宋佳 趙剛 宋春蕾

摘要：目的? 研究牙周炎的大鼠牙齒移動保持階段，中藥骨碎補對牙槽骨成骨作用以及對RANKL表達影響的研究。方法? 將45只雄性Wister大鼠建立牙周炎實驗?zāi)Ｐ汀０凑针S機數(shù)字表法將大鼠分成9個組，每組5只，進行標記。其中1組設(shè)為空白組，4組對照組，4組實驗組。空白組拉簧牽拉上頜左側(cè)第一磨牙向近中移動，牽拉21 d后分別在保持3，7，14，21 d處死;實驗組和對照組分別建立牙移動模型，實驗組在保持階段的3，7，14，21 d的前1天灌服骨碎補水煎液0.9 g/kg， 1次/d;對照組同樣時間灌服等量0.9%氯化鈉溶液，1次/d。HE染色觀察成骨細胞和破骨細胞。免疫組織化學切片觀察RANKL因子表達量。結(jié)果? 實驗組的RANKL表達量在初期先增加，從第7 d開始RANKL表達量開始逐漸降低。同一節(jié)點對比，實驗組RANKL表達量低于對照組。實驗組在保持第21 d RANKL表達量非常少，牙周膜處于穩(wěn)定狀態(tài)，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。結(jié)論? 骨碎補水煎液可以促進成骨，穩(wěn)定牙槽骨及牙周膜的改建，降低RANKL的表達。

關(guān)鍵詞：骨碎補;牙周炎;牙移動;RANKL

中圖分類號：R781.4? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標識碼：A? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2019.04.028

文章編號：1006-1959（2019）04-0085-03

Abstract：Objective? To study the effect of Chinese medicine granules on the alveolar bone osteogenesis and the expression of RANKL in periodontitis rats. Methods? 45 male Wister rats were established experimental models of periodontitis. Rats were divided into 9 groups according to the random number table method， and 5 rats in each group were labeled. One group was set as blank group， 4 groups were control group， and 4 groups were experimental group. The blank group was pulled to pull the first molar on the left side of the upper jaw and moved to the middle. After 21 d of pulling， the rats were sacrificed for 3， 7， 14 and 21 d.The tooth movement model was established in the experimental group and the control group respectively.The experimental group was given 0.9 g/kg of decoction of bone decoction once a day， 3， 7， 14， 21 d of the maintenance phase， once a day;The control group was given the same amount of 0.9% sodium chloride solution once a day for the same time. Osteoblasts were observed by HE staining. Immunohistochemical sections were used to observe the expression level of RANKL factor. Results? The expression level of RANKL in the experimental group increased first， and the expression level of RANKL began to decrease gradually from the 7th day. Compared with the same node， the expression level of RANKL in the experimental group was lower than that in the control group. In the experimental group， the expression of RANKL was very low at 21 d and the periodontal ligament was stable，the difference was statistically significant （P<0.05）. Conclusion? Wound decoction can promote osteogenesis， stabilize the alveolar bone and periodontal ligament， and reduce the expression of RANKL.

Key words：Orthodontic;Periodontitis;Tooth movement;RANKL

口腔正畸治療牙周病可以減輕患牙松動度、改善病患的出血情況，降低病患牙周袋深度[1]。但是正畸牙移動后，牙周膜纖維組織改建較慢并有恢復趨勢，很容易使牙齒發(fā)生移動。目前對牙周病正畸治療后保持階段研究較少。中藥骨碎補具有強骨、止痛的功效。現(xiàn)已被制成多種制劑用于牙齒松動、跌撲閃挫、筋骨折傷[2]。轉(zhuǎn)錄因子NF-KB受體活化劑配體（receptor activator of NF-kB ligand，RANKL）是參與骨改建的重要細胞因子之一。成骨細胞和基質(zhì)細胞均表達RANKL和OPG，都能與破骨細胞表面的RANK結(jié)合，RANKL與破骨細胞細胞膜上的RANK結(jié)合，促進破骨細胞的分化成熟，并且抑制破骨細胞的凋亡[3]。本研究通過給患有牙周炎正畸牙移動保持階段的大鼠灌服水煎骨碎補中藥，用免疫組化檢測RANKL因子的表達，探討中藥骨碎補在牙周炎正畸牙移動后保持階段對牙周膜及牙槽骨的改建作用，為縮短牙周炎正畸患者保持時間提供實驗依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料? 每2000 ml 水中加 20 g 骨碎補（購于黑龍江省佳木斯中醫(yī)院）浸泡 30 min，加熱至沸騰半個小時后濾渣，將濾液濃縮至 200 ml，即制成 100% 濃度的水煎劑。

1.2實驗動物? 選擇清潔級Wistar大鼠，雄性，體重（180～220 g）45只[購于佳木斯大學動物實驗中心，許可證號SCXK（黑）2013-001]，按照《實驗動物保護條例》飼養(yǎng)，消毒，清理，喂養(yǎng)無菌飼料（由佳木斯動物實驗中心提供），飼養(yǎng)1周后開始動物實驗。

1.3方法

1.3.1分組? 按照隨機數(shù)字表法將大鼠分成9個組，每組5只，進行標記。其中1組設(shè)為空白組，4組對照組，4組實驗組。牙周炎組建立牙周炎模型，注射過量10%的水合氯醛處死，HE染色及免疫組化染色。實驗組和對照組建立牙周炎及正畸牙移動模型，實驗組灌服骨碎補水煎液，對照組灌服等量的0.9%氯化鈉溶液。分別在第3，7，14，21 d處死，HE染色及免疫組化染色。

1.3.2實驗動物模型建立? 牙周炎動物模型建立：用10%水合氯醛3.5 ml/kg（100 ml，雷根生物供應(yīng)室，實驗使用），腹腔麻醉，仰臥位固定，上開口器（用0.9 mm不銹鋼彎制），用探針（口腔器械盒，保定市醫(yī)療器械有限公司）將大鼠上頜左側(cè)第一磨牙牙齦剝離。在大鼠上頜左側(cè)第一磨牙近中牙頸部齦溝處用快速手機（402高速手機，順遜醫(yī)療器械）磨0.2 mm深固位溝，選用0.20 mm結(jié)扎絲（杭州奧索醫(yī)療器械有限公司）將大鼠上頜左側(cè)第一磨牙結(jié)扎（盡量結(jié)扎到牙齦溝處）。給大鼠喂養(yǎng)高糖水（100 g/L），將飼料（佳木斯大學動物實驗中心提供）泡軟，為期1個月。1個月觀察可見上頜第一磨牙牙齦紅腫、探診出血、牙周袋，即牙周炎動物模型建立成功。

正畸牙移動模型建立：將大鼠麻醉，固定，大鼠上頜兩顆中切牙頸部的遠中面磨出深0.2 mm的固位溝，拉簧（鎳鈦合金牙齒矯形拉簧，北京圣瑪科技有限公司）一側(cè)連接大鼠磨牙，另一側(cè)與大鼠切牙連接。測力計（杭州奧索牙用測力計桿式測力計，50/格）測拉力約50 g，加力21 d。建立保持期模型，用結(jié)扎絲連扎大鼠第一磨牙及切牙，保持第一磨牙移動后位置。在加力裝置去除前1 d開始灌服。實驗組灌服骨碎補水煎液（中醫(yī)院購買，制備成0.9 g/kg溶液），對照組灌服等量的0.9%氯化鈉溶液。分別在3，7，14，21 d處死大鼠。

1.3.3免疫組化及HE染色? 取大鼠左側(cè)上頜骨，在4%多聚甲醛固定液（北京華越洋生物科技有限公司）固定24 h。在EDTA溶液中4℃脫鈣50 d。PBS沖洗干凈、石蠟包埋，與牙體長軸平行切片，取牙齒近遠中組織切片免疫組化。①HE染色：烤片，二甲苯脫蠟25 min，蘇木素侵泡3 min染色，淡氨水反藍，沖洗，0.5%伊紅侵泡2 min，沖洗，梯度乙醇脫水，中性樹膠封片。②免疫組化染色：烤片，二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化，室溫下使用復合酶消化液，滴加抗原修復液I，充分暴露抗原，用3%過氧化氫孵育以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性，滴加二抗，DAB溶液顯色，電鏡下觀察抗原抗體，梯度乙醇脫水，中性樹膠封片。

1.4評價標準? RANKL表達量用平均光密度值，每個組織切片隨機分析片子上、中、下三個不同部位的高倍鏡視野，測量其平均值，測量值越大，RANKL表達越多。觀察免疫組化切片可見，RANKL的陽性表達集中在大鼠牙槽骨骨髓基質(zhì)細胞中，胞膜、胞質(zhì)及核膜都被染色，呈棕黃色顆粒狀[4]。

1.5統(tǒng)計學分析? 使用GraphPad prism 5.0軟件對數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，計量資料用（x±s）表示，比較采用t檢驗;計數(shù)資料以（%）表示，采用χ2檢驗。采取多因素方差方法分析比較時間和藥物因素對RANKL表達的影響，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 HE染色結(jié)果? 動物實驗?zāi)Ｐ统跗?，可見牙周膜纖維界限模糊不清，牙周纖維拉長。在第3天時可見破骨細胞以及成骨細胞團，牙根處牙周膜內(nèi)可見成骨細胞（圖1A、1B），實驗組牙周纖維排列規(guī)律，而對照組牙周纖維紊亂，但差異不明顯。在第7天開始到第21天，牙周膜寬度逐漸縮小，纖維排列穩(wěn)定，出現(xiàn)大量的成骨樣細胞。對照組牙周纖維比較紊亂，存在成骨細胞的同時也存在大量的破骨樣細胞。在保持的第21天，實驗組可見細胞大部分處于穩(wěn)定的狀態(tài)且看到成骨細胞（圖1D），對照組牙周膜細胞排列紊亂（圖1C）。

2.2免疫組織化學染色結(jié)果? RANKL因子主要表達在牙周膜及牙槽骨的細胞膜及細胞漿等部位，陽性的表達結(jié)果變現(xiàn)為黃色或黃棕色，淡藍色為陰性表達，白色是底色。在保持開始到第7 d，可見RANKL因子大量表達（圖2E、F）。隨著保持時間延長，可見RANKL因子表達量逐漸降低，并且出現(xiàn)陰性表達。在保持第21 d對照組可見吸收陷窩（圖G），第21 d實驗組RANKL因子表達量微乎其微并出現(xiàn)大部分淡藍色陰性表達，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見表1、圖H。

3討論

牙周炎是牙齦炎未得到及時治療，導致炎癥由牙齦向深層擴散到牙周膜、牙槽骨和牙骨質(zhì)而發(fā)展引起的牙周組織的慢性炎癥，嚴重時牙齒將不能保留[5]。近年來有學者[6]將正畸治療導入牙周病的綜合治療系列，即在牙周炎癥控制的基礎(chǔ)上，通過完善的正畸治療排齊牙列，恢復正常鄰接關(guān)系，咀嚼功能。因此從正畸學角度來說，需要考慮牙周炎患者正畸治療結(jié)束后的保持。目前，物理方法保持有：Hawley保持器、壓膜式透明保持器、固定式舌側(cè)保持器是臨床中3種常用[7]。有研究應(yīng)用一些強筋壯骨的中藥可以促進成骨，促進正畸牙移動后的穩(wěn)定，如仙靈骨葆可以抑制成年大鼠牙移動保持階段破骨細胞生成，促進成骨細胞的生成[8]。

中藥骨碎補的主要成分為：木栓，β-香樹脂醇，β-谷甾醇等[9]。研究表明，骨碎補及有效成分通過提高BMP-2 蛋白和抑制 RANKL 的表達實現(xiàn)促進成骨細胞增殖分化和抑制破骨細胞活性的作用[10]。此外骨碎補有骨細胞保護作用、抗骨質(zhì)酥松作用等[11]。陳莉麗等[12]發(fā)現(xiàn)在豚鼠牙齒畸形模型中，骨碎補能顯著改善齒骨密度，使牙齒堅硬度增強，促進牙骨細胞的進一步合成。許彥枝等[13]研究發(fā)現(xiàn)骨碎補作用的人牙齦成纖維細胞生長分泌功能活躍、礦化能力增強。RANKL可促進破骨細胞的分化，增強成熟破骨細胞的活力，阻止破骨細胞凋亡，是破骨細胞分化成熟和維持功能所需的重要因子[14]。當RANKL表達量增加，破骨細胞分化激活成熟，牙周膜改建中。當RANKL表達量降低，破骨細胞分化受到抑制，停止骨吸收。

本研究中在保持階段初期，牙周膜不穩(wěn)定，RANKL表達量出現(xiàn)增加現(xiàn)象。隨著保持時間的延長，牙周膜開始穩(wěn)定于新的位置，RANKL表達量逐漸降低。灌服中藥骨碎補水煎液的實驗組RANKL因子降低快且大。在保持階段第21 d，實驗組RANKL表達量降低接近于空白組，但比空白組RANKL表達量略高。說明中藥骨碎補對RANKL表達有抑制作用，促進骨改建成骨，促進牙周膜穩(wěn)定。

綜上所述，中藥骨碎補對牙周膜改建有促進作用，抑制破骨RANKL因子的表達。若中藥骨碎補應(yīng)用于臨床可減少牙周炎患者物理保持的時間，從而達到更好的治療效果，及提高穩(wěn)定性。

參考文獻：

[1]鄧昊，周立輝，鮮文，等.口腔正畸治療牙周病致前牙移位的臨床療效觀察[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學進展，2015，15（9）：1732-1734， 1743.

[2]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：121.

[3]黎彥龍，何明，陳秉雄，等.OPG-RANKL-RANK信號系統(tǒng)是調(diào)節(jié)破骨細胞及骨質(zhì)疏松癥的重要途徑[J].中國組織工程研究，2015，19（24）：3894-3898.

[4]鐘雯怡，武岐山，高麗，等.重組人骨保護素對牙周炎大鼠牙槽骨RANKL、OPG蛋白表達的影響[J].重慶醫(yī)學，2015，44（14）：1879-1881.

[5]曹雨庵.牙周炎正畸治療患者治療前后炎性及牙周狀態(tài)的變化[J].海南醫(yī)學院學報，2014，20（11）：1598-1600.

[6]Azouni KG，Tarakji B.The Trimeric Model：A New Model of Periodontal Treatment Planning[J].J Clin Diagn Res，2014，8（7）：ZE17-ZE20.

[7]林建昌，賴文莉.3種常用正畸保持器的特點及臨床應(yīng)用[J].國際口腔醫(yī)學雜志，2015，42（4）：462-465.

[8]陸廷茂，張軍梅.仙靈骨葆對大鼠正畸保持階段成骨細胞和破骨細胞的影響[J].貴州醫(yī)藥，2016，40（8）：820-821.

[9]Saravanan S，Mutheeswaran S，Saravanan M，et al.Ameliorative effect of Drynaria quercifolia（L.）J.Sm.，an ethnomedicinal plant，in arthritic animals[J].Food Chem Toxicol，2013，51：356-363.

[10]殷方明，肖漣波，張昀.骨碎補柚皮苷對炎癥及骨作用的相關(guān)研究進展[J].中國骨傷，2015，28（2）：182-186.

[11]錢茜.骨碎補化學成分和藥理作用研究進展[J].中國生化藥物雜志，2015，35（3）：186-188.

[12]陳莉麗，唐琪，嚴杰.骨碎補提取液對實驗性牙槽骨吸收療效的研究[J].中國中藥雜志，2004，29（6）：549-553.

[13]許彥枝，高永博，郭晶潔，等.骨碎補對體外培養(yǎng)人牙髓細胞增殖及超微結(jié)構(gòu)的影響[J].中國醫(yī)院藥學雜志，2007，27（10）：1377-1380.

[14]黎彥龍，何明，陳秉雄，等.OPG-RANKL-RANK信號系統(tǒng)是調(diào)節(jié)破骨細胞及骨質(zhì)疏松癥的重要途徑[J].中國組織工程研究，2015，19（24）：3894-3898.

收稿日期：2018-10-30;修回日期：2018-11-20

編輯/肖婷婷