葛忠耀 田寅 王博 胡少軍 尹佳新 劉應(yīng)紅 徐雷

摘要：目的? 探索SIRT6基因與缺氧誘導(dǎo)因子（HIF-1α）在三陰性乳腺癌（TNBC）中的表達關(guān)系，分析二者相關(guān)性及臨床價值。方法? 收集2017年6月～2018年12月佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科60例TNBC乳腺癌組織及其對應(yīng)60例腋窩淋巴結(jié)病理組織，并取癌旁正常組織40例。采用免疫組化法檢測癌組織、轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)及癌旁組織中SIRT6、HIF-1α表達，分析二者表達與TNBC乳腺癌臨床病理參數(shù)、發(fā)生發(fā)展的關(guān)系以及二者表達的相關(guān)性。結(jié)果? SIRT6在TNBC乳腺癌組織中表達陽性率（80.00%）高于癌旁組織（24.00%），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），其表達與TNBC乳腺癌組織分化程度，臨床TNM分期、轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)有關(guān)（P<0.05）;在TNBC乳腺癌組織、癌旁組織中HIF-1α的陽性率分別為86.67%、15.00%。且HIF-1α在TNBC乳腺癌組織與癌旁組織表達差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。并與TNBC乳腺癌的組織分化程度，臨床TNM分期、轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)相關(guān)（P<0.05）;在TNBC乳腺癌中SIRT6與HIF-1α的表達呈正相關(guān)（r=0.823，P<0.05）。結(jié)論? 在TNBC乳腺癌中SIRT6與HIF-1α的較高的陽性表達率可能與其發(fā)生發(fā)展及早期轉(zhuǎn)移有關(guān)，檢測SIRT6與HIF-1α將有助于了解TNBC乳腺癌的進展及侵襲轉(zhuǎn)移情況，它們有希望為TNBC乳腺癌的早期發(fā)現(xiàn)、治療及預(yù)后的評估提供新的研究思路。

關(guān)鍵詞：SIRT6;HIF-1α;TNBC乳腺癌;免疫組織化學(xué)

中圖分類號：R737.9? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標識碼：A? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2019.05.028

文章編號：1006-1959（2019）05-0095-03

Abstract：Objective? To explore the relationship between SIRT6 gene and hypoxia-inducible factor （HIF-1α） in triple negative breast cancer （TNBC）， and to analyze their correlation and clinical value. Methods? A total of 60 TNBC breast cancer tissues and 60 corresponding axillary lymph node tissues were collected from the Department of Pathology， the First Affiliated Hospital of Jiamusi University from June 2017 to December 2018， and 40 normal tissues adjacent to the cancer were collected. The expressions of SIRT6 and HIF-1α in cancer tissues， metastatic lymph nodes and paracancerous tissues were detected by immunohistochemistry. The relationship between the expression of SIRT6 and HIF-1α in TNBC breast cancer and the relationship between them were analyzed. Results? The positive rate of SIRT6 expression in TNBC breast cancer tissues （80.00%） was higher than that in adjacent tissues （24.00%）. The difference was statistically significant （P<0.05），the expression was correlated with the degree of TNBC breast cancer differentiation， clinical TNM stage and metastatic lymph nodes （P<0.05）. The positive rates of HIF-1α in TNBC breast cancer tissues and adjacent tissues were 86.67% and 15.00%， respectively. The expression of HIF-1α in TNBC breast cancer tissues and adjacent tissues was statistically significant （P<0.05）.It was associated with the degree of tissue differentiation， clinical TNM stage and metastatic lymph nodes of TNBC breast cancer （P<0.05）. There was a positive correlation between SIRT6 and HIF-1α expression in TNBC breast cancer（r=0.823，P<0.05）. Conclusion? The higher positive expression rate of SIRT6 and HIF-1α in TNBC breast cancer may be related to its development and early metastasis. Detection of SIRT6 and HIF-1α will help to understand the progression and invasion and metastasis of TNBC breast cancer. I hope to provide new research ideas for the early detection， treatment and prognosis evaluation of TNBC breast cancer.

Key words：SIRT6;HIF-1α;TNBC breast cancer;Immunohistochemistry

乳腺癌（breast cancer）在女性惡性腫瘤屬高發(fā)疾病，三陰性乳腺癌（TNBC）在組織分型中具有惡性程度高，預(yù)后差的特點，尤其受到重視。腫瘤具有基因組不穩(wěn)定、細胞增殖不可控和主要通過無氧呼吸提供能量等重要特征，且腫瘤細胞中的大多數(shù)即使在有充足氧氣的條件下，依然可以通過產(chǎn)能率極低的糖酵解作用來提供能量[1]。SITR6在維持基因組穩(wěn)定、調(diào)控糖代謝等方面都發(fā)揮重要作用，可能對腫瘤具有調(diào)控作用。HIF-1α可以調(diào)節(jié)多種基因來激活糖酵解，同時抑制線粒體呼吸作用。有研究報道SIRT6 基因缺失會導(dǎo)致細胞糖酵解增強、有氧呼吸被抑制、HIF-1α的合成和穩(wěn)定性增強[2]。本研究通過免疫組織化學(xué)方法測驗SIRT6、HIF-1α兩因子在TNBC乳腺癌中的表達情況，分析二者表達與TNBC乳腺癌臨床病理參數(shù)、發(fā)生發(fā)展的關(guān)系以及二者表達的相關(guān)性。

1材料與方法

1.1材料? 收集2017年6月～2018年12月佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科TNBC乳腺癌組織及其對應(yīng)腋窩淋巴結(jié)病理組織各60例，研究經(jīng)本院倫理委員會審核批準。在此60例標本中隨機抽取其中癌旁2 cm正常組織（鏡下無癌）40例。所有患者術(shù)前均未予以新輔助化療、放療、內(nèi)分泌治療及靶向治療，術(shù)后病理診斷明確，上述標本均按常規(guī)標準制作石蠟包埋切片。

1.2試劑? 試劑包含兔抗人SIRT6多克隆抗體，鼠抗人HIF-1α單克隆抗體，免疫組化染色超敏試劑盒和DAB顯色試劑，PBS磷酸鹽緩沖液緩沖液，均購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。

1.3方法? 采用免疫組化SP法。操作步驟按說明書進行。脫蠟、水化，PBS洗2次各5 min，用蒸餾水或 PBS 配制新鮮的 3% H2O2，室溫封閉5～10 min，用蒸餾水洗3次，然后進行抗原修復(fù)，PBS洗5 min，滴加正常山羊血清封閉液，室溫20 min，甩去多余液體，滴加Ⅰ抗50 μl，室溫靜置1 h或4℃過夜或37℃ 1 h、PBS洗3次各2 min。滴加生物素化Ⅱ抗，20℃ 20 min，PBS洗3次各2 min。滴加試劑SABC 20℃ 20 min，PBS 洗4次各5 min，DAB 顯色：試劑盒或自配顯色劑顯色，脫水、透明、封片、鏡檢。以PBS緩沖液代替一抗作為陰性對照，已知陽性切片作為陽性對照。

1.4觀察指標? 計算SIRT6、HIF-1α在TNBC乳腺組織標本、轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)及癌旁組織中的表達陽性率，分析二者的表達結(jié)果與患者的年齡、腫瘤生長大小、是否絕經(jīng)等因素的關(guān)系，以及與癌組織的分化水平、臨床TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況是否存在相關(guān)性。

1.5評價標準? 在高倍鏡下進行觀察癌細胞數(shù)量，SIRT6、HIF-1α均以細胞膜和（或）細胞質(zhì)染色。幾乎不染色為陰性（-）;且淺黃為弱陽性（+）;棕黃染陽性（++）;深棕染強陽性（+++）。Sirt6蛋白和HIF-1α蛋白在乳腺癌組織中主要定位于細胞質(zhì)，呈棕黃色或棕褐色顆粒。根據(jù)陽性細胞數(shù)和著色深度計分，每例均隨機觀察計數(shù)5個高倍視野（×400），確定每個視野的陽性率，取平均數(shù)，按下列計分：陽性細胞≤5%為0分，>5%～25%為1分，>25%～50%為2分，>50%～75%為3分，>75%為4分。陽性細胞表達的著色深度：基本不著色為0分，黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。將兩項積分相乘：≥1為陽性，<1為陰性。

1.6統(tǒng)計學(xué)方法? 所有數(shù)據(jù)、結(jié)果均用Excel錄入，SPSS17.0統(tǒng)計軟件包分析，計數(shù)資料以（%）表示，采用？字2檢驗四格表資料的Fisher確切概率法、多組等級比較采用Spearman等級相關(guān)性分析，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 SIRT6、HIF-1α在TNBC乳腺中的表達? SIRT6在TNBC乳腺癌組織、轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)及癌旁組織均有表達，前兩者均高于后者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（？字2=29.803，P<0.05）。HIF-1α在TNBC乳腺癌組織、轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)及癌旁組織均有表達，前者兩者均高于后者， 差異有統(tǒng)計學(xué)意義（？字2=50.602，P<0.05），見表1。

2.2 SIRT6、HIF-1α在TNBC乳腺癌組織中的表達與其臨床病理特征的關(guān)系? ?SIRT6與TNBC乳腺癌組織的分化水平、臨床TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況相關(guān)（P<0.05），與患者的年齡、腫瘤生長大小及是否絕經(jīng)無相關(guān)性（P>0.05）;HIF-1α與TNBC乳腺癌的組織分化水平、臨床TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況相關(guān)（P<0.05），而與患者的年齡、腫瘤生長大小及是否絕經(jīng)無相關(guān)性（P>0.05），見表2。

2.3 TNBC乳腺癌組織和癌旁組織中SIRT6、HIF-1α表達相關(guān)性分析? 兩者均在癌組織中出現(xiàn)高表達，且在癌旁組織中出現(xiàn)低表達。結(jié)果顯示SIRT6、HIF-1α表達呈正相關(guān)性（r=0.823），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見表3。

3討論

腫瘤細胞的持久分裂能力和導(dǎo)致人體衰老死亡的過程看起來似乎是對立狀態(tài)，但事實上癌變和衰老過程中的分子變化以及細胞層面的生物學(xué)基礎(chǔ)卻是極為相似[3]。SIRT6在癌變過程中起到非常重要的作用，研究表明，SIRT6 的缺失使得糖酵解增加并通過某些途徑使之上調(diào)了相關(guān)基因的表達，刺激和促進了核糖體的生成，進而導(dǎo)致腫瘤的異常增殖，這表明其在腫瘤的形成以及維持過程中起到非常重要的作用[4]。除此之外，通過臨床樣本的數(shù)據(jù)分析，可以發(fā)現(xiàn) SIRT6 在多種惡性腫瘤疾病中的表達水平與患者的生存、預(yù)后密切相關(guān)[5]。HIF-1是具有轉(zhuǎn)錄活性的一種核蛋白，擁有廣泛的靶基因譜。HIF-1α基因定位于人的14 號染色體，受缺氧信號的直接調(diào)控，其作為HIF-1的活性亞基，HIF-1α是組織缺氧區(qū)域內(nèi)的最重要的標記物，是調(diào)控細胞代謝途徑轉(zhuǎn)換過程的重要因子，有學(xué)者推測SIRT6可通過影響HIF-1α表達調(diào)控Warburg效應(yīng)[6]，最終實現(xiàn)對腫瘤細胞分化增殖活性的調(diào)控。

目前，SIRT6和HIF-1α蛋白聯(lián)合監(jiān)測在宮頸癌、肝癌、胃癌中的表達相關(guān)研究較多，二者可作為腫瘤標志物監(jiān)測肝癌、胃癌的演變[7]。但關(guān)于兩種蛋白SIRT6和HIF-1α聯(lián)合檢測在乳腺癌中的研究鮮見報道。同時，可以推測SIRT6是否能加強HIF-1α對多種糖酵解相關(guān)酶如PFK1、葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白1等的影響，從而加快細胞代謝轉(zhuǎn)換過程，調(diào)控腫瘤細胞增殖。具體實驗步驟需進一步設(shè)計;如果這個推論成立，將可能對TNBC乳腺癌的治療提供更多的思路。

本研究發(fā)現(xiàn)SIRT6、HIF-1α在TNBC乳腺癌組織，轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中的陽性率均高于癌旁正常組織的陽性率，揭示其在TNBC乳腺癌的惡變與轉(zhuǎn)移中能夠起到促成作用。在60例TNBC乳腺癌中，SIRT6、HIF-1α在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中的陽性率高于無結(jié)轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P均<0.05）;說明SIRT6、HIF-1α可能與TNBC乳腺癌淋巴結(jié)的侵襲轉(zhuǎn)移有相關(guān)性。并且SIRT6、HIF-1α在TNBC乳腺癌的組織分化程度、臨床TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)（P<0.05），而與患者年齡、是否絕經(jīng)及腫瘤大小無相關(guān)性（P>0.05）;證明了過表達的SIRT6、HIF-1α對TNBC乳腺癌的進展過程可能起到一定作用，可認為是TNBC患者預(yù)后不良的標志。最后在TNBC癌組織中SIRT6、HIF-1α呈現(xiàn)正相關(guān)（r=0.823，P<0.05）。提示兩者在TNBC乳腺癌發(fā)生發(fā)展中起到協(xié)同作用，并且SIRT6能上調(diào)HIF-1α的表達，同時也預(yù)示在其高表達時有復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的可能，為TNBC乳腺癌治療提供新的靶點及研究方向。

綜上所述，TNBC乳腺癌組織中SIRT6和HIF-1α的表達升高，且其協(xié)同參與TNBC乳腺癌的進展和復(fù)發(fā)，檢測二者對于指導(dǎo)TNBC乳腺癌的早期發(fā)現(xiàn)、治療及預(yù)后具有重要參考意義。然而，本次研究樣本量較少，不同地域、種族等可能會存在差異，相關(guān)研究結(jié)論有待大樣本、多中心的研究進一步去證實。

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收稿日期：2018-11-29;修回日期：2018-12-12

編輯/肖婷婷