吳江華 馬俊驥 郭昱 郭平

肝纖維化進(jìn)展時(shí)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)可以促使肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cells,HSC)產(chǎn)生大量膠原沉積[1]。肝硬化后miR-29b和miR-19b表達(dá)均下調(diào)，TGF-β1可抑制miR-29和miR-19b的表達(dá)，給予miR-19b 和miR-29類似物可以抑制HSC 活化，并減輕肝纖維化的發(fā)生[2,3]。SB-525334 是一種強(qiáng)效小分子抑制劑，能夠選擇性抑制TGF-β I型活化素受體樣激酶(activin receptor-like kinase,ALK5)[4]。研究表明，SB-525334 可以選擇性地抑制TGF-β1 受體從而抑制TGF-β介導(dǎo)的慢性腎損傷，但是SB-525334 對(duì)HSC的作用機(jī)制還不清楚。本研究觀察TGF-β1 刺激HSC后SB-525334 對(duì)I 型膠原分泌、miR-29b和miR-19b表達(dá)的影響，以評(píng)估SB-525334 在肝纖維化防治中的作用。

資料與方法

一、細(xì)胞培養(yǎng)及MTT

HSC株人LX-2由美國(guó)Mount Sinai大學(xué)醫(yī)學(xué)院惠贈(zèng)。將LX-2細(xì)胞系于液氮中取出，迅速置于37℃水浴鍋中，用含10%FBS、100 IU/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，并接種于培養(yǎng)瓶中，在體積分?jǐn)?shù)為0.05的CO2孵箱中37℃恒溫培養(yǎng)。取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)[5]。

收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，在96孔培養(yǎng)板中每孔加入100 μL，鋪板使待測(cè)細(xì)胞調(diào)密度 1×104個(gè)細(xì)胞/孔。體積分?jǐn)?shù)為0.05的CO2、37℃孵育培養(yǎng)24 h，2% FBS培養(yǎng)基饑餓12 h，加入濃度梯度的干預(yù)因子，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，設(shè)5～7個(gè)梯度，3～5個(gè)復(fù)孔。每孔加入20 μL MTT溶液(5 mg/mL)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。每孔加入150 μL二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀A490 nm處測(cè)量各孔的吸光值。同時(shí)設(shè)置調(diào)零孔和對(duì)照孔。根據(jù)吸光度值計(jì)算各TGF-β1不同干預(yù)濃度與干預(yù)時(shí)間的增殖率，以及SB-525334不同干預(yù)濃度與干預(yù)時(shí)間的抑制率。增殖率=(實(shí)驗(yàn)組-空白組)/(對(duì)照組-空白組)，抑制率=1-(實(shí)驗(yàn)組-空白組)/(對(duì)照組-空白組)。為明確TGF-β1與SB-525334 處理LX-2細(xì)胞時(shí)最佳濃度，以未做任何處理的LX-2 細(xì)胞作為對(duì)照，分別觀察TGF-β1在濃度為1、10、20、30 ng/mL時(shí)處理后LX-2細(xì)胞生長(zhǎng)率、SB-525334在濃度為1、2、10、20 μmol/L時(shí)處理后的LX-2細(xì)胞生長(zhǎng)率。為明確TGF-β1與SB-525334處理LX-2細(xì)胞最適時(shí)間，觀察TGF-β1 、SB-525334在0、12、24、48 h處理后LX-2細(xì)胞生長(zhǎng)率。

二、細(xì)胞分組與干預(yù)

將LX-2細(xì)胞種植于6孔培養(yǎng)板上，每孔約5×105個(gè)細(xì)胞，在10% FBS的DMEM中進(jìn)行培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞融合度達(dá)到60%時(shí)，改用1% FBS的DMEM饑餓處理12 h，分別設(shè)對(duì)照組、TGF-β1干預(yù)組、SB-525334 干預(yù)組、TGF-β1和SB-525334共同干預(yù)組，其中TGF-β1和SB-525334共同干預(yù)組先加入SB-525334，12 h后再加TGF-β1，在各組干預(yù)過程中均加入相同劑量的溶劑(DMSO、檸檬酸與BSA)，CO2孵育箱培養(yǎng)24 h后，收集細(xì)胞。

三、蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)I型膠原

采用RIPA裂解緩沖液制備細(xì)胞蛋白裂解液，-20℃保存。BCA法測(cè)定蛋白濃度，SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白樣品，PVDF膜轉(zhuǎn)膜。PVDF 膜置于含5%脫脂奶粉的TBST封閉液中于室溫封閉1 h，將封閉后的PVDF膜置入TBST適當(dāng)稀釋的一抗溶液中，4℃過夜。以TBST 1∶10 000稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗溶液中，于37℃反應(yīng)1 h。實(shí)驗(yàn)用X膠片顯影后采用Image J軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行定量分析，灰度值以累積吸光度值(IA)表示。

四、RT-qPCR檢測(cè)miR-19b和miR-29b

吸除培養(yǎng)基，用PBS洗滌細(xì)胞，加入含有0.10%～0.25%胰蛋白酶處理，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至RNase-Free的離心管中，300×g離心5 min，收集細(xì)胞沉淀。采用美國(guó)Ambin公司的mirVanaTMPARIS試劑盒提取miRNA，進(jìn)行濃度及純度測(cè)定后行miRNA反轉(zhuǎn)錄。

miRNA SYBR Green 熒光定量PCR以cDNA為模板檢測(cè)miR-29b和miR-19b的表達(dá)水平，其引物序列如下，miR-19b：UGUGCAAAUCCAUGCAAAC-UGA，miR-29b：UAGCACCAUUUGAAAUCAG-UGUU；U6上游引物序列：CTCGCTTCGGCAG-CACA，下游引物序列：AACGCTTCACGAAT-TTGCGT，均由天根生化科技有限公司合成，引物濃度均為10 μmol/L。

PCR產(chǎn)物的相對(duì)定量使用比較閾值法進(jìn)行定量分析。Ct值是指熱循環(huán)儀中熒光達(dá)到熒光閾值所需的循環(huán)數(shù)，在測(cè)定目的基因Ct值的同時(shí)，測(cè)定同一樣本內(nèi)參基因的Ct值，從而對(duì)加入RNA量的差異進(jìn)行校正?！鰿t實(shí)驗(yàn)組=Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因，△Ct對(duì)照組=Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因，△△Ct=△Ct實(shí)驗(yàn)組-△Ct對(duì)照組，2-△Ct表示目的基因的相對(duì)表達(dá)量，2-△△Ct表示實(shí)驗(yàn)組的目的基因相對(duì)于對(duì)照組的變化倍數(shù)。

五、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間比較采用SNK檢驗(yàn)、Tamhane’st2檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、SB-525334抑制HSC增殖

TGF-β1 的濃度為1、10、20、30 ng/mL時(shí)，吸光度值為0.44±0.02、0.58±0.32、0.54 ±0.07、0.46±0.05，與對(duì)照組比較，細(xì)胞增殖以濃度依賴的方式呈現(xiàn)先增高后下降的趨勢(shì)(P<0.05)，當(dāng)TGF-β1濃度為10 ng/mL時(shí)，其生存率最高，為132.0%。SB-525334在濃度為1、2、10、20 μmol/L，吸光度的數(shù)值為0.53±0.05、0.51 ±0.04、0.41±0.05，0.40±0.06，SB-525334處理后與對(duì)照組比較，細(xì)胞抑制率以濃度依賴的方式呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢(shì)(P<0.05)，當(dāng)SB-525334濃度為10 μmol/L時(shí)，其抑制率最強(qiáng)，為38.4%。

TGF-β1在0、12、24、48 h時(shí)，其吸光度值為0.27±0.07、0.29 ±0.07、0.31±0.07、0.30±0.06；SB-525334在0、12、24、48 h時(shí)其吸光度值0.32±0.07、0.3 ±0.06、0.28±0.06，0.30±0.06，TGF-β1與SB-525334在各個(gè)時(shí)間段對(duì)細(xì)胞的增殖無(wú)顯著差異(P>0.05)，但是在24 h時(shí)兩種藥物對(duì)細(xì)胞的影響呈最大的趨勢(shì)，因此選擇藥物處理24 h進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

二、SB-525334抑制I型膠原的表達(dá)

對(duì)照組、TGF-β1組、SB-525334組、TGF-β1+SB-525334組I型膠原蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為(17.89±4.27)%、(82.80±4.39)%、(34.63±5.37)%、(62.62±3.72)%，TGF-β1組I型膠原蛋白的表達(dá)量較對(duì)照組顯著增高(P<0.01)，SB-525334組和TGF-β1+SB-525334組I型膠原蛋白的表達(dá)量較TGF-β1顯著降低(P<0.01)，見圖1。

注：1.對(duì)照組；2.TGF-β1干預(yù)組；3.SB-525334干預(yù)組；4.TGF-β1和SB-525334共同干預(yù)組

圖1SB-525334對(duì)肝星狀細(xì)胞株LX-2 細(xì)胞I型膠原表達(dá)的影響

三、SB-525334下調(diào)肝星狀細(xì)胞miR-29b、miR-19b的表達(dá)

將對(duì)照組的miR-19b表達(dá)量設(shè)為1，TGF-β1干預(yù)組、SB-525334干預(yù)組、TGF-β1和SB-525334共干預(yù)組LX-2細(xì)胞miR-19b相對(duì)表達(dá)量分別為0.62±0.07、0.28±0.06、0.64±0.20，各干預(yù)組LX-2細(xì)胞miR-19b相對(duì)表達(dá)量較對(duì)照組明顯下降(P<0.01)，TGF-β1和SB-525334共干預(yù)組LX-2細(xì)胞miR-19b的相對(duì)表達(dá)量較SB-525334組高(P<0.05)，TGF-β1和SB-525334共干預(yù)組與TGF-β1干預(yù)組LX-2細(xì)胞 miR-19b的相對(duì)表達(dá)量比較無(wú)明顯差異(P>0.05)。

將對(duì)照組的miR-29b表達(dá)量設(shè)為1，TGF-β1干預(yù)組、SB-525334干預(yù)組、以及TGF-β1和SB-525334共干預(yù)組LX-2細(xì)胞miR-29b相對(duì)表達(dá)量分別為0.77±0.05、0.44±0.04、0.61±0.06，各干預(yù)組LX-2細(xì)胞miR-29b相對(duì)表達(dá)量較對(duì)照組下降(P<0.05)，TGF-β1和SB-525334共干預(yù)組LX-2細(xì)胞 miR-29b 的相對(duì)表達(dá)量較TGF-β1干預(yù)組低(P<0.05)，TGF-β1和SB-525334共干預(yù)組LX-2細(xì)胞miR-29b的相對(duì)表達(dá)量較SB-525334干預(yù)組高(P<0.05)。

討 論

急慢性肝臟損傷時(shí)，HSC活化、增殖，轉(zhuǎn)變?yōu)榧〕衫w維樣細(xì)胞，并分泌大量的α-SMA和細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，包括纖連蛋白和Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型膠原并具有收縮功能，從而導(dǎo)致纖維化的發(fā)生[5-7]。TGF-β1是HSC增殖強(qiáng)有力的刺激因子，本實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)TGF-β1可以明顯促進(jìn)細(xì)胞增殖，給予TGF-β1抑制劑SB-525334后HSC數(shù)目減少，增殖明顯受到抑制。SB-525334是一種強(qiáng)效小分子抑制劑，選擇性抑制TGF-β1受體，本研究中發(fā)現(xiàn)SB-525334隨著濃度升高對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用更加明顯，當(dāng)其濃度達(dá)到一定量后抑制作用稍有下降，因此SB-525334對(duì)HSC生長(zhǎng)主要起抑制作用。

肝臟庫(kù)普弗細(xì)胞刺激HSC活化時(shí)產(chǎn)生大量的TGF-β1[8]。肝纖維化時(shí)TGF-β1持續(xù)增加，激活Smad和MAPK信號(hào)通路，導(dǎo)致HSC分泌大量I型膠原。SB-525334是ALK5(TGF-β1 I型受體)的抑制劑，在腎臟RPTE細(xì)胞中可抑制Smad2/3的轉(zhuǎn)位抑制腎臟纖維化發(fā)生[9]。本研究中，單獨(dú)給予TGF-β1刺激的HSC的I型膠原蛋白表達(dá)明顯升高，與之前研究相符。之后，再給予TGF-β1的抑制劑SB-525334干預(yù)后，HSC的I型膠原蛋白表達(dá)則明顯降低，這表明SB-525334可通過抑制TGF-β1信號(hào)通路，抑制HSC細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生，進(jìn)而發(fā)揮抑制肝纖維化的作用。

研究表明，miR-19b在肝纖維化進(jìn)程中起重要作用。Lakner等[2]研究發(fā)現(xiàn)，miR-19b在活化的HSC中表達(dá)明顯下降，miR-19b過表達(dá)通過抑制其靶基因 TGF-βRII ，而阻斷 TGF-β信號(hào)通路，最終抑制I型膠原和α-SMA 表達(dá)。Sekiya等[10]研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染miR-29b前體可明顯減輕I型膠原和II型膠原mRNA的表達(dá)，并且明顯削弱HSC活化的基因如α-SMA、DDR2、FN1和PDGFR-β的表達(dá)。過表達(dá)miR-29b可使HSC處于靜止?fàn)顟B(tài)，使膠原表達(dá)降低并抑制細(xì)胞增殖。在本研究中，miR-19b和miR-29b在TGF-β1刺激LX-2細(xì)胞后表達(dá)明顯減少，與之前研究相符。本研究發(fā)現(xiàn)，SB-525334干預(yù)后的HSC miR-19b和miR-29b表達(dá)下降，與對(duì)腎纖維化的研究結(jié)果不符[4]。研究表明HSC中miR-29的表達(dá)下調(diào)是由PDGF-BB、TGF-β和炎癥信號(hào)通路如LPS和NF-κB信號(hào)通路共同調(diào)節(jié)[4]。在本實(shí)驗(yàn)中SB-525334抑制TGF-β1信號(hào)通路的同時(shí)，可能反應(yīng)性引起NF-κB信號(hào)通路激活，導(dǎo)致miR-19b和miR-29b表達(dá)下調(diào)，并抑制I型膠原的表達(dá)。

綜上所述，SB-525334可抑制HSC I型膠原的分泌，并下調(diào)miR-29b、miR-19b的表達(dá)。SB-525334作為TGF-β1新的小分子抑制劑，其作用機(jī)制仍需進(jìn)一步研究，在不同細(xì)胞，不同的藥物濃度和作用時(shí)間，可能會(huì)影響藥物作用的發(fā)揮，從而對(duì)不同基因的表達(dá)產(chǎn)生不同的影響。