齊驁穹，曾 莎，王燕新，廖圓圓，蔡 勇，楊具田

(西北民族大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730030)

細(xì)胞是一種通過大量不同性質(zhì)的相互協(xié)調(diào)機(jī)制完成自我復(fù)制和適應(yīng)外界環(huán)境改變等過程的個體，是生物體結(jié)構(gòu)與功能的基本單位[1]，理解細(xì)胞功能和細(xì)胞間信息交流是現(xiàn)代生物學(xué)的基本目標(biāo).DNA包含必要的遺傳信息，形成一個具有結(jié)構(gòu)性或功能性的有機(jī)大分子.中心法則描述了一個信息流，從DNA到RNA再到蛋白質(zhì).然而近年來的研究成果使得這一法則遭遇到了挑戰(zhàn)[2].表觀遺傳、剪接、非編碼RNAs(包括microRNAs，miRNAs和lncRNA)、蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction，PPI)和翻譯后修飾(Post-translational modification，PTM)等都說明了基因型對表型的影響并不是惟一的.蛋白質(zhì)作為細(xì)胞內(nèi)關(guān)鍵的功能實體，表達(dá)了細(xì)胞功能的主要信息，故對蛋白質(zhì)進(jìn)行全面的分析也是理解細(xì)胞功能和細(xì)胞間交流的重要途徑，這種研究方法被稱為蛋白質(zhì)組學(xué)[3].

1 蛋白質(zhì)組學(xué)

蛋白質(zhì)組是指一個基因組或一類細(xì)胞表達(dá)的蛋白質(zhì)總和[4].目前暫時定義為特定時空存在于細(xì)胞、組織、器官和有機(jī)體內(nèi)的全套蛋白質(zhì)[5].隨著蛋白質(zhì)組的提出，產(chǎn)生了蛋白質(zhì)組學(xué)，以蛋白質(zhì)作為研究對象，檢測細(xì)胞、組織或有機(jī)體內(nèi)全部蛋白質(zhì)的組成、蛋白質(zhì)的表達(dá)水平以及蛋白質(zhì)修飾，以了解PPI以及蛋白質(zhì)動態(tài)變化規(guī)律的學(xué)科[6].

蛋白質(zhì)組學(xué)作為后基因組時代的重要探究方法之一，受到了研究學(xué)者的關(guān)注.然而，蛋白質(zhì)組水平上收集數(shù)據(jù)的難度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于基因組水平和轉(zhuǎn)錄組水平上的數(shù)據(jù)收集.氨基酸作為組成蛋白質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)具有高度不同的理化性質(zhì)[7].此外，蛋白質(zhì)通過不同的剪接、多樣化修飾和復(fù)雜的降解所形成的巨大網(wǎng)絡(luò)體系，使蛋白質(zhì)的功能信號在這個高度發(fā)散的網(wǎng)絡(luò)體系中被進(jìn)一步放大.

通常，蛋白質(zhì)組學(xué)研究的第一步是從細(xì)胞、組織或體液中提取蛋白質(zhì)，并根據(jù)研究目的對樣品進(jìn)行預(yù)分離(例如離子交換色譜法)，然后用液質(zhì)聯(lián)用(Liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS)對這些組分進(jìn)行分離并進(jìn)行分析.其中根據(jù)選擇的肽段長度不同，通過串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行分段，再使用數(shù)據(jù)庫搜索引擎進(jìn)行輸入，以確定相應(yīng)的肽序列，最后分配的肽序列組裝成蛋白質(zhì)，對所獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計.通過搜索與隨機(jī)數(shù)據(jù)庫估算假陽性鑒定率推斷肽序列，從得到的MS譜圖直接檢測蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫的可用性.蛋白質(zhì)組學(xué)的研究步驟比較復(fù)雜，主要依靠三部分技術(shù)，分別為蛋白質(zhì)分離技術(shù)、蛋白質(zhì)鑒定技術(shù)及蛋白質(zhì)信息查詢技術(shù)[8].蛋白質(zhì)分離作為蛋白質(zhì)組學(xué)研究的核心，多采用雙向凝膠電泳技術(shù)(2D-PAGE)[9]，其原理是根據(jù)蛋白質(zhì)的等電點和相對分子質(zhì)量對蛋白進(jìn)行分離，這樣就能很好地溶解大量蛋白質(zhì)并進(jìn)行定量分析.分析發(fā)現(xiàn)其具有高通量、重復(fù)性好、敏感度高等優(yōu)點[10，11].而對于氨基酸組分分析，由Edman在20世紀(jì)50年代所創(chuàng)立的Edman降解法，可以檢測氨基酸N段序列，以檢測蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu).盡管Edman降解法測序能獲取較為精確的肽序列，但其試驗成本偏高，且測序速度偏慢.而另一種氨基酸組成分析法是根據(jù)差異蛋白質(zhì)所具備的特定氨基酸和空間構(gòu)造來鑒定蛋白質(zhì)序列.雖然成本較為低廉，但靈敏度不高，且需要大量蛋白質(zhì)或多肽樣品，在微量分析中會遇到極大限制，并且存在部分酸水解不徹底或某些氨基酸結(jié)構(gòu)出現(xiàn)缺失等缺點[12].為了更好地探究，質(zhì)譜技術(shù)在蛋白質(zhì)組學(xué)研究的過程中被普及.蛋白質(zhì)大分子先經(jīng)過離子轉(zhuǎn)化設(shè)備轉(zhuǎn)變?yōu)闅鈶B(tài)離子，接著在分析儀器中依據(jù)離子的質(zhì)荷比進(jìn)行分離.分離后的離子順次進(jìn)入檢測器，進(jìn)而取得不同質(zhì)荷比的譜線，即為質(zhì)譜技術(shù)[13].目前，常用的質(zhì)譜分析儀為基質(zhì)輔助激光解析離子化質(zhì)譜和電噴霧離子化質(zhì)譜[14].蛋白質(zhì)組學(xué)的研究還需要和生物信息學(xué)相結(jié)合.目前應(yīng)用于蛋白質(zhì)組學(xué)研究的數(shù)據(jù)庫有蛋白質(zhì)信息資源PIR、蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫SWISS-PROT、蛋白質(zhì)家族和結(jié)構(gòu)域數(shù)據(jù)庫PROSITE、蛋白質(zhì)序列指紋圖譜數(shù)據(jù)庫PRINTS、蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫PDB、蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫DSSP以及氨基酸索引數(shù)據(jù)庫(amino acid index)等.此外，現(xiàn)在還開發(fā)了多種iTRAQTM數(shù)據(jù)庫用于搜索和分析生物信息元件，其中MASCOT是目前應(yīng)用最為廣泛的搜索引擎軟件[15-16].

近年來，蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，特別是以質(zhì)譜為基礎(chǔ)的蛋白質(zhì)鑒定，通過儀器的更新?lián)Q代，樣品制備和計算分析技術(shù)的累積而日臻成熟，不僅體現(xiàn)在基礎(chǔ)理論的研究，也進(jìn)一步擴(kuò)展到應(yīng)用研究領(lǐng)域當(dāng)中[17].

2 蛋白質(zhì)組學(xué)在綿羊育種研究中的應(yīng)用

2.1 研究背景

全世界擁有不同生產(chǎn)性能的綿羊近600個品種，是一個豐富的基因儲藏庫，從短尾型綿羊、細(xì)長尾型到肥尾型，從細(xì)毛羊、半細(xì)毛羊到無絨毛羊，從專用品種到三種品質(zhì)兼而有之的新型品種，都擁有豐富的品種.大量的綿羊品種因為生產(chǎn)性能和基因特點的各不相同，不僅保證了養(yǎng)羊業(yè)產(chǎn)品的多樣性，還為育種工作提供了無盡的可能性，以達(dá)到改良現(xiàn)有品種的生產(chǎn)性能，培育多種優(yōu)良生產(chǎn)性能集于一身的新品種和具有新品質(zhì)的新品種.因此通過各種新興技術(shù)為綿羊育種工作提供新思路、新方法已經(jīng)成為畜牧業(yè)工作者和現(xiàn)代養(yǎng)羊業(yè)的重要課題[18].

2.2 綿羊育種方向

目前，綿羊育種研究主要包括羊肉品質(zhì)的提升、絨毛羊的產(chǎn)絨量和絨毛品質(zhì)的提升、公母羊生產(chǎn)力的提升以及一些羊副產(chǎn)品品質(zhì)的提升.

肉用羊肉品質(zhì)的改變主要分為兩個方面：脂肪沉積和肌肉發(fā)育.通過調(diào)控肌肉的生長發(fā)育和肌內(nèi)脂肪、肌間脂肪、內(nèi)臟脂肪和皮下脂肪的沉積，從而提升產(chǎn)肉量和改善羊肉品質(zhì).絨毛用羊則主要圍繞絨和毛的產(chǎn)量和品質(zhì)進(jìn)行選育，通過對毛囊細(xì)胞和組織的研究，從而改善絨和毛的生長情況，進(jìn)一步獲得符合生產(chǎn)需要的性能.繁殖力的提升主要圍繞提高公羊精子質(zhì)量和母羊受胎率進(jìn)行研究.

2.3 蛋白質(zhì)組學(xué)在綿羊育種的應(yīng)用

利用目前較為成熟的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，可以對綿羊育種在蛋白質(zhì)水平上進(jìn)行一系列新的研究.Bouley等[19]采用2-DE技術(shù)和質(zhì)譜技術(shù)完成了羊的半腿肌蛋白質(zhì)表達(dá)譜的構(gòu)建，檢測到500多個可重復(fù)的蛋白質(zhì)位點，然后又使用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜的方法鑒定了其中的129個蛋白質(zhì)位點.這些蛋白質(zhì)中，大部分涉及到代謝、細(xì)胞結(jié)構(gòu)、細(xì)胞免疫，并且肌鈣蛋白存在多種異構(gòu)體，這可能導(dǎo)致屠宰后的肌肉代謝和肉品質(zhì)發(fā)生改變.M.Hamelin[20]等用2-DE的方法對特塞爾綿羊肌肉肥大的遺傳性狀進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)在肌肉肥大型個體中，與糖酵解相關(guān)的蛋白質(zhì)表達(dá)量上調(diào)，轉(zhuǎn)鐵蛋白的表達(dá)量增加，而α-抗胰蛋白酶的表達(dá)量降低.這可能是兩種蛋白的相互作用，導(dǎo)致了肌肉肥大性狀的產(chǎn)生.Ana M等[21]研究了季節(jié)性減重對綿羊的影響，以便篩選出對季節(jié)性減重有較強(qiáng)抵抗力的品種.試驗選取三種澳洲本土綿羊，一共鑒定出668種蛋白質(zhì)，其中95種是差異調(diào)節(jié)蛋白.篩選出三種季節(jié)性減重抗性相關(guān)蛋白質(zhì)，對綿羊肉制品生產(chǎn)工程做出巨大貢獻(xiàn).Promeyrat等[22]發(fā)現(xiàn)了鐵蛋白和抗氧化性相關(guān)蛋白潛在，標(biāo)記著蛋白質(zhì)氧化的過程，并且簡述了白蛋白、氧化還原蛋白、膜聯(lián)蛋白、脂類轉(zhuǎn)運蛋白和有氧呼吸酶的作用，這項研究以蛋白質(zhì)氧化為重點，清楚地表明，在機(jī)體老化過程中，需要結(jié)合幾種標(biāo)記物來評估肉類對氧化的敏感性.Vincenzo Cunsolo等[23]通過比較研究發(fā)現(xiàn)，羊奶比牛奶更具有潛在過敏性.通過SDS-PAGE和LC-MS技術(shù)對羊奶中的乳脂蛋白進(jìn)行了研究，鑒定出718種與牛奶不同的蛋白質(zhì)成分，其中644種是綿羊所獨有的基因，其中193種蛋白質(zhì)是以前從未發(fā)現(xiàn)過的，包括具有健康促進(jìn)效益的異質(zhì)組分.MitraArianmanesh等[24]以單側(cè)妊娠母羊為研究對象，比較妊娠母羊不同階段子宮角功能蛋白的特異性表達(dá)差異.研究發(fā)現(xiàn)了EPCR蛋白質(zhì)，包括AHCY和HSP60表達(dá)量上調(diào)，表明這些蛋白質(zhì)的上調(diào)是為了提供更適宜妊娠母羊的子宮環(huán)境.WeiboRen等[25]以過度放牧和適當(dāng)放牧的綿羊為試驗對象，對其肝臟沉積脂肪進(jìn)行試驗，試驗用同位素標(biāo)記的相對定量和絕對定量(iTRAQ)方法分析羊的肝組織蛋白質(zhì)表達(dá)譜的差異，發(fā)現(xiàn)41種蛋白質(zhì)在兩個群體中的表達(dá)出現(xiàn)差異，大部分差異表達(dá)的蛋白質(zhì)參與蛋白質(zhì)代謝、轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)節(jié)與免疫應(yīng)答等過程.

脂尾型綿羊與生俱來的尾部富集脂肪，逐漸不符合產(chǎn)業(yè)化的生產(chǎn)需要，所以在育種工作中對其進(jìn)行趨向瘦尾化的改良已成為一種必然的趨勢.韓吉龍等[26]選取了五種尾型綿羊，并對尾部脂肪所檢測到的蛋白質(zhì)進(jìn)行了差異表達(dá)分析.實驗先對尾脂的總蛋白進(jìn)行了鑒定，通過Label-free，發(fā)現(xiàn)脂肪細(xì)胞分化及脂肪酸合成相關(guān)的蛋白質(zhì)在脂尾型綿羊中高表達(dá).同樣高表達(dá)的還有參與脂肪代謝和解脂相關(guān)的蛋白質(zhì).通過蛋白質(zhì)表達(dá)定位發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ABP4和ERK2在尾脂中的表達(dá)量較高.前者參與前體脂肪細(xì)胞分化過程和脂肪酸的轉(zhuǎn)運功能，而后者可能與幼齡個體中早期脂肪組織中前體脂肪細(xì)胞增殖和分化相關(guān)聯(lián).這表明，以FABP4、ERK2為主的蛋白質(zhì)對于脂尾型綿羊早期尾部脂肪的發(fā)育具有重要影響.同時他們還對早期尾脂中所鑒定到的蛋白質(zhì)進(jìn)行了磷酸化蛋白質(zhì)檢測，鑒定出了分布在804個具有磷酸化修飾蛋白質(zhì)上的1493個磷酸化位點.其中435個磷酸化差異表達(dá)蛋白參與細(xì)胞骨架的合成、PTM過程的正調(diào)控、蛋白質(zhì)分解代謝調(diào)控、翻譯起始和細(xì)胞凋亡通路調(diào)控等15個生物學(xué)進(jìn)程，顯示出不同脂尾型綿羊的早期尾部脂肪發(fā)育與磷酸化修飾差異存在一定的相關(guān)性，其中以ERK1和ERK2為主的蛋白類激酶經(jīng)過序列分析，發(fā)現(xiàn)可能調(diào)節(jié)早期尾部脂肪中相關(guān)蛋白質(zhì)的磷酸化修飾，并對尾脂中前體脂肪細(xì)胞增殖分化有正向調(diào)控作用.

蛋白質(zhì)組學(xué)對綿羊育種行業(yè)起到了重大作用，它的出現(xiàn)大大推動了分子育種的發(fā)展.蛋白質(zhì)組學(xué)不僅可以在蛋白質(zhì)水平上對綿羊的各種生產(chǎn)性能進(jìn)行創(chuàng)新型的研究，還能對前人在綿羊基因組和轉(zhuǎn)錄組得到的結(jié)果進(jìn)行一系列的驗證，以保證研究的準(zhǔn)確性.所以蛋白質(zhì)組學(xué)的出現(xiàn)對于綿羊育種來說具有革命性的意義.

3 展望

蛋白質(zhì)組學(xué)作為21世紀(jì)生命科學(xué)的重要技術(shù)和主要研究方向[27]，其技術(shù)已經(jīng)被廣泛地應(yīng)用于與生命科學(xué)相關(guān)的各個領(lǐng)域，也為生命科學(xué)及其相關(guān)學(xué)科帶來了新的研究方法和理念[28].隨著蛋白質(zhì)組學(xué)研究的深入，與蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)相結(jié)合的畜牧行業(yè)前景更加寬廣，它將是人們深入研究改良羊肉品質(zhì)、選育優(yōu)良品種、提高繁殖性能和通過飼料加速生長的新途徑，也為廣大畜牧業(yè)工作者指明了新的道路.