楊繼嵐，李楊，鄧明佳，胡鳳娣，謝琳，龍庭鳳

0 引言

結(jié)直腸癌（colorectal cancer, CRC）是常見的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重危害人類健康。有關(guān)結(jié)腸癌發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制仍不十分清楚，發(fā)現(xiàn)及研究新的分子在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的作用具有重要的意義。微小RNA（microRNA,miRNA）是一類負(fù)向調(diào)控基因表達(dá)的非編碼單鏈RNA，通過與靶基因信使RNA（mRNA）的3'-非翻譯區(qū)（3'-untranslated region, 3'-UTR）完全或不完全堿基配對(duì)，引發(fā)靶基因mRNA的降解和（或）翻譯抑制，從而對(duì)生物體的生長、發(fā)育和分化起著廣泛的調(diào)控作用，并與包括腫瘤在內(nèi)的多種疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[1-2]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，miR-26家族在腫瘤調(diào)控過程中具有重要的作用，通常被認(rèn)為是腫瘤抑制因子[3-4]。作為miR-26家族的一員，miR-4465影響非小細(xì)胞肺癌進(jìn)程[5]，但其在CRC中的作用仍需進(jìn)一步探討。本研究主要探討miR-4465對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞活性、凋亡以及侵襲的影響，初步探索其潛在的調(diào)控機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

NCM460、SW480、HT-29和HCT-116細(xì)胞均購自中國科學(xué)院上海生化和細(xì)胞生物研究所。DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清、胰蛋白酶購自美國Gibco公司。MiR-4465 mimic及陰性對(duì)照mimic-NC購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司。轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine3000和RNA提取試劑TRIzol購自美國Invitrogen公司。反轉(zhuǎn)錄試劑盒和實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測試劑盒均購自日本TaKaRa公司。MTT試劑盒、Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡試劑盒購自南京凱基生物有限公司。Caspase-3活性檢測試劑盒、RIPA細(xì)胞裂解液、PMSF和BCA蛋白含量測定試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)研究所。HMGA1多克隆抗體、HMGA2多克隆抗體、EZH2多克隆抗體和β-actin多克隆抗體均購自美國Abcam公司。山羊抗兔、山羊抗小鼠等二抗購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒購自廣州銳博生物科技有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

將細(xì)胞置于含10%胎牛血清、100 u/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，在95%O2、5%CO2、37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞融合至80%～90%時(shí)，進(jìn)行消化傳代，將細(xì)胞接種于合適規(guī)格的孔板中，待細(xì)胞融合達(dá)到60%～70%時(shí)，按說明書進(jìn)行操作Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染mimics和質(zhì)粒。

1.3 qPCR分析miR-4465以及HMGA1、HMGA2和EZH2的mRNA表達(dá)水平

TRIzol法提取細(xì)胞總RNA，紫外分光光度計(jì)測定D260nm和D280nm值，測定總RNA的濃度和純度。用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA為模板按實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測試劑盒說明書進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件為：預(yù)變性95℃10 min；變性94℃ 30 s；退火59℃ 20 s；延伸72℃30 s；40個(gè)循環(huán)。以U6的表達(dá)水平為內(nèi)參，用2-ΔΔCt方法分析miR-4465以及HMGA1、HMGA2和EZH2的相對(duì)表達(dá)水平。

1.4 MTT法檢測細(xì)胞活性

細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，每孔加入10 μl MTT試劑（0.5 mg/μl），在37℃培養(yǎng)箱中孵育4 h。棄培養(yǎng)基，每孔加入150 μl二甲基亞砜溶液，輕輕振蕩使藍(lán)色結(jié)晶完全溶解，在酶標(biāo)儀490 nm處檢測吸光度（OD）值。細(xì)胞活性（%）=（OD實(shí)驗(yàn)組-OD空白組）/（OD對(duì)照組-OD空白組）×100% 。

1.5 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡水平

細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，經(jīng)消化、洗滌、離心后，棄去上清液，然后每管加100 μl 1×結(jié)合緩沖液吹打懸浮細(xì)胞，再加入5 μl Annexin V-FITC和5 μl PI染色，輕輕搖勻后，在室溫下閉光孵育15 min。隨后加入400 μl 1×結(jié)合緩沖液，于1 h內(nèi)上機(jī)檢測細(xì)胞凋亡水平。

1.6 Caspase-3活性檢測

細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，按Caspase-3活性檢測試劑盒說明書進(jìn)行操作，在酶標(biāo)儀405 nm處檢測OD值。OD值越大，Caspase-3活性越強(qiáng)。

1.7 Transwell檢測細(xì)胞侵襲能力

細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，經(jīng)消化、洗滌、離心后，更換無血清培養(yǎng)基，調(diào)整細(xì)胞密度為5×105個(gè)/毫升。在預(yù)鋪有Matrigel膠的Transwell小室中加入200 μl細(xì)胞懸液，下室中加入含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基，共培養(yǎng)24 h后，取出上室，棉簽擦去上室的殘留細(xì)胞，90%酒精常溫固定30 min，0.1%結(jié)晶紫常溫染色10 min，顯微鏡拍照并計(jì)數(shù)。每組均設(shè)3個(gè)復(fù)孔，且每個(gè)復(fù)孔均隨機(jī)選取5個(gè)視野進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.8 熒光素酶報(bào)告基因檢測

通過PCR擴(kuò)增出含有miR-4465結(jié)合位點(diǎn)的HMGA1 3'-UTR、HMGA2 3'-UTR以及EZH2 3'-UTR序列，將擴(kuò)增序列分別克隆到pGL3-basic載體中，命名為pGL3-HMGA1 3'-UTR載體、pGL3-HMGA2 3'-UTR載體或pGL3-EZH2 3'-UTR載體。通過基因定點(diǎn)誘變構(gòu)建出pGL3-HMGA1 3'-UTR mut載體、pGL3-HMGA2 3'-UTR mut載體或pGL3-EZH2 3'-UTR mut載體，作為陰性對(duì)照。然后，將pGL3載體與mimic或mimic-NC，連同pRL-TK載體共轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染48 h后，收集細(xì)胞，按照雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒說明書檢測熒光素酶活性。

1.9 Western blot分析HMGA1、HMGA2和EZH2的蛋白表達(dá)水平

用RIPA裂解液與PMSF的混合液（99:1）裂解細(xì)胞15 min，離心收集上清液，BCA蛋白試劑盒進(jìn)行蛋白定量。取適量蛋白進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，采用半干轉(zhuǎn)方法將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h后，加入HMGA1（1:1 000）、HMGA2（1:1 000）和EZH2（1:1 000）一抗4℃孵育過夜，之后加入二抗室溫孵育1 h。用Odyssey紅外激光成像系統(tǒng)檢測各條帶的灰度值，以GAPDH為內(nèi)參分析相對(duì)蛋白表達(dá)。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用GraphPad Prism 5軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，所有數(shù)據(jù)以至少三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。多組之間的比較采用單因素方差分析，組內(nèi)兩兩比較進(jìn)行Bonferroni檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-4465過表達(dá)抑制結(jié)腸癌細(xì)胞活性

qPCR檢測發(fā)現(xiàn)，與人的正常結(jié)腸上皮細(xì)胞系NCM460相比，miR-4465在SW480、HT-29和HCT-116三種結(jié)腸癌細(xì)胞系中的表達(dá)顯著下調(diào)（P=0.0002），見圖1A，提示miR-4465在結(jié)腸癌細(xì)胞中具有重要的作用。然后在HCT-116細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-4465 mimic，轉(zhuǎn)染mimic-NC作為陰性對(duì)照，與對(duì)照組或mimic-NC組相比，miR-4465表達(dá)顯著升高（P＜0.05），見圖1B。MTT檢測發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組或mimic-NC組相比，miR-4465過表達(dá)顯著降低HCT-116的細(xì)胞活性（P=0.0076），見圖1C。

圖1 miR-4465過表達(dá)抑制結(jié)腸癌細(xì)胞活性Figure1 miR-4465 overexpression suppressed viability of colon cancer cells

2.2 miR-4465過表達(dá)促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡

流式細(xì)胞儀檢測發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組或mimic-NC組相比，miR-4465過表達(dá)顯著提升HCT-116細(xì)胞的凋亡率（P＜0.0001），見圖2A、B。同時(shí)，檢測Caspase-3活性發(fā)現(xiàn)，miR-4465過表達(dá)顯著提高其活性（P=0.0001），見圖2C。

圖2 miR-4465過表達(dá)促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡Figure2 miR-4465 overexpression promoted apoptosis of colon cancer cells

2.3 miR-4465過表達(dá)抑制結(jié)腸癌細(xì)胞侵襲

Transwell檢測發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組或mimic-NC組相比，miR-4465 mimic組的侵襲細(xì)胞數(shù)顯著降低（P=0.0066），見圖3。

2.4 miR-4465分別靶向HMGA1、HMGA2、EZH2的3'-UTR

通過軟件預(yù)測，miR-4465與HMGA1、HMGA2以及EZH2的3'-UTR之間均存在靶向序列，見圖4A。進(jìn)一步通過熒光素酶報(bào)告基因檢測發(fā)現(xiàn)，與mimic-NC組相比，miR-4465過表達(dá)顯著降低pGL3-HMGA1 3'-UTR質(zhì)粒（P=0.0003，見圖4B）、pGL3-HMGA2 3'-UTR質(zhì)粒（P=0.0017，圖4C）以及pGL3-EZH2 3'-UTR質(zhì)粒（P=0.002，圖4D）的熒光素酶活性，而不影響對(duì)應(yīng)的突變質(zhì)粒的熒光素酶活性（P＞0.05）。

2.5 miR-4465過表達(dá)抑制HMGA1、HMGA2和EZH2的表達(dá)

Western blot檢測發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組或mimic-NC組相比，miR-4465過表達(dá)顯著下調(diào)HMGA1（P=0.0006，圖5A）、HMGA2（P=0.0023，圖5B）以及EZH2（P=0.0039，圖5C）蛋白的表達(dá)。進(jìn)一步通過qPCR檢測發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組或mimic-NC組相比，miR-4465過表達(dá)顯著下調(diào)HMGA1（P＜0.0001，圖5D）、HMGA2（P=0.0003，圖5E）以及EZH2（P=0.0021，圖5F）mRNA的表達(dá)。

圖3 miR-4465過表達(dá)抑制結(jié)腸癌細(xì)胞侵襲Figure3 miR-4465 overexpression suppressed invasion of colon cancer cells

圖4 miR-4465分別靶向HMGA1、HMGA2和EZH2的3’-UTRFigure4 miR-4465 respectively targeted 3’-UTR of HMGA1, HMGA2 and EZH2

3 討論

MiRNAs是一類進(jìn)化上十分保守的RNA，通過轉(zhuǎn)錄后降解靶mRNA和（或）抑制基因翻譯，調(diào)控多種靶基因的表達(dá)，且每一種miRNA都可以靶向多個(gè)靶基因。因此，miRNAs在調(diào)控基因表達(dá)和生命活動(dòng)方面發(fā)揮著廣泛的作用。異常表達(dá)的miRNA及其靶基因在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中具有重要的調(diào)控功能，作為腫瘤的抑癌基因和（或）癌基因調(diào)控腫瘤的增殖、凋亡、遷移、侵襲等。越來越多的證據(jù)表明，miRNAs在CRC的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，如miR-21-3p[6]、miR-184[7]、miR-630[8]和miR-150[9]。本研究通過過表達(dá)miR-4465，探討其對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞活性、凋亡以及侵襲的影響，旨在為闡明結(jié)腸癌的病理機(jī)制提供一個(gè)新的依據(jù)。

圖5 miR-4465過表達(dá)抑制HMGA1、HMGA2和EZH2的蛋白和mRNA表達(dá)Figure5 miR-4465 overexpression suppressed protein and mRNA expression of HMGA1, HMGA2 and EZH2

本研究發(fā)現(xiàn)，miR-4465在SW480、HT-29和HCT-116三種結(jié)腸癌細(xì)胞系中的表達(dá)均顯著下調(diào)，提示miR-4465在結(jié)腸癌細(xì)胞中的重要作用。細(xì)胞增殖和凋亡不受控制是腫瘤發(fā)生的重要原因之一，其中Caspase-3是線粒體凋亡信號(hào)途徑的一個(gè)關(guān)鍵蛋白。腫瘤細(xì)胞侵襲是腫瘤轉(zhuǎn)移的一個(gè)重要部分。因此，啟動(dòng)腫瘤細(xì)胞的凋亡途徑，抑制過度增殖和侵襲，是治療腫瘤常用的重要手段。有研究表明，miRNAs在調(diào)控腫瘤細(xì)胞的凋亡和侵襲方面發(fā)揮重要的作用。張曉云等[10]研究發(fā)現(xiàn)，miR-143在CRC組織中表達(dá)量顯著低于癌周正常組織。miR-143過表達(dá)可促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡、抑制細(xì)胞遷移，且可能與其調(diào)控FOSL2基因表達(dá)相關(guān)。Wu等[11]研究發(fā)現(xiàn)，miR-21在CRC組織中的表達(dá)顯著高于正常組織，其高表達(dá)與患者晚期腫瘤結(jié)節(jié)轉(zhuǎn)移、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)。MiR-21過表達(dá)可通過靶向下調(diào)PTEN表達(dá)來抑制結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞增殖和侵襲。Gao等[12]研究發(fā)現(xiàn)，miR-222過表達(dá)可通過靶向下調(diào)MIA3表達(dá)來促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞的遷移和侵襲。本研究中發(fā)現(xiàn)miR-4465同樣具有調(diào)控結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡和侵襲的功能。MiR-4465過表達(dá)顯著降低HCT-116的細(xì)胞活性，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、提高Caspase-3活性，并且抑制細(xì)胞侵襲能力，提示miR-4465在CRC中發(fā)揮抑癌作用。

進(jìn)一步探討miR-4465的調(diào)控機(jī)制，通過預(yù)測miR-4465與HMGA1、HMGA2和EZH2之間均存在靶向互補(bǔ)序列，提示這三個(gè)基因可能是miR-4465的靶基因。有文獻(xiàn)報(bào)道這三種基因在多種癌癥，包括結(jié)腸癌中發(fā)揮促癌作用[13-15]，且受到miRNAs的調(diào)控。Fan等[16]研究發(fā)現(xiàn)，miR-543在CRC患者組織中表達(dá)下調(diào)，且體外過表達(dá)miR-543能夠通過抑制HMGA2等基因來阻礙結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖和侵襲。Sun等[5]研究發(fā)現(xiàn)，miR-4465能夠通過直接靶向抑制EZH2的表達(dá)來阻礙非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖和侵襲。本研究通過熒光素酶報(bào)告基因檢測證實(shí)miR-4465能夠分別靶向HMGA1、HMGA2和EZH2的3'-UTR來抑制它們的表達(dá)，提示miR-4465在CRC中的抗癌作用可能與抑制這三個(gè)致癌基因的表達(dá)有關(guān)。

綜上所述，本研究表明miR-4465是結(jié)直腸癌的一個(gè)抑制因子，過表達(dá)能夠降低結(jié)腸癌細(xì)胞的活性，促進(jìn)細(xì)胞凋亡并降低細(xì)胞侵襲，這可能與靶向抑制HMGA1、HMGA2、EZH2的表達(dá)有關(guān)。本研究為進(jìn)一步闡明結(jié)直腸癌的病理機(jī)制提供了新的依據(jù)，提示miR-4465可能是治療結(jié)直腸癌的潛在靶點(diǎn)。