閆永鑫，徐寧，王國(guó)鳳*

甲狀腺結(jié)節(jié)的發(fā)病率逐年升高，總發(fā)病率為19%～46%，其中惡性結(jié)節(jié)占5.0%～15.0%，超聲引導(dǎo)下甲狀腺細(xì)針穿刺活檢（US-FNAB）聯(lián)合病理學(xué)檢查是篩查和早期診斷甲狀腺癌的有效方法，但仍存在一部分無(wú)法確診的病例［1]。而這部分無(wú)法確診的甲狀腺結(jié)節(jié)患者術(shù)后多為良性，惡性率僅占1.7%～11.3%［2]。因此，為避免增加此類患者的手術(shù)風(fēng)險(xiǎn)及經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，積極尋找可靠、可行的檢測(cè)指標(biāo)來(lái)鑒別甲狀腺結(jié)節(jié)的良惡性以及評(píng)估其惡性程度是目前甲狀腺結(jié)節(jié)研究中迫切需要解決的問(wèn)題。為提高甲狀腺術(shù)前診斷的準(zhǔn)確性，近年來(lái)許多研究聚焦于早期診斷預(yù)警指標(biāo)，其中微小RNA（miRNAs）是研究的熱點(diǎn)之一［3-4]。已有研究發(fā)現(xiàn)，miRNAs表達(dá)水平有助于提高術(shù)前診斷率及評(píng)估腫瘤惡性程度等［5]?？蓪⒛[瘤組織中異常表達(dá)的miRNAs作為甲狀腺乳頭狀癌的新型腫瘤標(biāo)志物，但獲取組織標(biāo)本具有較大創(chuàng)傷性，同時(shí)術(shù)后常規(guī)標(biāo)本檢測(cè)miRNAs常具有滯后性［6]。因此，國(guó)內(nèi)外學(xué)者開(kāi)始關(guān)注外周血和細(xì)針穿刺吸取細(xì)胞學(xué)（FNAC）檢查中miRNAs在甲狀腺結(jié)節(jié)診斷中的價(jià)值［7-9]。為進(jìn)一步探討miRNAs作為早期診斷甲狀腺癌生物學(xué)標(biāo)志物的可行性，本研究觀察甲狀腺FNAC檢查標(biāo)本中miR-221、miR-222表達(dá)水平，并分析其對(duì)甲狀腺結(jié)節(jié)的診斷價(jià)值，以期明確甲狀腺FNAC檢查標(biāo)本中miR-221、miR-222表達(dá)水平的分子學(xué)價(jià)值。

國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)研究現(xiàn)狀：

已有研究發(fā)現(xiàn)，微小RNA（miRNAs）表達(dá)水平有助于提高術(shù)前診斷率及評(píng)估腫瘤惡性程度等，但獲取組織標(biāo)本具有較大創(chuàng)傷性，而術(shù)后常規(guī)標(biāo)本檢測(cè)miRNAs則常具有滯后性。因此，國(guó)內(nèi)外學(xué)者開(kāi)始關(guān)注外周血和細(xì)針穿刺miRNAs在甲狀腺結(jié)節(jié)診斷中的價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2015年3月—2017年12月就診于南京醫(yī)科大學(xué)康達(dá)學(xué)院第一附屬醫(yī)院符合研究標(biāo)準(zhǔn)的甲狀腺結(jié)節(jié)患者60例。排除標(biāo)準(zhǔn)：冠心病、高血壓、糖尿病、腎病、自身免疫疾病、凝血功能障礙者。患者均經(jīng)甲狀腺FNAC檢查，并依據(jù)甲狀腺FNAB的細(xì)胞學(xué)分類（貝塞斯達(dá)系統(tǒng)）［10]得出惡性病變17例，良性病變34例，可疑惡性、未診斷病變5例，2例濾泡性病變，2例濾泡性腫瘤。本研究經(jīng)連云港市第一人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者均對(duì)本研究知情同意并簽署知情同意書(shū)。

1.2 方法

1.2.1 一般資料收集 收集患者性別、年齡、腫瘤最大直徑、病灶數(shù)量、包膜侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期情況。

1.2.2 甲狀腺FNAC檢查 患者均在超聲引導(dǎo)下行FNAB檢查，對(duì)于多發(fā)結(jié)節(jié)，選擇超聲惡性征象最多的結(jié)節(jié)為穿刺結(jié)節(jié)，采用10 ml細(xì)針穿刺負(fù)壓吸引器連接7號(hào)針頭進(jìn)行抽吸，并將抽吸物注于載玻片上進(jìn)行檢測(cè)。注射器內(nèi)剩余的穿刺物用0.9%氯化鈉溶液反復(fù)洗滌后置于離心管中，1600 r/min離心30 min（離心半徑8 cm）后棄上清液，將700 μl Qizol加入細(xì)胞中混勻，置于-80 ℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

FNAB檢查結(jié)果參照美國(guó)國(guó)家癌癥研究提出的貝塞斯達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行診斷［10]。

1.2.3 PCR法檢測(cè)miR-221、miR-221表達(dá)水平 將冰箱凍存?zhèn)溆玫募?xì)胞液取出，參照陳曉敏等［9]的具體操作方法，采用PCR法檢測(cè)miR-221、miR-221表達(dá)水平。采用2-ΔΔCt法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.4 金標(biāo)準(zhǔn) 以甲狀腺術(shù)后病理檢查結(jié)果為診斷良、惡性甲狀腺結(jié)節(jié)的金標(biāo)準(zhǔn)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 24.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析數(shù)據(jù)分析。所有統(tǒng)計(jì)學(xué)指標(biāo)經(jīng)過(guò)正態(tài)性檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以（±s）表示，兩組間比較采用成組t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以相對(duì)數(shù)表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；繪制甲狀腺FNAC檢查標(biāo)本中miR-221、miR-222診斷惡性甲狀腺結(jié)節(jié)的受試者工作特征曲線（ROC曲線），并計(jì)算ROC曲線下面積（AUC）、靈敏度、特異度、約登指數(shù)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 患者甲狀腺術(shù)后病理結(jié)果 60例患者經(jīng)甲狀腺術(shù)后病理檢查示，良性結(jié)節(jié)51例，惡性結(jié)節(jié)9例。

2.2 良性結(jié)節(jié)與惡性結(jié)節(jié)患者FANC檢查中miR-221、miR-222表達(dá)水平比較 惡性結(jié)節(jié)患者FANC檢查中miR-221、miR-222表達(dá)水平高于良性結(jié)節(jié)患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，見(jiàn)表1）。

表1 良性結(jié)節(jié)與惡性結(jié)節(jié)患者甲狀腺FANC檢查中miR-221、miR-222表達(dá)水平比較（±s）Table 1 Comparison of the expression levels of miR-221 and miR-222 in FANC with benign and malignant thyriod nodules

表1 良性結(jié)節(jié)與惡性結(jié)節(jié)患者甲狀腺FANC檢查中miR-221、miR-222表達(dá)水平比較（±s）Table 1 Comparison of the expression levels of miR-221 and miR-222 in FANC with benign and malignant thyriod nodules

分類 例數(shù) miR-221 miR-222惡性結(jié)節(jié) 483.33±0.933.42±0.84良性結(jié)節(jié) 92.54±0.432.63±0.05 t值 5.906.41 P 值 ＜0.01 ＜0.01

2.3 甲狀腺FNAC檢查標(biāo)本中miR-221、miR-222對(duì)甲狀腺惡性結(jié)節(jié)的診斷價(jià)值 甲狀腺FNAC檢查標(biāo)本中miR-221診斷甲狀腺惡性結(jié)節(jié)的AUC為0.774（0.691，0.858），其最佳截?cái)嘀禐?.77，靈敏度為80.0%，特異度為60.0%，約登指數(shù)為0.400。甲狀腺FNAC檢查標(biāo)本中miR-222診斷甲狀腺惡性結(jié)節(jié)的AUC為0.759（0.672，0.845），其最佳截?cái)嘀禐?.73，靈敏度為76.7%，特異度為66.7%，約登指數(shù)為0.44（見(jiàn)圖1）。

圖1 甲狀腺FNAC檢查標(biāo)本中miR-221、miR-222診斷惡性甲狀腺結(jié)節(jié)的ROC曲線Figure 1 ROC curves of miR-221 and miR-222 in thyroid nodule FNAC examination specimens for diagnosis of malignant thyroid nodules

2.4 甲狀腺FNAC檢查結(jié)果聯(lián)合甲狀腺FNAC檢查標(biāo)本中miR-221、miR-222診斷甲狀腺結(jié)節(jié)的符合率 術(shù)后病理檢查結(jié)果良性51例、惡性9例。甲狀腺FNAC檢查結(jié)果聯(lián)合甲狀腺FNAC檢查標(biāo)本中miR-221、miR-222診斷甲狀腺結(jié)節(jié)的符合率均在70.0%以上，其中甲狀腺FNAC檢查結(jié)果聯(lián)合甲狀腺FNAC檢查標(biāo)本中miR-221、miR-222診斷甲狀腺結(jié)節(jié)與術(shù)后病理檢查結(jié)果的符合率為80.0%（見(jiàn)表2）。

表2 甲狀腺FNAC檢查結(jié)果、甲狀腺FNAC檢查標(biāo)本中miR-221及miR-222單獨(dú)與聯(lián)合診斷甲狀腺結(jié)節(jié)的符合率情況Table 2 Independent or combined diagnostic coincidence rate of thyriod nodules FNAC result，miR-221 and miR-222 in thyriod nodules FNAC specimens for thyroid nodules

2.5 不同患者miR-221、miR-222表達(dá)水平比較 不同性別、年齡、腫瘤最大徑、病灶數(shù)量、包膜侵犯情況、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、TNM分期患者miR-221、miR-222表達(dá)水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，見(jiàn)表3）。

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)miRNA與人類多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，且在腫瘤的基因診斷、靶向治療等方面起到了重要作用［3-5]。miR-221與miR-222是成簇的microRNAs，基因位于X染色體P11.3區(qū)約1 kb的區(qū)域內(nèi)，呈同步表達(dá)，其序列在各物種間高度保守。miR-221和miR-222可以抑制細(xì)胞周期依賴性蛋白激酶抑制劑p27kipl的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞從G1期向S期的轉(zhuǎn)變，進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。miR-221可通過(guò)調(diào)節(jié)HOXB5基因的表達(dá)抑制細(xì)胞凋亡，高表達(dá)的miR-221和miR-222作用于關(guān)鍵靶基因成為甲狀腺癌癌變的關(guān)鍵因素［11-18]。研究證明，miR-221和miR-222在PTC、濾泡性乳頭狀癌、濾泡性腫瘤、甲狀腺濾泡性腺瘤中的表達(dá)升高［14]。且值得注意的是，miR-221與miR-222是在PTC中高表達(dá)最恒定的miRNA，在未分化甲狀腺癌（ATC）中也明顯上調(diào)，而在濾泡性腺瘤與增生性結(jié)節(jié)中卻沒(méi)有發(fā)現(xiàn)上調(diào)［15]。因此，miR-221、miR-222在甲狀腺癌組織中具有特異性表達(dá)，組織標(biāo)本中的miRNAs異常表達(dá)可用于對(duì)甲狀腺結(jié)節(jié)的早期篩查和診斷。

表3 不同患者miR-221、miR-222表達(dá)水平比較（±s）Table 3 Comparison of the levels of miR-221，miR-222in different patients

表3 不同患者miR-221、miR-222表達(dá)水平比較（±s）Table 3 Comparison of the levels of miR-221，miR-222in different patients

項(xiàng)目 例數(shù) miR-221 t值 P值 miR-222 t值 P值性別男 273.16±1.241.19 ＞0.053.05±0.861.04 ＞0.05女 332.98±2.032.78±0.75年齡（歲）＜45293.89±1.021.10 ＞0.053.02±0.711.02 ＞0.05≥45312.87±1.892.56±0.79腫瘤最大直徑（cm）＜1 283.02±1.121.46 ＞0.051.98±0.76-1.47 ＞0.05≥1323.01±0.983.40±1.86病灶數(shù)量單發(fā) 322.98±1.23 -0.93 ＞0.053.41±1.280.94 ＞0.05多發(fā) 283.12±1.082.11±0.66包膜侵犯否 343.67±2.320.42 ＞0.052.18±0.78-0.38 ＞0.05是 262.79±0.763.53±1.32淋巴接轉(zhuǎn)移否 333.12±2.130.59 ＞0.052.13±0.46-0.29 ＞0.05是 272.65±1.563.62±2.12 TNM分期Ⅰ+Ⅱ 353.79±1.031.93 ＞0.052.45±0.62-0.11 ＞0.05Ⅲ+Ⅳ 252.74±2.023.62±1.48

雖然腫瘤組織中的miRNAs可以作為一種新的、有前景的腫瘤標(biāo)志物，但是，為了獲得腫瘤組織的miRNAs，進(jìn)行有創(chuàng)手術(shù)顯然不適用于廣泛的臨床應(yīng)用，而甲狀腺FNAC可以改善這種情況，其微創(chuàng)獲取標(biāo)本，或許可以為早期診斷提供幫助。已有研究表明，甲狀腺FNAC檢查標(biāo)本中miRNA或許在甲狀腺腫瘤診斷中具有潛在的應(yīng)用價(jià)值［19-21]。為此，本研究通過(guò)甲狀腺FNAC檢查獲取標(biāo)本，采用PCR法檢測(cè)標(biāo)本中miR-221、miR-222表達(dá)水平，并探討其是否可作為診斷甲狀腺癌的分子生物標(biāo)志物。本研究結(jié)果顯示，惡性甲狀腺結(jié)節(jié)患者甲狀腺FNAC檢查標(biāo)本中miR-221、miR-222表達(dá)水平明顯高于良性結(jié)節(jié)患者，但繪制ROC發(fā)現(xiàn)，二者分別診斷惡性甲狀腺結(jié)節(jié)的靈敏度和特異度并未超過(guò)95%，提示單獨(dú)的miR-221、miR-222尚不能用于作為診斷惡性甲狀腺結(jié)節(jié)的生物學(xué)標(biāo)志物。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，甲狀腺FNAC檢查聯(lián)合miR-221、miR-222可以提高對(duì)甲狀腺結(jié)節(jié)診斷的符合率。但本研究仍存在樣本量有限等不足，因此結(jié)果的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值有待于更大樣本的多中心研究進(jìn)一步證實(shí)。

綜上所述，惡性甲狀腺患者甲狀腺FNAC檢查標(biāo)本中miR-221、miR-222表達(dá)水平明顯升高，其目前不適于單獨(dú)鑒別良惡性甲狀腺結(jié)節(jié)，但聯(lián)合甲狀腺FNAC檢查結(jié)果可以提高對(duì)良惡性甲狀腺結(jié)節(jié)的診斷效能。