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        丹參川芎嗪注射液對膿毒癥幼鼠急性肝損傷保護作用的研究?

        2019-10-09 02:41:08梅貴春武麗華謝玉秀
        中國中醫(yī)急癥 2019年9期
        關(guān)鍵詞:幼鼠川芎嗪丹參

        肖 雷 梅貴春 武麗華 謝玉秀

        (湖北省武漢市漢陽醫(yī)院,湖北 武漢 430000)

        膿毒癥是新生兒及兒科重癥監(jiān)護病房中常見的危急重癥。據(jù)報道,在所有膿毒癥死亡患者中,新生兒及兒童膿毒癥死亡率占比高達70%[1]。膿毒癥常累及肝臟,造成急性肝損傷,是膿毒癥死亡的危險因素之一[2]。因此減輕膿毒癥致急性肝損傷對改善患者預(yù)后具有重要意義。氧化應(yīng)激失衡是膿毒癥致急性肝損傷的重要機制之一。核轉(zhuǎn)錄因子E2相關(guān)因子2(Nrf2)是調(diào)控細胞抗氧化能力的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子,氧化應(yīng)激狀態(tài)下,可與抗氧化物元件(ARE)結(jié)合激活下游血紅素氧化酶1(HO-1)、超氧化物歧化酶(SOD)等抗氧化酶基因表達,增強細胞抗氧化能力[3]。目前已成為肝臟疾病治療的潛在靶點。丹參川芎嗪注射液的主要組分是丹參素和鹽酸川芎嗪,其中鹽酸川芎嗪具有抗氧化、抗纖維化、改善微循環(huán)等作用。已有研究報道,丹參川芎嗪注射液可通過減輕炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激水平對慢性阻塞性肺疾病致肺功能損傷、慢性腎衰竭等輔助治療起積極作用[4-5]。但其對膿毒癥致急性肝功能損傷的作用尚不清楚。本研究建立膿毒癥幼鼠模型,觀察丹參川芎嗪注射液對膿毒癥幼鼠急性肝損傷的保護作用及其可能機制?,F(xiàn)報告如下。

        1 材料與方法

        1.1 實驗動物 36只SD幼鼠,SPF級,4周齡,體質(zhì)量80~100 g,雌雄各18只,由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供,許可證號:SCXK(湘)2011-0003。飼養(yǎng)條件:溫度20~25℃,相對濕度50%~60%,光照12 h,自由飲食。

        1.2 試藥與儀器 1)試藥:丹參川芎嗪注射液(貴州拜特制藥有限公司,批號H52020959,規(guī)格:5 mL/支,每支加入250 mL 0.9%氯化鈉溶液稀釋),脂多糖(lipopolysaccharide,LPS,Sigma公司,批號:1010A032,純度≥99%);二甲苯、檸檬酸緩沖液(上海阿拉丁生化科技股份有限公司);蘇木精-伊紅染色液(北京索萊寶科技有限公司);丙二醛(MDA)檢測試劑盒(TBA比色法)、谷胱甘肽檢測試劑盒、SOD活力檢測試劑盒和BCA蛋白定量分析試劑盒(Sigma公司);Trizol試劑、RIPA裂解液(Invitrogen公司);鼠抗人Nrf2單克隆抗體、鼠抗人HO-1單克隆抗體和β-actin抗體(Abcam公司);ECL化學(xué)發(fā)光液(上?;鄯f生物科技有限公司)。2)儀器:XZ-5A低速醫(yī)用離心機(長沙湘智離心機儀器有限公司);邁瑞B(yǎng)S-490型全自動生化分析儀(深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司);Leica DM1000顯微鏡(德國徠卡);IKA T10型組織勻漿機(廣州艾卡儀器設(shè)備有限公司);Tanon 4800全自動化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)(上海天能科技有限公司);2400型PCR儀(Perkin Elmer公司);7300型實時定量PCR儀(ABI公司)。

        1.3 選模及給藥 36只幼鼠隨機分為3組:對照組、模型組、丹參川芎嗪注射液組,各12只。對照組幼鼠給予腹腔注射10 mg/kg 0.9%氯化鈉注射液,正常條件飼養(yǎng)。模型組及丹參川芎嗪注射液組給予腹腔注射LPS 10 mg/kg建立膿毒癥幼鼠模型[6],幼鼠常規(guī)飼養(yǎng)1周后,模型制備前12 h禁食,自由飲水,采用0.2 mL/100 g戊巴比妥鈉2%進行腹腔內(nèi)注射麻醉,麻醉后固定,并在無菌條件下沿腹中線切1 cm切口,并將盲腸和腸系膜游離出,并結(jié)扎盲腸根部,并采用14號針在結(jié)扎處遠端進行貫穿盲腸4次,術(shù)中避免刺穿回腸和盲腸系膜血管,之后將盲腸送入腹腔,并逐層縫合腹壁切口,術(shù)前30 min及1 h后腹腔注射0.9%氯化鈉注射液溶液5 mL,正常條件飼養(yǎng)。丹參川芎嗪注射液組在造模前30 min及造模1 h后腹腔注射丹參川芎嗪注射液5 mL,正常條件飼養(yǎng)。

        1.4 樣本采集 于建模后6、12 h分別各采集每組6只幼鼠麻醉后取下腔靜脈血后處死取肝組織,全血在室溫下靜置1 h后,使用XZ-5A低速醫(yī)用離心機,3000 r/min離心10 min,取上清液保存于超低溫冰箱。肝組織樣品一部分用4%多聚甲醇固定以進行組織病理學(xué)觀察,一部分用于制作組織勻漿以檢測氧化活性物質(zhì),另取肝組織樣品在液氮中速凍保存。

        1.5 觀察指標 1)血清生化指標檢測:取保存血清樣品,使用邁瑞B(yǎng)S-490型全自動生化分析儀(邁瑞醫(yī)療)及其配套試劑,分析血清中谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(GOT)和乳酸脫氫酶(LDH)水平。2)肝組織病理學(xué)形態(tài)觀察:肝組織使用4%多聚甲醇固定24 h后,取出蒸餾水沖洗3次,使用50%、70%、80%、95%、100%梯度酒精脫水,加入二甲苯溶液透明30 min,重復(fù)透明1次,將組織浸入石蠟進行包埋,切成4 μm切片,放入恒溫烘箱中烘烤2 h。分別使用二甲苯、酒精進行脫蠟、水化,然后加入蘇木精染色7 min,PBS沖洗后加入伊紅復(fù)染10 s,PBS沖洗切片,分別使用酒精、二甲苯脫水、透明,使用中性樹膠封片,在Leica DM1000顯微鏡(德國徠卡)下觀察組織形態(tài)學(xué)變化。3)肝組織氧化應(yīng)激相關(guān)指標檢測:取肝組織,用0.9%氯化鈉注射液沖洗掉血液,濾紙吸干水分,稱取適量肝組織加入離心管中,按組織質(zhì)量∶0.9%氯化鈉注射液體積=1∶9加入預(yù)冷0.9%氯化鈉注射液,使用IKA T10型組織勻漿機(廣州艾卡儀器設(shè)備有限公司)制成10%肝組織勻漿液。組織中MDA、谷胱甘肽(GSH)水平及SOD、谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶(GST)活性和蛋白定量使用試劑盒檢測,檢測方法嚴格參照說明書進行。4)肝組織Nrf2、HO-1 mRNA表達檢測:取肝組織樣品,加液氮研磨,加入Trizol試劑提取總RNA,逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,進行實時熒光定量PCR(qRT-PCR),以β-actin為內(nèi)參檢測組織中Nrf2、HO-1 mRNA相對表達量。qRT-PCR程序:95℃預(yù)變性30 s;95℃變性5 s,60/58℃退火30 s,72℃延伸30 s,共40個循環(huán)。Nrf2引物序列:上游5′-CCATTTGTAGATGACCATGAGTCGCA-3′,下 游 5′-ATCAGGGGTGGTGAAGACTG-3′;HO-1引物序列:上游 5′-TGCAGGTGATGCTGACAGAGG-3′,下 游 5′-GGGATGAGCTAGTGCTGATCTGG-3′。 Nrf2、HO-1 mRNA相對表達量采用2-ΔΔCT法計算。5)肝組織Nrf2、HO-1蛋白表達檢測:取肝組織樣品,加液氮研磨,加入RIPA裂解液提取組織總蛋白,檢測蛋白濃度,以等質(zhì)量蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳,分離目的蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜(NC膜),室溫下5%脫脂奶粉封閉1 h。分別加入按1∶500比例稀釋的鼠抗人Nrf2單克隆抗體、鼠抗人HO-1單克隆抗體和β-actin內(nèi)參抗體,4℃孵育過夜,再加入按1∶1000比例稀釋的兔抗鼠βactin抗體、辣根過氧化物酶標記山羊抗兔二抗,室溫孵育1 h,TBST溶液沖洗3次。加入ECL化學(xué)發(fā)光液中顯色,使用Tanon 4800全自動化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)進行拍照,Image J軟件分析條帶灰度值。

        1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計軟件。計量資料以(±s)表示,多組比較采用方差分析檢驗,進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗,計數(shù)資料用百分數(shù)表示,行χ2檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        2.1 各組肝組織病理學(xué)改變 見圖1。對照組肝細胞以中央靜脈為中心呈放射狀排列,形態(tài)正常,結(jié)構(gòu)完整無病理改變。模型組6 h時肝細胞出現(xiàn)水腫、少量壞死,12 h時水腫加重,部分肝細胞顆粒變性,細胞排列紊亂。丹參川芎嗪注射液組6、12 h肝細胞水腫、壞死、顆粒變性與模型組比較明顯減輕。

        圖1 各組肝組織病理學(xué)形態(tài)(HE染色,200倍)

        2.2 各組血清生化指標比較 見表1。與對照組比較,不同時間點模型組血清AST、GOT和LDH水平均升高(P<0.05);與模型組比較,不同時間點丹參川芎嗪注射液組血清AST、GOT和LDH水平降低(P<0.05);不同時間點,丹參川芎嗪注射液組血清AST、GOT和LDH水平高于對照組(P<0.05)。

        表1 各組不同時間點血清AST、GOT和LDH水平比較(U/L,±s)

        表1 各組不同時間點血清AST、GOT和LDH水平比較(U/L,±s)

        與對照組同時期比較,?P<0.05;與模型組同時期比較,△P<0.05。下同

        組別LDH時間AST GOT 226.65±25.47229.14±20.98458.67±30.16*538.94±34.09*316.53±19.82*△397.84±22.71*△對照組(n=12)模型組(n=12)丹參川芎嗪注射液組(n=12)6 h 12 h 6 h 12 h 6 h 12 h 72.34±15.2673.33±14.85352.68±21.52*407.83±29.67*169.56±27.71*△201.94±26.96*△55.37±9.8857.03±8.9399.83±16.96*118.93±16.96*68.74±12.58*△78.61±9.75*△

        2.3 各組肝組織生化指標水平比較 見表2。與對照組比較,不同時間點模型組肝組織總MDA水平均升高(P<0.05),GSH水平降低(P<0.05),SOD和GST活性降低(P<0.05);與模型組比較,不同時間點丹參川芎嗪注射液組肝組織中MDA水平均降低(P<0.05),GSH水平升高(P<0.05),SOD和GST活性升高(P<0.05);不同時間點,丹參川芎嗪注射液組MDA水平高于對照組(P<0.05),SOD、GSH、GST與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

        表2 各組肝組織中MDA、SOD、GSH、GST水平比較(±s)

        表2 各組肝組織中MDA、SOD、GSH、GST水平比較(±s)

        組 別 時間MDA(nmol/mg)SOD(U/mg)GSH(mg/g)GST(U/mg)75.39±6.1477.14±5.8248.92±3.38*39.26±4.46*67.83±5.17△58.19±5.24△1.77±0.281.71±0.243.02±0.36*5.17±0.42*2.14±0.41*△3.03±0.58*△6 h 12 h 6 h 12 h 6 h 12 h對照組(n=12)模型組(n=12)丹參川芎嗪注射液組(n=12)7.92±2.148.04±1.964.83±1.35*3.66±0.99*7.11±1.82△6.79±1.27△118.92±16.75120.39±19.8279.68±20.39*83.67±14.95*95.42±15.57△111.62±13.24△

        2.4 各組肝組織Nrf2、HO-1 mRNA表達水平比較見表3。6、12 h,模型組和丹參川芎嗪注射液組肝組織中Nrf2、HO-1 mRNA相對表達量均高于對照組(P<0.05),丹參川芎嗪注射液組肝組織中Nrf2、HO-1 mRNA相對表達量均高于模型組(P<0.05)。

        表3 各組肝組織中Nrf2、NO-1 mRNA相對表達量比較(±s)

        表3 各組肝組織中Nrf2、NO-1 mRNA相對表達量比較(±s)

        組別對照組(n=12)模型組(n=12)丹參川芎嗪注射液組(n=12)時間6 h 12 h 6 h 12 h 6 h 12 h Nrf2 mRNA相對表達量0.98±0.180.96±0.191.56±0.19*1.74±0.21*2.67±0.22*△3.02±0.34*△HO-1 mRNA相對表達量2.03±0.542.12±0.612.89±0.67*3.36±0.72*3.48±0.72*△4.19±0.81*△

        2.5 各組肝組織Nrf2、HO-1蛋白表達比較 見圖2,表4。6 h、12 h,模型組和丹參川芎嗪注射液組肝組織中Nrf2、HO-1蛋白相對表達量均高于對照組(P<0.05),丹參川芎嗪注射液組肝組織中Nrf2、HO-1蛋白相對表達量均高于模型組(P<0.05)。

        圖2 肝組織中Nrf2、HO-1蛋白表達水平檢測

        表3 各組肝組織中Nrf2、HO-1蛋白表達水平比較(±s)

        表3 各組肝組織中Nrf2、HO-1蛋白表達水平比較(±s)

        組別對照組(n=12)模型組(n=12)丹參川芎嗪注射液組(n=12)時間6 h 12 h 6 h 12 h 6 h 12 h Nrf2蛋白表達水平0.84±0.130.86±0.141.11±0.19*1.34±0.21*2.12±0.24*△2.33±0.32*△HO-1蛋白表達水平1.02±0.161.09±0.151.08±0.19*1.21±0.18*2.21±0.22*△2.85±0.24*△

        3 討論

        膿毒癥引起的多器官功能障礙是患者死亡的主要原因,急性肝損傷可發(fā)生在膿毒癥的任何階段且對膿毒癥病情發(fā)展具有重要影響[7]。膿毒癥致急性肝損傷的機制目前尚不完全清楚,多認為與氧自由基損傷、過度炎性反應(yīng)、氧供需失衡等有關(guān)[8-9]。本研究通過腹腔注射LPS建立膿毒癥幼鼠模型,給予丹參川芎嗪注射液干預(yù)治療,肝組織病理學(xué)檢查結(jié)果說明丹參川芎嗪注射液能夠緩解模型幼鼠肝功能損傷,對膿毒癥致急性肝功能損傷起保護作用。觀察造模后6 h和12 h各組幼鼠血清中肝功能指標,結(jié)果模型組血清AST、ALT和LDH水平均高于對照組,但丹參川芎嗪注射液組血清AST、GOT和LDH水平較模型組降低,說明丹參川芎嗪注射液組肝功能損傷程度明顯降低,證實丹參川芎嗪注射液的肝組織保護作用。

        膿毒癥發(fā)生及進展過程中,肝臟巨噬細胞在吞噬和清楚病原體的同時會釋放大量炎性因子、活性氧自由基等,引起氧化應(yīng)激而損傷肝組織[10-11]。川芎嗪屬酰胺類生物堿,臨床研究表明,其藥理作用有降低氧自由基水平、免疫調(diào)節(jié)功能、鈣拮抗、抗凝等[12]。本研究模型組肝組織中MDA水平明顯高于對照組,而GSH水平和SOD、GST活性均明顯低于對照組,說明膿毒癥引起幼鼠肝組織脂質(zhì)過氧化反應(yīng)增強,抗氧化能力減弱。而與模型組比較,丹參川芎嗪注射液組肝組織中MDA水平明顯降低,GSH水平和SOD、GST活性明顯升高,說明丹參川芎嗪注射液能夠增強肝組織抗氧化能力。

        Nrf2是真核生物氧化還原活性因子,主要參與調(diào)控生物體細胞氧化還原平衡及保護性抗氧化和Ⅱ期解毒反應(yīng)[13-14]。正常生理條件下,Nrf2在胞質(zhì)中與Keap1蛋白結(jié)合而被泛素化和降解,但在氧化應(yīng)激條件下,Nrf2依賴的細胞防御機制被激活,Nrf2與Keap1解偶聯(lián)并迅速移位到細胞核,與ARE結(jié)合,激活HO-1、SOD、GST等基因轉(zhuǎn)錄,最終影響細胞氧化狀態(tài),增強細胞抗氧化能力[15-16]。研究表明,Nrf2/HO-1信號通路在生物體抵抗各種外來刺激產(chǎn)生的氧化應(yīng)激損傷中起重要作用,是生物體內(nèi)最重要的內(nèi)源性抗氧化信號通路[17]。本研究結(jié)果,模型組肝組織中Nrf2、HO-1 mRNA和蛋白表達量均高于對照組,而丹參川芎嗪注射液組肝組織中Nrf2、HO-1 mRNA和蛋白表達量均明顯高于模型組,提示丹參川芎嗪注射液增加肝組織抗氧化能力,可能是通過激活Nrf2/HO-1通路實現(xiàn)的。但模型組Nrf2、HO-1表達升高是否也參與肝組織氧化損傷有待進一步探討。此外,Zheng等研究報道,丹參川芎嗪注射液能夠抑制人肝星狀細胞LX-2增殖,在抑制肝纖維化中起作用[18]。提示丹參川芎嗪注射液對肝組織具有保護作用。

        綜上所述,丹參川芎嗪注射液可能通過激活Nrf2/HO-1通路,增強肝組織SOD、GST活性,并降低MDA水平,增強肝組織抗氧化能力,保護膿毒癥所引起的急性肝組織損傷,為臨床預(yù)防及輔助治療膿毒癥致急性肝損傷提供了參考。

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