豆巧華，郭曉芳, 朱小飛，張?jiān)略?，楊?/p>

0 引言

食管癌是常見的惡性腫瘤，我國食管癌的發(fā)病率居全球之首，近一半的食管癌患者都在我國，尤其是食管鱗癌[1-2]。近幾年食管癌的綜合治療雖已取得較大進(jìn)展，但患者的5年生存率并沒有大幅提高，仍徘徊在15%～25%[3]。隨著腫瘤分子生物學(xué)機(jī)制的深入研究，靶向治療已成為不少惡性腫瘤的一種主要治療手段。多種靶向藥物在食管癌亦開展了大型臨床研究，但獲得臨床療效的藥物非常少，目前僅有曲妥珠單抗和雷莫蘆單抗顯示出一定的療效，被批準(zhǔn)用于胃-食管交界癌和胃癌的治療[4-6]。研究顯示，表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor, EGFR）和HER2在食管癌中過表達(dá)，EGFR的過表達(dá)率在50%～71%，其過表達(dá)與腫瘤侵襲性增加、較低的分化類型以及更差的預(yù)后密切相關(guān)[7]。HER2在食管癌中的過表達(dá)率為22.1%，在胃癌中約為21.4%，在食管-胃連接部腫瘤中這一比例為32.2%[8]。多項(xiàng)研究也證實(shí)了HER2過表達(dá)與侵襲深度的增加、淋巴結(jié)和遠(yuǎn)處器官轉(zhuǎn)移增加以及總生存率降低之間密切相關(guān)[9]。此外，食管癌患者中還發(fā)現(xiàn)了EGFR和HER2存在共同過表達(dá)的現(xiàn)象[10]，因此，同時抑制EGFR和HER2對于食管癌的治療可能是一種更為有效的方法。

拉帕替尼（lapatinib）是一種以EGFR和HER2為靶點(diǎn)的小分子酪氨酸激酶抑制劑。2007年美國FDA批準(zhǔn)拉帕替尼聯(lián)合卡培他濱用于HER2陽性乳腺癌的治療[11]。目前，拉帕替尼還未被批準(zhǔn)用于食管癌的臨床治療，因此本研究探討拉帕替尼單獨(dú)及與順鉑聯(lián)合使用是否在抗食管癌活性方面發(fā)揮協(xié)同效應(yīng)，并探討二者聯(lián)合作用的機(jī)制，從而為下一步拉帕替尼和化療藥物聯(lián)合用于食管癌患者的臨床試驗(yàn)提供必要的數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞系及培養(yǎng)方法 人食管鱗癌細(xì)胞系KYSE150和EC9706由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所甄永蘇院士惠贈，本實(shí)驗(yàn)室保存?zhèn)鞔?。采用添加?0%胎牛血清（Gibco, 美國）的RPMI 1640培養(yǎng)基（Gibco, 美國），置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

1.1.2 試劑和抗體 Lapatinib（GW572016）購自MedChem Express公司（MCE, 美國），用二甲基亞砜（Dimethyl sulfoxide, DMSO）溶解配制成10 mmol/L的母液。順鉑（5 mg/ml）購自山東齊魯制藥有限公司，在使用之前用細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋。MTT溶液購自美國Sigma公司，細(xì)胞周期檢測試劑盒和Annexin V-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡試劑盒為碧云天生物技術(shù)公司產(chǎn)品（中國江蘇）。所有抗體，包括一抗（磷酸化和非磷酸化的EGFR、HER2、p42/44MAPK（ERK）、AKT、p38MAPK、JNK、β-actin兔抗人單克隆抗體）以及HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗均為Cell Signaling Technology公司（美國）產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 MTT實(shí)驗(yàn) MTT實(shí)驗(yàn)用于檢測拉帕替尼、順鉑單獨(dú)及二者聯(lián)合對食管鱗癌細(xì)胞系的增殖抑制作用。EC9706和KYSE150細(xì)胞以每孔2 000個的密度接種至96孔板中，培養(yǎng)24 h后加入不同濃度的拉帕替尼、順鉑及二者聯(lián)合處理48 h。每孔中加入MTT溶液（5 mg/ml）20 μl，并在37℃繼續(xù)孵育4 h。吸棄各孔培養(yǎng)液，每孔加入150 μl DMSO，振蕩10 min以充分溶解甲瓚沉淀，酶標(biāo)儀測定570 nm處的吸光值。細(xì)胞的存活率按照下述公式進(jìn)行計算：細(xì)胞存活率=（藥物處理孔吸光值-空白孔吸光值）/（未加藥對照孔吸光值-空白孔吸光值）×100%。藥物的IC50值采用Gradphad Prism 5軟件進(jìn)行計算，兩藥的聯(lián)合作用指數(shù)（combination index,CI）根據(jù)Chou和Talalay的中效原理進(jìn)行計算[12]。CI值＜1、=1和＞1分別表示兩藥之間存在協(xié)同、相加和拮抗效應(yīng)。

1.2.2 細(xì)胞周期檢測 EC9706和KYSE150細(xì)胞以每皿5×105個的密度接種至60 mm小皿中，培養(yǎng)24 h后更換新鮮培養(yǎng)液，并分別加入拉帕替尼（10 μmol/L）、順鉑（0.4 μg/ml）或拉帕替尼（10 μmol/L）+順鉑（0.4 μg/ml）處理48 h，對照組細(xì)胞加入0.5%DMSO進(jìn)行處理。常規(guī)胰酶消化收集細(xì)胞（包括漂浮在培養(yǎng)液中的細(xì)胞），137 g離心5 min，棄上清液，細(xì)胞沉淀用PBS洗滌2次，之后每管加入1 ml預(yù)冷的70%乙醇于-20℃固定24 h。137 g離心5 min收集細(xì)胞沉淀，并用PBS洗滌2次。之后按照細(xì)胞周期染色每管加入500 μl染色緩沖液（碧云天生物技術(shù)公司）重懸細(xì)胞，并加入10 μl RNAase A和25 μl碘化丙啶（Propidium iodide, PI）的染色液于37℃避光染色30 min，流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞的熒光強(qiáng)度，并用ModFit軟件分析處于各周期的細(xì)胞比例。

1.2.3 細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn) KYSE150和EC9706細(xì)胞以每孔1×105個的密度接種至6孔板中，37℃培養(yǎng)24 h后換新鮮培養(yǎng)液，分別加入拉帕替尼（10 μmol/L）、順鉑（0.4 μg/ml）或拉帕替尼（10 μmol/L）+順鉑（0.4 μg/ml）處理48 h，并設(shè)置只加0.5% DMSO的對照孔。按照試劑盒的操作說明（Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒，碧云天生物技術(shù)公司），常規(guī)胰酶消化收集細(xì)胞，PBS洗滌2次，重懸于500 μl結(jié)合緩沖液中，加入10 μl Annexin V-FITC和5 μl PI，室溫避光染色15 min，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞熒光強(qiáng)度，計算凋亡細(xì)胞比例。

1.2.4 Western blot實(shí)驗(yàn) KYSE150和EC9706細(xì)胞以每皿1×106個的密度接種至100 mm培養(yǎng)皿中，37℃培養(yǎng)24 h后換新鮮培養(yǎng)液，分別加入拉帕替尼（10 μmol/L）、順鉑（0.4 μg/ml）或二者聯(lián)合處理48 h，對照細(xì)胞加入0.5%DMSO進(jìn)行處理。棄去培養(yǎng)液，細(xì)胞用冷PBS洗滌3次，細(xì)胞刮刀，轉(zhuǎn)移至離心管中，137 g離心5 min。收集沉淀，加入含有1 mmol/L PMSF蛋白酶抑制劑的Western及IP細(xì)胞裂解液中（碧云天生物公司），置于冰上裂解30 min。4℃，10 000 g離心15 min，將上清液轉(zhuǎn)移至新離心管中，采用BCA試劑盒進(jìn)行總蛋白的定量（北京鼎國生物技術(shù)公司）。將30 μg的總蛋白進(jìn)行煮沸變性后上樣，進(jìn)行10%SDSPAGE電泳，電泳結(jié)束后采用電轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上（美國Millipore公司）。將膜置于5% BSA中室溫封閉2 h，之后和1:1000稀釋的一抗于4℃孵育過夜。將膜用TBST溶液洗滌3次，每次10 min。之后將膜與1:4000稀釋的HRP標(biāo)記羊抗兔二抗于室溫孵育1 h，同樣用TBST溶液洗膜3次，每次10 min。在膜上滴加適量的1:1混合的HRP底物溶液（Western Chemiluminescent HRP Substrate,美國Millipore公司），之后放入凝膠成像儀中進(jìn)行曝光，并拍照保存（Amersham Imager 600系統(tǒng)，VT, USA GE Healthcare公司）。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

所有的數(shù)據(jù)均來自于三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計采用Graphpad Prism 5軟件進(jìn)行，單因素方差分析（one-way ANOVA）和非配對的雙尾t檢驗(yàn)用于檢驗(yàn)不同處理組之間是否有差異，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 拉帕替尼、順鉑單獨(dú)及二者聯(lián)合對食管鱗癌細(xì)胞增殖的影響

我們前期研究結(jié)果顯示，拉帕替尼以濃度依賴性的方式抑制食管癌細(xì)胞的增殖，其對KYSE150和EC9706細(xì)胞的IC50值分別為3.84 μmol/L和6.44 μmol/L[13]，而且其IC50值的大小和細(xì)胞表面EGFR、HER2的表達(dá)水平之間并無相關(guān)性。順鉑對KYSE150和EC9706細(xì)胞也展現(xiàn)出了較強(qiáng)的殺傷活性，其對KYSE150和EC9706細(xì)胞的IC50值分別為4.03 μg/ml和1.05 μg/ml，見圖1A。當(dāng)拉帕替尼和順鉑聯(lián)合使用時，在0.05 μg/ml、0.1 μg/ml、0.2 μg/ml和0.4 μg/ml順鉑濃度下，對EC9706細(xì)胞的抑制率分別為（0.77±1.13）%、（10.09±0.44）%、（24.24±1.88）%和（35.55±5.87）%，對KYSE150細(xì)胞的抑制率分別為（0.35±0.22）%、（2.79±4.51）%、（11.05±7.44）%和（21.41±7.25）%。經(jīng)統(tǒng)計檢驗(yàn)，二者聯(lián)合用藥的抑制率與順鉑單用組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義，但與拉帕替尼單用組相比，在低濃度下（5 μmol/L）差異不顯著，在其余濃度下差異顯著，見圖1B。EC9706細(xì)胞也表現(xiàn)出了相同的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。根據(jù)Chou-Talalay方法（中位藥效法）[12]計算出拉帕替尼聯(lián)合順鉑的聯(lián)合作用指數(shù)（combination index,CI）在上述濃度下均＜1，這表明二者之間存在著顯著的協(xié)同作用效應(yīng)，見圖1C。

2.2 拉帕替尼、順鉑單獨(dú)及聯(lián)合應(yīng)用對食管癌細(xì)胞周期分布的影響

在KYSE150細(xì)胞中，與對照組相比，拉帕替尼單獨(dú)處理可誘導(dǎo)細(xì)胞阻滯于G1期，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.0001），但順鉑單獨(dú)處理后，KYSE150細(xì)胞卻表現(xiàn)出了顯著的G2/M期阻滯，G2期的比例增加了約58%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.0001）。拉帕替尼和順鉑聯(lián)合處理后，細(xì)胞也發(fā)生了顯著的G2/M期阻滯（P=0.0008），但阻滯的程度顯然不如順鉑單獨(dú)處理組，見圖2A～B。在EC9706細(xì)胞中，拉帕替尼單獨(dú)處理可顯著降低G1期細(xì)胞的比例（與對照組相比P=0.028），順鉑單獨(dú)處理可誘導(dǎo)顯著的G2/M期阻滯（與對照組相比差異顯著，P＜0.0001），而拉帕替尼和順鉑聯(lián)合處理后，細(xì)胞的G2/M期阻滯現(xiàn)象更為顯著（與對照組相比P＜0.0001，與順鉑組相比P=0.0024；與拉帕替尼組相比P=0.0001），見圖2A～B。

2.3 拉帕替尼、順鉑單獨(dú)或聯(lián)合應(yīng)用對食管癌細(xì)胞凋亡的影響

拉帕替尼和順鉑單獨(dú)處理均可誘導(dǎo)KYSE150（拉帕替尼組與對照組相比P=0.0005；順鉑組與對照組相比P=0.0004）和EC9706細(xì)胞（拉帕替尼組與對照組相比P=0.0023；順鉑組與對照組相比P=0.0024）發(fā)生顯著的凋亡，當(dāng)二者聯(lián)合時，細(xì)胞凋亡更為顯著。拉帕替尼和順鉑單獨(dú)處理組的KYSE150凋亡細(xì)胞比例分別為11.15%和13.53%，而二者聯(lián)合處理組的凋亡比例上升到了36.05%，與任一單獨(dú)處理組相比差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（與拉帕替尼組相比P=0.0004；與順鉑組相比P=0.0005）。兩種藥物單獨(dú)處理組的EC9706凋亡細(xì)胞比例分別為23.14%和20.38%，而聯(lián)合用藥組EC9706凋亡細(xì)胞的比例為26.88%（與拉帕替尼組相比P=0.0182；與順鉑組相比P=0.003），見圖3。這些數(shù)據(jù)表明拉帕替尼和順鉑聯(lián)合使用增強(qiáng)了促凋亡效應(yīng)。

圖1 MTT法檢測拉帕替尼、順鉑單獨(dú)及聯(lián)合應(yīng)用對食管鱗癌細(xì)胞增殖的影響Figure1 Inhibitory effects of lapatinib, cisplatin and lapatinib plus cisplatin on proliferation of ESCC cells detected by MTT assay

圖2 PI染色法結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測拉帕替尼、順鉑單獨(dú)及聯(lián)合對食管鱗癌細(xì)胞周期的阻滯作用Figure2 Cell cycle distribution of KYSE150 and EC9706 cells after treatment with lapatinib, cisplatin and lapatinib plus cisplatin detected by PI staining and fl ow cytometry

圖3 Annexin V-FITC/PI雙染法檢測拉帕替尼、順鉑單獨(dú)及聯(lián)合應(yīng)用對食管鱗癌細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用Figure3 Effects of lapatinib, cisplatin and lapatinib plus cisplatin on ESCC cell apoptosis analyzed by Annexin V-FITC/PI staining

2.4 拉帕替尼、順鉑單獨(dú)或聯(lián)合對食管癌細(xì)胞EGFR/HER2信號通路的影響

在KYSE150細(xì)胞中，拉帕替尼單獨(dú)處理顯著地降低了EGFR和HER2的磷酸化水平，和順鉑聯(lián)合處理后，EGFR和HER2的磷酸化水平被進(jìn)一步降低。拉帕替尼和順鉑單獨(dú)處理同樣可阻斷EGFR和HER2介導(dǎo)的下游Ras/MAPK和PI3K/AKT的信號分子。細(xì)胞中AKT和ERK的磷酸化水平在拉帕替尼處理后顯著下降，但是更為顯著的抑制作用發(fā)生在拉帕替尼和順鉑聯(lián)合處理組。但EGFR和HER2下游的另外兩個信號分子p38MAPK和JNK的磷酸化水平并沒有發(fā)生顯著降低，見圖4。

在EC9706細(xì)胞中，拉帕替尼單獨(dú)或與順鉑聯(lián)合處理可導(dǎo)致磷酸化EGFR的下降，但磷酸化HER2水平并未發(fā)生改變。拉帕替尼單獨(dú)處理對AKT的活化無影響，但是和順鉑聯(lián)合后卻可顯著阻斷AKT的活性。磷酸化ERK水平在拉帕替尼單獨(dú)或聯(lián)合順鉑處理后同樣大幅降低。與KYSE150細(xì)胞不同，拉帕替尼和順鉑聯(lián)合處理后，MAPK信號通路中的另兩個分子p38MAPK和JNK的活化也受到了明顯抑制，見圖4。這些結(jié)果表明，當(dāng)拉帕替尼和順鉑聯(lián)合使用時，其發(fā)揮抑制EGFR/HER2信號通路的能力比單獨(dú)使用進(jìn)一步增強(qiáng)，這可能是二者聯(lián)合發(fā)揮更強(qiáng)的抑制生長和促進(jìn)凋亡作用的機(jī)制之一。

圖4 Western blot法檢測拉帕替尼、順鉑單獨(dú)及聯(lián)合對食管鱗癌細(xì)胞EGFR和HER2信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響Figure4 Effects of lapatinib, cisplatin and lapatinib plus cisplatin on EGFR/HER2 signaling pathway in KYSE150 and EC9706 cells detected by Western blot

3 討論

盡管EGFR和HER2在食管癌中過量表達(dá)，且二者的過表達(dá)與患者生存期縮短、復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移概率增加以及對放化療的抵抗性密切相關(guān)[14]，但多數(shù)EGFR和HER2靶向性藥物，如西妥昔單抗（cetuximab）、吉非替尼（gefitinib）、埃羅替尼（erlotinib）等在針對食管癌、食管-胃連接部癌和胃癌的臨床試驗(yàn)結(jié)果顯示，靶向藥物單獨(dú)使用臨床療效有限，耐藥性現(xiàn)象突出[15-17]。作為EGFR和HER2雙重小分子抑制劑的拉帕替尼也表現(xiàn)出相同的結(jié)果[18-20]。但是當(dāng)拉帕替尼和化療藥物聯(lián)合使用時卻表現(xiàn)出了增強(qiáng)的臨床療效[21-22]。在多項(xiàng)臨床前研究中，拉帕替尼和順鉑、5-氟尿嘧啶、紫杉醇、卡培他濱等細(xì)胞毒藥物聯(lián)合使用對卵巢癌、頭頸部腫瘤、膀胱癌等也顯示出了協(xié)同抗腫瘤活性[23-25]。本研究結(jié)果顯示拉帕替尼單用時可顯著抑制KYSE150和EC9706細(xì)胞的增殖，這一結(jié)果和其他研究報道一致[26-27]。但是，拉帕替尼活性與EGFR或HER2的表達(dá)水平之間并沒有相關(guān)性，這一現(xiàn)象在其他研究中也有報道[28]，這表明細(xì)胞對拉帕替尼的敏感度并不完全取決于EGFR和HER2的表達(dá)水平，因此有必要對拉帕替尼敏感的預(yù)測標(biāo)志物展開研究。當(dāng)和順鉑聯(lián)用時，在本實(shí)驗(yàn)所用的四個濃度下均表現(xiàn)出了協(xié)同效應(yīng)。但是，當(dāng)?shù)蜐舛鹊睦撂婺幔ㄈ?.5 μmol/L）和高濃度的順鉑（如5 μg/ml）聯(lián)用卻表現(xiàn)出拮抗效應(yīng)（數(shù)據(jù)掃描OSID碼見附件）。這一結(jié)果表明酪氨酸激酶抑制劑和細(xì)胞毒性藥物聯(lián)用時，二者的濃度必須首先進(jìn)行優(yōu)化[29]。

在細(xì)胞周期試驗(yàn)中，拉帕替尼和順鉑單獨(dú)處理對細(xì)胞周期分布有完全不同的影響，拉帕替尼將KYSE150細(xì)胞（EGFR和HER2均高表達(dá)）阻滯于G1期，而對EGFR和HER2低表達(dá)的EC9706細(xì)胞周期分布沒有影響。而順鉑單獨(dú)處理后，KYSE150細(xì)胞卻被阻滯在了G2/M期。更有趣的是，當(dāng)拉帕替尼和順鉑聯(lián)合處理后，處于G2/M期的細(xì)胞比率顯著增加，但是這一比率要遠(yuǎn)小于順鉑單獨(dú)處理組G2/M期的細(xì)胞比率。出現(xiàn)這個結(jié)果的原因可能是由于拉帕替尼和順鉑對細(xì)胞周期分布存在不同效果，順鉑誘導(dǎo)的G2/M期阻滯部分被拉帕替尼所抵消，類似的結(jié)果也出現(xiàn)在gefitinib與化療藥物的聯(lián)用中[30]。接下來我們研究了拉帕替尼和順鉑單獨(dú)及聯(lián)合對細(xì)胞凋亡及對EGFR/HER2信號通路活化的影響，結(jié)果顯示二者聯(lián)合可發(fā)揮更顯著的促凋亡及抑制EGFR/HER2信號通路激活的作用。

綜上所述，拉帕替尼與順鉑在抗食管癌體外作用上發(fā)揮協(xié)同效應(yīng)，二者聯(lián)用可發(fā)揮更顯著的抑制細(xì)胞增殖和促進(jìn)細(xì)胞凋亡的活性，這種協(xié)同作用的機(jī)制與二者阻斷了EGFR和HER2的激活及下游的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)。這些結(jié)果提示，將EGFR/HER2靶向性藥物與常規(guī)化療藥物聯(lián)合使用可能是一個非常有前景的食管癌臨床治療策略，但二者聯(lián)用應(yīng)用于臨床還需補(bǔ)充更多的數(shù)據(jù)，如檢測二者聯(lián)用在動物模型中的作用，以證實(shí)這種策略的有效性和在不良反應(yīng)方面的優(yōu)越性；另外，尋找可預(yù)測腫瘤細(xì)胞對拉帕替尼敏感度的表面標(biāo)志物，有助于篩選從拉帕替尼與順鉑聯(lián)合用藥中獲益的患者。