劉麗 孫立新 趙明珍

摘要：目的? 研究干擾素-γ（IFN-γ）對乳腺癌細(xì)胞表面HLA-Ⅰ類分子表達(dá)的影響，并探討其在乳腺癌治療中的免疫作用機(jī)制。方法? 培養(yǎng)乳腺癌SKBR3細(xì)胞株，根據(jù)IFN-γ濃度將其分為25 U/ml、50 U/ml、100 U/ml組，未加藥組為空白對照組。通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR和流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)檢測經(jīng)不同濃度IFN-γ作用后的乳腺癌SKBR3細(xì)胞內(nèi)HLA-Ⅰ mRNA的含量，以及表面的HLA-Ⅰ類抗原的表達(dá)。結(jié)果? 實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，空白對照組、25 U/ml、50 U/ml、100 U/ml組HLA-Ⅰ mRNA的表達(dá)量分別為（1.00±0.00）、（2.26±0.54）、（3.89±0.81）、（5.94±0.97），三個(gè)濃度組均較空白對照組表達(dá)量高（P<0.05）;流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，空白對照組、25 U/ml、50 U/ml、100 U/ml組細(xì)胞表面HLA-Ⅰ蛋白表達(dá)量為（14.87±2.80）、（44.33±3.36）、（48.80±2.63）、（56.77±1.93），三個(gè)濃度組均高于對照組（P<0.05）。結(jié)論? IFN-γ上調(diào)乳腺癌細(xì)胞HLA-Ⅰ類抗原的表達(dá)有利于抗乳腺癌作用。

關(guān)鍵詞：干擾素-γ;乳腺癌;HLA;免疫治療

中圖分類號(hào)：R737.9? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2019.04.029

文章編號(hào)：1006-1959（2019）04-0088-03

Abstract：Objective? To investigate the effect of interferon-γ （IFN-γ） on the expression of HLA class Ⅰ molecules on breast cancer cells and to explore its immune mechanism in the treatment of breast cancer. Methods? Breast cancer SKBR3 cell line was cultured and divided into 25 U/ml，50 U/ml and 100 U/ml groups according to IFN-γ concentration. The untreated group was a blank control group. Real-time quantitative PCR and flow cytometry were used to detect the content of HLA-Ⅰ mRNA and the expression of HLA-Ⅰ antigen on the surface of breast cancer SKBR3 cells treated with different concentrations of IFN-γ. Results? The real-time PCR results showed that the expression levels of HLA-Ⅰ mRNA in the blank control group， 25 U/ml， 50 U/ml and 100 U/ml were （1.00±0.00），（2.26±0.54），（3.89±0.81），（5.94±0.97），the three concentration groups were higher than the blank control group （P<0.05）; the flow cytometry results showed that the blank control group， 25 U/ml， 50 U/ml The expression of HLA-Ⅰ protein in the cell surface of the 100 U/ml group was （14.87±2.80）， （44.33±3.36）， （48.80±2.63）， （56.77±1.93）， and the three concentration groups were higher than the control group （P<0.05）. Conclusion? IFN-γ up-regulates the expression of HLA-Ⅰ antigen in breast cancer cells， which is beneficial to the anti-breast cancer.

Key words：Interferon-γ;Breast cancer;HLA;Immunotherapy

乳腺癌（Breast cancer）是目前世界上第2大常見的惡性腫瘤，位居女性惡性腫瘤第1位。發(fā)病率占成人惡性腫瘤的3%，僅次于肺癌。2018年新增的乳腺癌病例超過200萬例[1]。盡管乳腺癌的早期篩查、手術(shù)治療、放化療、內(nèi)分泌治療以及分子靶向治療已取得重大進(jìn)展，但乳腺癌仍然是女性腫瘤死亡的重大疾病[2]。腫瘤免疫理論認(rèn)為免疫逃逸機(jī)制在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中起著關(guān)鍵作用。近年來，免疫逃避已被公認(rèn)為癌癥進(jìn)展的標(biāo)志[3]。MHC（人類為HLA）-Ⅰ類分子表達(dá)缺陷是腫瘤免疫逃逸的重要機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)IFN-γ可以上調(diào)多種腫瘤細(xì)胞表面MHC-Ⅰ類分子的表達(dá)，有利于阻斷腫瘤免疫逃逸。但對乳腺癌細(xì)胞表面MHC-Ⅰ類分子表達(dá)的作用有待進(jìn)一步研究。本研究應(yīng)用低表達(dá)HLA-I的乳腺癌細(xì)胞探索IFN-γ對其細(xì)胞表面HLA-Ⅰ類分子表達(dá)的上調(diào)。

1材料與方法

1.1藥品與試劑? DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基、胰酶、PBS購買自美國Gibco公司和胎牛血清購買自以色列BI公司。IFN-γ購于美國peprotech公司;HLA-ABC抗體購于天津三箭生物公司;HLA-ABC以及GAPDH引物購自Invitrogen公司。SKBR3乳腺癌細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)? 將乳腺癌SKBR3細(xì)胞以DMEM完全培養(yǎng)基（含10%胎牛血清），置于5% 的CO2恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞密度達(dá)到90%左右時(shí)傳代。棄去舊的細(xì)胞培養(yǎng)基，PBS漂洗細(xì)胞2次，3 ml 0.25%胰蛋白酶消化1.5 min，吸去胰酶，加入10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基3 ml吹打成單細(xì)胞懸液，將細(xì)胞懸液傳至3個(gè)新培養(yǎng)瓶中，加入5 ml10%胎牛血清DMEM完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.2熒光定量PCR? 實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)組分別加入終濃度為25 U/ml、50 U/ml、100 U/ml IFN-γ，未加藥物組為空白對照組。用TRIzol抽提各組細(xì)胞總RNA。按照Thermo逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書配置實(shí)驗(yàn)反應(yīng)液，反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)參數(shù)為：42℃1 h;72℃5 min。qPCR循環(huán)參數(shù)為：95℃預(yù)變性10 s后，隨后按60℃30 s，72℃20 s進(jìn)行45個(gè)循環(huán);實(shí)驗(yàn)以GAPDH基因內(nèi)參表達(dá)水平為對照，以2-△△Ct法分析細(xì)胞中HLA-Ⅰ類分子的mRNA表達(dá)水平。擴(kuò)增HLA-I基因引物：正向引物：5'-GCTACTACAACCAGAGCGAGG-3'，反向引物：5'-GTGTGATCTCCGCAGGGTAGA-3';擴(kuò)增GAPDH基因引物：正向引物：5'-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3'，反向引物：5'-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3'。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞表面HLA-Ⅰ類分子? 藥物處理同熒光定量PCR。將各組細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，用含1%胎牛血清的PBS漂洗3次。調(diào)整每組細(xì)胞濃度為1×107個(gè)/ml。將每組細(xì)胞懸液分2管，每管 25 μl，其中一管加HLA-Ⅰ FITC 單抗1.5 μl。另一管加入同型對照1.5 μl。室溫避光反應(yīng) 40 min。加入1%胎牛血清PBS 400μl/管。采用流式免疫熒光法（FACS）檢測樣品，每管樣品分析5000個(gè)細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析? 所有數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，計(jì)量資料采用（x±s）表示，行單因素方差分析，組間比較用Tukey檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 IFN-γ對SKBR3乳腺癌細(xì)胞的HLA-Ⅰ mRNA水平的影響? 實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示IFN-γ處理組細(xì)胞 HLA-Ⅰ mRNA 表達(dá)量高于空白對照組（P<0.05），100 U/ml組最高。且HLA-ⅠmRNA 表達(dá)量隨著IFN-γ濃度的增加而增加，表明這個(gè)濃度區(qū)間中，IFN-γ有誘導(dǎo)乳腺癌SKBR3細(xì)胞HLA-ⅠmRNA的作用，具有濃度依賴性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表1。

2.2 IFN-γ對SKBR3乳腺癌細(xì)胞表面的HLA-Ⅰ蛋白表達(dá)的影響? 流式細(xì)胞免疫熒光檢測顯示，經(jīng)25、50、100 U/ml IFN-γ處理的SKBR3細(xì)胞表面的HLA-I的表達(dá)量高于空白對照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。且隨著IFN-γ濃度的增高，細(xì)胞表面HLA-Ⅰ的表達(dá)量增高，具有濃度依賴性，見表2。

3討論

免疫應(yīng)答（Immune response）是指機(jī)體免疫系統(tǒng)對體內(nèi)抗原進(jìn)行識(shí)別，繼而清除抗原的一系列生物

學(xué)效應(yīng)過程。T細(xì)胞是人體細(xì)胞免疫的主要細(xì)胞之一，在抗腫瘤免疫機(jī)制中發(fā)揮著主導(dǎo)作用。腫瘤細(xì)胞表面免疫抗原的丟失是腫瘤細(xì)胞逃避機(jī)體免疫的主要原因之一，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵作用。提高腫瘤表面的免疫抗原表達(dá)可增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的免疫源性，同時(shí)提高T細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞識(shí)別度，達(dá)到抗腫瘤的作用。HLA-Ⅰ參與人類免疫細(xì)胞識(shí)別腫瘤抗原，在多種人類腫瘤細(xì)胞中存在著HLA-Ⅰ抗原的缺失。吳明雨等[4]研究發(fā)現(xiàn)低分化型口腔鱗狀細(xì)胞癌（OSCC）組織HLA-B表達(dá)較正常組織和高分化OSCC明顯下調(diào)，可能與低分化型OSCC出現(xiàn)較高的淋巴道轉(zhuǎn)移率相關(guān)，提示HLA-B的表達(dá)下調(diào)可能在OSCC淋巴道轉(zhuǎn)移中有著重要意義。同時(shí)，HLA-B可作為一項(xiàng)監(jiān)測口腔鱗狀細(xì)胞癌惡性程度與淋巴道轉(zhuǎn)移的指標(biāo)。紀(jì)曉坤等[5]發(fā)現(xiàn)在人卵巢癌SKOV3細(xì)胞轉(zhuǎn)染Beclin1質(zhì)粒后HLA-Ⅰ、HLA-Ⅱ表達(dá)量增加，使卵巢癌細(xì)胞免疫應(yīng)答增強(qiáng)。Chang C等[6]報(bào)道大部分腫瘤中均存在 HLA-Ⅰ表達(dá)異常，并在對100多種腫瘤性損傷的研究中發(fā)現(xiàn)16%～80%的損傷均出現(xiàn)HLA-Ⅰ的表達(dá)缺失或下降。由此可見HLA-Ⅰ分子的表達(dá)對腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)鍵作用。近些年來興起的腫瘤免疫療法較傳統(tǒng)治療方法可顯著提高患者的生存質(zhì)量。目前對乳腺癌的免疫療法的研究相對較少。IFN-γ作為重要的天然免疫調(diào)節(jié)劑，可上調(diào)多種腫瘤細(xì)胞表面免疫分子的表達(dá)，從而增強(qiáng)免疫細(xì)胞的抗原提呈作用，使Th0細(xì)胞向Th1分化[7]。同時(shí)，IFN-γ還可刺激APCs細(xì)胞，上調(diào)IL-12、IL-27和CD86等的表達(dá)，促進(jìn)了Th1細(xì)胞的分化和細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（CTL）功能。此外，IFN-γ可干擾Th2，Th17、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）等在腫瘤細(xì)胞免疫逃避過程中起關(guān)鍵作用的細(xì)胞的分化[8]。李林卿等[9]在對271例乳腺癌手術(shù)患者的癌組織的檢測中發(fā)現(xiàn)其中有92例患者的乳腺癌組織中HLA-Ⅰ呈強(qiáng)陽性表達(dá)，而179 例表達(dá)下調(diào);且HLA-Ⅰ的表達(dá)量與TNM分期早晚、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及血管侵犯均相關(guān)。HLA-Ⅰ表達(dá)下調(diào)者的無病生存率顯著低于HLA-Ⅰ表達(dá)陽性者。說明HLA-Ⅰ分子的表達(dá)與乳腺癌的發(fā)生和進(jìn)展有著重要的相關(guān)性。研究表明IFN-γ可抑制多種腫瘤細(xì)胞系生長（包括乳腺癌細(xì)胞），而且對乳腺癌皮膚復(fù)發(fā)患者進(jìn)行病灶內(nèi)注射IFN-γ可使皮膚損傷部分或完全消退[10]。但是其抗腫瘤作用機(jī)制尚未完全清楚。據(jù)以往的研究發(fā)現(xiàn)[11，12]，IFN-γ可上調(diào)結(jié)腸癌細(xì)胞、胃癌細(xì)胞表面HLA-Ⅰ分子表達(dá)。但對乳腺癌細(xì)胞表面HLA-Ⅰ分子表達(dá)的作用有待進(jìn)一步研究。

本研究通過熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)和流式細(xì)胞術(shù)檢測觀察到IFN-γ在體外對乳腺癌細(xì)胞株SKBR3的HLA-Ⅰ基因轉(zhuǎn)錄與空白對照組比較明顯增加、細(xì)胞表面HLA-Ⅰ蛋白表達(dá)與空白對照組相比也明顯增加，且上調(diào)強(qiáng)度與干擾素的濃度呈劑量依賴的關(guān)系。IFN-γ上調(diào)乳腺癌細(xì)胞的HLA-Ⅰ表達(dá)，可抑制腫瘤細(xì)胞的免疫逃避作用，增強(qiáng)免疫系統(tǒng)對腫瘤細(xì)胞的識(shí)別，從而起到抗乳腺癌的作用。本研究為乳腺癌的免疫治療提供了一定的研究基礎(chǔ)，也為以后IFN-γ聯(lián)合其他藥物治療乳腺癌提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。總之，IFN-γ在乳腺癌治療中的作用機(jī)制值得進(jìn)一步深入研究。

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收稿日期：2018-11-29;修回日期：2018-12-9

編輯/成森