司)；CCK-8試劑盒(上海博谷生物科技有限公司)；氯化鈷(sigma,C8661)；HIF-1α抗體(BD,610958)；VEGF引物 (CST)；PCR提取試劑(日本TAKARA)；PCR定量試劑盒(日本TAKARA)。

二、實(shí)驗(yàn)方法

(一)細(xì)胞培養(yǎng) 用含有10%的胎牛血清、谷氨酰胺的DMEM培養(yǎng)液，于37 ℃飽和濕度、5% CO2濃度下培養(yǎng)。

(二)建立低氧模型 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的四種細(xì)胞種植在96孔板內(nèi)，根據(jù)每種細(xì)胞生長(zhǎng)情況調(diào)整細(xì)胞濃度，每孔200 μL培養(yǎng)基，設(shè)常氧氣對(duì)照組(加入正常培養(yǎng)液)，實(shí)驗(yàn)CoCl2組(分設(shè)100、200、300、400、500、600、700、800 μmol/L)，每組5個(gè)復(fù)孔。

(三)CCK-8法細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的肝癌細(xì)胞懸液，以每孔5×103個(gè)細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)液，每孔培養(yǎng)液為200 μL。每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，按照碧云天CCK-8試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，加入不同濃度CoCl2處理肝癌細(xì)胞，每孔加入10 μg CCK-8，輕搖，37 ℃下孵育3 h，用酶聯(lián)免疫儀記錄450 nm 波長(zhǎng)處的吸光度(A)值。分別做5個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

(五)RT-PCR檢測(cè) 四種肝癌細(xì)胞在5%CO2、37℃條件下培養(yǎng)，處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，加入200 μmol/L CoCl2分別作用于四種肝癌細(xì)胞系，常氧下加入培養(yǎng)液作為空白對(duì)照組，5% CO2、37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)胞0、6、12、24 h后，按照TRIzol說(shuō)明方法提取細(xì)胞RNA，測(cè)總RNA濃度和純度。按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以β-actin為內(nèi)參,VEGF引物序列正義鏈：AATCGAGACCCTGGTG-GACA，反義鏈：TGTTGGACTCCTCAGTGGGC。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性30 s，94 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s共40個(gè)循環(huán)。2-△△CT法計(jì)算mRNA的相對(duì)表達(dá)。每個(gè)實(shí)驗(yàn)組重復(fù)3次。

(六)Western blot檢測(cè) 四種肝癌細(xì)胞在5%CO2、37 ℃條件下培養(yǎng)，處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，分別加入含100、200、300、400 μmol/L 的CoCl2的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，提取總蛋白后測(cè)定蛋白濃度。蛋白裂解液裂解細(xì)胞后提取細(xì)胞總蛋白。BCA法測(cè)定蛋白濃度。丙烯酰胺垂直電泳，半干轉(zhuǎn)膜法轉(zhuǎn)至PVDF膜。5%脫脂牛奶室溫封密1 h。加一抗稀釋液4 ℃孵育過(guò)夜。PBST緩沖液洗膜10 min×3次。加入不同稀釋比的二抗稀釋液室溫孵育1 h，PBST緩沖液洗膜10 min×3次。ECL化學(xué)發(fā)光，暗室膠片顯影后，Image-Pro Plus 5.0軟件計(jì)算條帶光密度值。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié) 果

一、氯化鈷對(duì)四種肝癌細(xì)胞存活率的影響

為了研究在CoCl2處理誘導(dǎo)的缺氧模擬條件下對(duì)常見(jiàn)的肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，將四種肝癌細(xì)胞加入不同濃度的CoCl2(0～800 μmol/L)。CoCl2濃度的選擇是既能滿足實(shí)驗(yàn)低氧條件，又保證細(xì)胞存活率較高作為細(xì)胞缺氧的實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)，排除藥物對(duì)于細(xì)胞較大的急性毒性，同時(shí)保證藥物能夠發(fā)揮最大作用。實(shí)驗(yàn)選用不同濃度的CoCl2作用于四種肝癌細(xì)胞，24 h后檢測(cè)細(xì)胞的吸光度值。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，加入不同濃度的CoCl2后四種肝癌細(xì)胞存活率不同程度地減低，CoCl2濃度在100～200 μmol/L時(shí)四種肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)無(wú)明顯減低，當(dāng)濃度高于200 μmol/L后，四種人肝癌細(xì)胞存活率明顯降低(P<0.05，見(jiàn)圖1)。

選取100、200、300、400 μmol/L濃度的CoCl2作用四種肝癌細(xì)胞0、12、24、48、72 h后檢測(cè)細(xì)胞的吸光度值，結(jié)果顯示，CoCl2作用四種肝癌細(xì)胞48、72 h后細(xì)胞存活率顯著降低(P<0.05，見(jiàn)圖2)。表明CoCl2>200 μmol/L，作用時(shí)間>24 h后呈劑量和時(shí)間依賴性地抑制肝癌細(xì)胞活力，而濃度在200 μmol/L以內(nèi)的CoCl2未嚴(yán)重影響細(xì)胞的活力。

圖1 不同濃度CoCl2對(duì)四種肝癌細(xì)胞存活率的影響

二、氯化鈷作用四種肝癌細(xì)胞不同時(shí)間后VEGF mRNA的表達(dá)

根據(jù)CoCl2對(duì)細(xì)胞活性增殖的影響，選取濃度為200 μmol/L的CoCl2作用四種肝癌細(xì)胞最佳誘導(dǎo)濃度，作用0、6、12、24 h后檢測(cè)VEGF mRNA相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果顯示，在CoCl2作用24 h時(shí)四種肝癌細(xì)胞VEGF mRNA表達(dá)均明顯增加(P<0.05)。故選用的時(shí)間為24 h作為CoCl2誘導(dǎo)低氧的時(shí)間。見(jiàn)圖3。

注：A:Bel-7402肝癌細(xì)胞；B:Hep3B肝癌細(xì)胞；C:SMMC-7721肝癌細(xì)胞；D:HepG2肝癌細(xì)胞

圖2CoCl2作用四種肝癌細(xì)胞不同時(shí)間后的細(xì)胞存活率

注：A:Bel-7402肝癌細(xì)胞；B:Hep3B肝癌細(xì)胞；C:SMMC-7721肝癌細(xì)胞；D:HepG2肝癌細(xì)胞。與對(duì)照組(作用0 h肝癌細(xì)胞內(nèi)VEGF mRNA)比較，▲P<0.05

圖3CoCl2對(duì)四種肝細(xì)胞VEGFmRNA相對(duì)表達(dá)量的影響

三、氯化鈷對(duì)四種肝癌細(xì)胞HIF-1α蛋白表達(dá)的影響

不同濃度培養(yǎng)氯化鈷作用于四種肝癌細(xì)胞24 h，提取總蛋白，進(jìn)行Western Blot的檢測(cè)。結(jié)果顯示，未加入氯化鈷時(shí)HIF-1α蛋白未見(jiàn)明顯表達(dá)；當(dāng)氯化鈷濃度為100 μmol/L時(shí)，Bel-7402細(xì)胞HIF-1α蛋白表達(dá)；當(dāng)氯化鈷濃度為200 μmol/L時(shí)，四種肝癌細(xì)胞HIF-1α蛋白均表達(dá)。故綜合氯化鈷對(duì)細(xì)胞存活率的影響，氯化鈷濃度為200 μmol/L可作為穩(wěn)定HIF-1α表達(dá)的缺氧模型的濃度。

圖4 不同濃度CoCl2作用四種肝癌細(xì)胞24 h后HIF-1α蛋白的表達(dá)

討 論

CoCl2是常見(jiàn)的化學(xué)模擬缺氧條件的化學(xué)物質(zhì)，其通過(guò)鈷的累積穩(wěn)定HIF-1α表達(dá)來(lái)模擬缺氧[3]，與氧水平無(wú)關(guān)，因此該方法具有比常規(guī)缺氧模型更穩(wěn)定的優(yōu)點(diǎn)。此外，已經(jīng)證明CoCl2能調(diào)節(jié)缺氧導(dǎo)致相關(guān)的下游靶標(biāo)如促紅細(xì)胞生成素和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1(GLUT1)的作用，具有與真正的缺氧相同的調(diào)節(jié)作用[4]。

CoCl2對(duì)不同的細(xì)胞誘導(dǎo)HIF-1α表達(dá)所需的濃度及處理時(shí)間有所不同。高濃度或長(zhǎng)時(shí)間作用細(xì)胞會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡[5]。CoCl2能上調(diào)HIF-1α，并促進(jìn)VEFG等下游基因表達(dá)[6-7]。本研究提示，氯化鈷對(duì)四種肝癌細(xì)胞均產(chǎn)生細(xì)胞毒性作用，并隨著藥物濃度增加而增強(qiáng)。在CoCl2濃度超過(guò)200 μM時(shí)及作用24 h后細(xì)胞存活率明顯減低。同時(shí)發(fā)現(xiàn)200 μM CoCl2作用四種肝癌細(xì)胞24 h后細(xì)胞內(nèi)VEGF mRNA表達(dá)水平最高，肝癌細(xì)胞也較能穩(wěn)定表達(dá)HIF-1α蛋白。本研究表明，四種常見(jiàn)的肝癌細(xì)胞在200 μM CoCl2作用24 h時(shí)，對(duì)細(xì)胞既有較小的細(xì)胞毒性，也能使得肝癌細(xì)胞較穩(wěn)定表達(dá)HIF-1α，因此200 μM CoCl2作用24 h 為肝癌化學(xué)性缺氧誘導(dǎo)的最佳條件。

與其他體外模型一樣，這個(gè)簡(jiǎn)化的平臺(tái)相對(duì)有限地反映了體內(nèi)腫瘤微環(huán)境，它缺乏體內(nèi)的復(fù)雜性、細(xì)胞成分的多樣性(包括免疫細(xì)胞和器官特異性基質(zhì)細(xì)胞，以及細(xì)胞外基質(zhì)成分)。然而，與依賴于物理低氧的常規(guī)缺氧模型相比，基于CoCl2的平臺(tái)可以簡(jiǎn)單易行地模擬腫瘤缺氧微環(huán)境，為肝癌細(xì)胞的缺氧、血管新生的研究提供了細(xì)胞模型基礎(chǔ)。