吳 健，祝 賀，2，藍(lán)彩紅，劉盛鋼，賀燕波，郝哲兵，楊 濤，*

（1.中南林業(yè)科技大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410000；2.山東農(nóng)業(yè)工程學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 濟(jì)南 250100；3.華澤集團(tuán)有限公司，云南 迪慶 674400）

小曲酒是以小曲為糖化發(fā)酵劑進(jìn)行釀造的中國(guó)傳統(tǒng)白酒，因其使用的酒曲以及發(fā)酵方式的不同而有別于大曲酒，在酒行業(yè)中占據(jù)著一定的市場(chǎng)。傳統(tǒng)小曲的制備是以自然接種的方式，在觀音土、米糠、薯渣、米粉、麩皮等制曲原料上培養(yǎng)得來(lái)，相關(guān)微生物主要有根霉、曲霉、毛霉等霉菌以及酵母菌等，培養(yǎng)過(guò)程中也會(huì)有細(xì)菌生長(zhǎng)，整個(gè)制曲工藝中對(duì)有益微生物和有害微生物的生長(zhǎng)難以把控[1-2]。隨著純種培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展，小曲的制作逐漸改進(jìn)為純種接種根霉培養(yǎng)種曲，與酵母菌混合制曲，出酒率大大得以提高，如廈門白曲，邛崍米曲等小曲，其中根霉是小曲制作中的主要糖化菌，含有豐富的糖化型淀粉酶，能從釀酒原料中淀粉的非還原端切斷α-1,4和α-1,6糖苷鍵，使其轉(zhuǎn)化成為可發(fā)酵性還原糖，供后續(xù)發(fā)酵微生物利用[3]，在整個(gè)釀造過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用，同時(shí)成品曲的糖化性能是檢驗(yàn)酒曲質(zhì)量的重要指標(biāo)，也是影響白酒釀造出酒率的關(guān)鍵因素之一。

純種根霉曲的生產(chǎn)包括一級(jí)試管種培養(yǎng)，二級(jí)三角瓶種曲制作，然后再擴(kuò)大培養(yǎng)到三級(jí)淺盤種曲，后續(xù)大批投入培養(yǎng)成生產(chǎn)曲[4-5]，目前關(guān)于純種根霉米粉曲的研究主要集中在生產(chǎn)曲生產(chǎn)過(guò)程中的酶學(xué)性質(zhì)研究及工藝優(yōu)化[6-7]，機(jī)械化制曲的工藝摸索[8]，以及菌種的改造選育與表達(dá)分析[9-11]。未有針對(duì)一級(jí)試管菌種與種曲質(zhì)量的相關(guān)性研究，其培養(yǎng)多憑靠經(jīng)驗(yàn)判斷，難以穩(wěn)定，但實(shí)際上一級(jí)試管菌種的狀態(tài)會(huì)直接影響到二級(jí)種曲制作的質(zhì)量，與后續(xù)生產(chǎn)曲的發(fā)酵特性密切相關(guān)，是整個(gè)制曲過(guò)程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。培養(yǎng)時(shí)間過(guò)短會(huì)使得糖化性能變差，發(fā)酵不能正常進(jìn)行；若培養(yǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，過(guò)多的孢子會(huì)導(dǎo)致成品酒出現(xiàn)不好的風(fēng)味。而酒曲作為釀酒的糖化發(fā)酵劑，其質(zhì)量好壞很大程度上決定了釀造過(guò)程能否正常發(fā)酵，沒(méi)有針對(duì)性的工藝研究，常常會(huì)導(dǎo)致不必要的人力物力損失，因此很有必要對(duì)米粉種曲制作工藝進(jìn)行探究與優(yōu)化。

種曲的糖化性能好壞決定了后續(xù)生產(chǎn)曲的優(yōu)劣，針對(duì)該指標(biāo)展開研究，對(duì)實(shí)際生產(chǎn)具有很大的指導(dǎo)作用。采用純種根霉接種制備種曲，通過(guò)控制一級(jí)試管菌種的培養(yǎng)時(shí)間、種曲培養(yǎng)溫度以及米粉的水分含量，研究三者對(duì)種曲試飯?zhí)欠种蹬c糖化酶活力的影響，并利用Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)進(jìn)一步對(duì)種曲制作工藝進(jìn)行優(yōu)化，以期為根霉制曲自動(dòng)化，智能化的發(fā)展建設(shè)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

WJ02-G根霉：桂林湘山酒業(yè)有限公司；國(guó)家一級(jí)秈米：湖南省金健米業(yè)股份有限公司。

1.1.2 化學(xué)試劑

苯酚、酒石酸甲鈉、3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosali cylic acid，DNS）、瓊脂粉：生工生物工程（上海）股份有限公司；氫氧化鈉、亞硫酸氫鈉、冰醋酸、醋酸鈉（均為分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。試驗(yàn)所用試劑均為分析純或生化試劑。

1.1.3 培養(yǎng)基

米曲汁瓊脂培養(yǎng)基：參照毛宜祥等[12]的方法制備，再以純水調(diào)節(jié)其糖度至12°Bx，以氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至6.5，瓊脂添加量為2%，115℃條件下高壓滅菌20 min，斜面擺至試管長(zhǎng)度1/3，放置10 d待試管內(nèi)壁無(wú)水珠后備用。

1.2 儀器與設(shè)備

60目標(biāo)準(zhǔn)篩：新鄉(xiāng)市同心機(jī)械有限責(zé)任公司；SF130高速中藥粉碎機(jī)：長(zhǎng)沙市岳麓區(qū)中南制藥機(jī)械廠；LMQ電熱立式自動(dòng)高壓滅菌鍋：山東新華醫(yī)療器械股份有限公司；SW-SJ-1FD超凈工作臺(tái)：蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；MJP-250霉菌培養(yǎng)箱：北京中興偉業(yè)儀器有限公司；DZ-260C真空包裝機(jī)：溫州市凱馳包裝機(jī)械有限公司；HH-M2恒溫水浴鍋：金壇市城西春蘭試驗(yàn)儀器廠；UV-1800紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)：島津企業(yè)管理有限公司。

1.3 方法

1.3.1 純種根霉米粉種曲制作工藝流程及操作要點(diǎn)

操作要點(diǎn)：將秈米粉碎后過(guò)60目標(biāo)準(zhǔn)篩，以每瓶40 g的裝載量將米粉分裝在500 mL三角瓶中，于121℃條件下15 min后取出趁熱用無(wú)菌藥刮攪散待冷卻至室溫，同時(shí)在無(wú)菌水中加入1 mL試管根霉菌懸液，混勻后將混合液倒入冷卻刮散的米粉中翻拌均勻，然后旋轉(zhuǎn)搭窩，置于32℃霉菌培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h后扣瓶，繼續(xù)培養(yǎng)至48h后將米粉餅取出放入無(wú)菌牛皮紙袋內(nèi)，于39℃電熱鼓風(fēng)干燥箱中干燥48 h后真空包裝，待測(cè)種曲的糖化酶活力及試飯?zhí)欠帧?/p>

1.3.2 不同培養(yǎng)時(shí)間試管菌種的菌懸液制備

無(wú)菌操作勾取WJ02-G純種根霉菌絲體接種于米曲汁瓊脂培養(yǎng)基斜面中間，于32℃霉菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一定時(shí)間，培養(yǎng)結(jié)束后將試管中根霉整塊挑出置于無(wú)菌研缽中，加入3 mL無(wú)菌水研磨2 min，制得不同培養(yǎng)時(shí)間試管菌種的菌懸液。

1.3.3 酒曲糖化酶活力的測(cè)定方法

糖化酶活力定義[13]：1 g酒曲（以絕干計(jì)）在40℃、pH 4.6條件下，1h分解可溶性淀粉生成1 mg葡萄糖，即為1個(gè)酶活力單位，以U/g表示。

測(cè)定方法：參照馬歌麗等[14]的方法利用3,5-二硝基水楊酸比色法測(cè)定種曲中的糖化酶活力。

1.3.4 酒曲試飯?zhí)欠值臏y(cè)定方法

試飯方法：參照王曉慧等[15]的方法，糖分：參照馬歌麗等[14]的方法利用DNS法進(jìn)行定量。

1.3.5 單因素試驗(yàn)

設(shè)置各因素的固定水平分別為試管菌種培養(yǎng)時(shí)間72h、種曲培養(yǎng)溫度32℃、米粉水分含量25%。改變待考察因素的水平分別為試管菌種培養(yǎng)時(shí)間36 h、48 h、60 h、72 h、84 h、96 h；種曲培養(yǎng)溫度26℃、28℃、30℃、32℃、34℃、36℃；米粉水分含量15%、20%、25%、30%、35%、40%。培養(yǎng)完畢后分別測(cè)定種曲的試飯?zhí)欠峙c糖化酶活力。

1.3.6 Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以試管菌種培養(yǎng)時(shí)間（A）、種曲培養(yǎng)溫度（B）、種曲水分含量（C）為考察因素，以試飯?zhí)欠郑╕）為響應(yīng)值，利用Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)試驗(yàn)，試驗(yàn)因素與水平如表1所示。

表1 種曲制作工藝優(yōu)化Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken response surface design for optimization of rice flour fermentation process

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1不同培養(yǎng)時(shí)間的一級(jí)試管菌種對(duì)種曲的影響

圖1 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)種曲的影響Fig.1 Effect of culture time on the seed starter

由圖1可知，當(dāng)培養(yǎng)溫度為32℃、米粉水分含量為25%時(shí)，不同的試管菌種培養(yǎng)時(shí)間對(duì)種曲的糖化酶活力與試飯?zhí)欠种稻酗@著影響。在36～72h時(shí)，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，糖化酶活力與試飯?zhí)欠种党尸F(xiàn)遞增趨勢(shì)，在72 h均達(dá)到了峰值，分別為698.13 U/g和25.02 g/100 g；延長(zhǎng)時(shí)間繼續(xù)培養(yǎng)，72 h之后兩者均逐漸降低。

這一現(xiàn)象很有可能與根霉菌絲生長(zhǎng)與孢子產(chǎn)生直接相關(guān)，根霉菌絲是根霉?fàn)I養(yǎng)體的基本單位，隨著頂端的細(xì)胞不斷生長(zhǎng)而蔓延開來(lái)逐漸成熟，是由孢子在合適的生長(zhǎng)條件下萌發(fā)得來(lái)，但成熟的根霉菌絲同樣具有繁殖能力與糖化能力[16]，往往孢子較少而菌絲較多的根霉曲，接種后有利于根霉孢子的萌發(fā)和菌絲體的前期生長(zhǎng)。隨著試管菌種中菌絲體逐漸成熟到最終老化，以及孢子數(shù)量不斷增多，接種后種曲的糖化酶活力與試飯?zhí)欠种稻尸F(xiàn)出先升后降的趨勢(shì)。因此，選擇72 h為最適宜的試管菌種培養(yǎng)時(shí)間。

2.1.2 不同的培養(yǎng)溫度對(duì)種曲的影響

圖2 培養(yǎng)溫度對(duì)種曲的影響Fig.2 Effect of culture temperature on the seed starter

由圖2可知，在試管菌種培養(yǎng)時(shí)間為72 h、米粉水分含量為25%的條件下，不同的培養(yǎng)溫度對(duì)于種曲的糖化酶活力與試飯?zhí)欠滞瑯佑绊戯@著。在26～34℃范圍內(nèi)，糖化酶活力隨種曲培養(yǎng)溫度的升高持續(xù)增高，在34℃達(dá)到峰值753.80 U/g，之后隨溫度升高而出現(xiàn)急劇下降；26～32℃范圍內(nèi)，試飯?zhí)欠蛛S溫度升高，在32℃達(dá)到峰值26.33 g/100 g，超過(guò)32℃后逐漸下降。兩者總體趨勢(shì)均呈現(xiàn)為先升后降，但糖化酶活力34℃時(shí)最優(yōu)，試飯?zhí)欠衷?2℃最優(yōu)，同時(shí)兩者下降的幅度是前者大于后者。

大部分根霉的最適生長(zhǎng)溫度為30～33℃，而產(chǎn)酶溫度則比生長(zhǎng)溫度稍高，最適產(chǎn)酶溫度在30～35℃[17]，根霉在適宜溫度條件下快速生長(zhǎng)，然后在合適的產(chǎn)酶溫度下開始產(chǎn)酶；IKASARI L等[18]研究發(fā)現(xiàn)，溫度上升會(huì)導(dǎo)致根霉在生長(zhǎng)過(guò)程中主動(dòng)延長(zhǎng)的菌絲尖端數(shù)量減少，而且將溫度降低之后，根霉也并不會(huì)立即恢復(fù)。超出最佳生長(zhǎng)溫度范圍之外后，根霉的生長(zhǎng)會(huì)被抑制，孢子的萌發(fā)和菌絲體的生長(zhǎng)也會(huì)隨之受限。因此根霉產(chǎn)酶會(huì)受到很大的影響，酶活急劇下降。相對(duì)而言，溫度對(duì)試飯?zhí)欠值挠绊懕忍腔富盍π∫恍?，針?duì)試飯?zhí)欠珠_展研究。因此，選擇32℃為最適宜的種曲培養(yǎng)溫度。

2.1.3 不同的水分含量對(duì)種曲的影響

圖3 米粉水分含量對(duì)種曲的影響Fig.3 Effect of moisture content of rice flour on the seed starter

由圖3可知，在試管菌種培養(yǎng)時(shí)間為72 h，種曲培養(yǎng)溫度32℃條件下，米粉中不同的水分含量對(duì)種曲糖化酶活力及試飯?zhí)欠侄加绊戯@著。在15%～25%加水量范圍內(nèi)，試飯?zhí)欠种惦S水分含量的增大而逐漸升高，在25%處達(dá)到峰值27.23 g/100 g，在25%～40%范圍內(nèi)，試飯?zhí)欠种惦S水分含量的增加而持續(xù)降低；糖化酶活力與試飯?zhí)欠种第厔?shì)相同，但峰值點(diǎn)出現(xiàn)在30%處，為713.67 U/g，在15%～30%范圍遞增，30%～40%范圍遞減，且下降幅度較大。

水分和氧氣是影響根霉生長(zhǎng)代謝的重要因素，米粉中的水分一方面為根霉生長(zhǎng)提供了必須的條件，另一方面也影響著根霉生長(zhǎng)環(huán)境的氧含量，從而調(diào)控著其生長(zhǎng)。SPARRINGA R A等[19]在對(duì)寡孢根霉菌進(jìn)行生長(zhǎng)條件優(yōu)化時(shí)發(fā)現(xiàn)其生長(zhǎng)需要一定的水分，劉憲春[20]在研究根霉Q303生長(zhǎng)特性時(shí)也發(fā)現(xiàn)，水分與溫度是影響根霉質(zhì)量的關(guān)鍵因素，而且根霉在培養(yǎng)過(guò)程中也需供給一定量的氧分，以提高培菌糖化率和出酒率[21]。水分含量適宜時(shí)，根霉可以從生長(zhǎng)環(huán)境中獲取足夠的水與氧氣，但當(dāng)水分過(guò)多時(shí)，物料疏松程度不夠，米粉過(guò)多粘結(jié)成塊，氧濃度不足的同時(shí)，也阻礙了根霉菌絲的攀附延伸，對(duì)其生長(zhǎng)不利。從試飯?zhí)欠值慕Y(jié)果來(lái)看，選擇25%作為最適宜的加水量較為合理。

2.2 Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果分析

2.2.1 響應(yīng)面設(shè)計(jì)及結(jié)果

小曲酒的釀造工藝決定了小曲的添加量遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于大曲，后續(xù)的發(fā)酵主要依靠菌體邊生長(zhǎng)邊糖化發(fā)酵，酒曲的糖化酶活力并不是決定糖化好壞的關(guān)鍵因素，試飯?zhí)欠种蹈軠?zhǔn)確地反映出實(shí)際發(fā)酵過(guò)程中酒曲的糖化性能。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以試管菌種培養(yǎng)時(shí)間（A）、種曲培養(yǎng)溫度（B）、米粉水分含量（C）為試驗(yàn)因素，試飯?zhí)欠种担╕）為響應(yīng)值，利用Design Expert 8.06響應(yīng)面軟件的Box-Behnken設(shè)計(jì)3因素3水平試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見(jiàn)表2。對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多元回歸擬合分析，得到試飯?zhí)欠諽對(duì)自變量A、B、C的回歸方程為：

表2 種曲制作工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 2 Analysis and results of Box-Behnken response surface design for optimization of rice flour fermentation process by pure Rhizopus seed starter

2.2.2方差及可信度分析

響應(yīng)面的二次模型方差分析結(jié)果見(jiàn)表3，由表3可知，模型的P值＜0.001，差異極顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；失擬項(xiàng)P值＞0.05，差異不顯著，說(shuō)明所選模型與試驗(yàn)的擬合度較好，可用該回歸方程對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。一次項(xiàng)中A（菌種時(shí)間）、B（培養(yǎng)溫度）、C（水分含量）的P值分別為PA＜0.001，0.001＜PB＜0.05，PC＜0.05，三者P值均＜0.05，表明3個(gè)因素均對(duì)響應(yīng)指標(biāo)試飯?zhí)欠志哂酗@著影響，其中A影響極顯著，B、C影響顯著。F值越大，則試驗(yàn)因素對(duì)響應(yīng)指標(biāo)的影響程度越大，三者F值分別為31.32、6.95、24.66，表明3個(gè)因素對(duì)試飯?zhí)欠值挠绊懗潭却笮锳＞C＞B。二次項(xiàng)A2、B2、C2對(duì)試飯?zhí)欠志袠O顯著影響（P＜0.01）。

表3 響應(yīng)面二次模型的方差分析結(jié)果Table 3 ANOVA results of response surface quadratic model

方差分析結(jié)果中，決定系數(shù)R2值為0.99，表明模型可以解釋99%的響應(yīng)值，回歸方程的擬合程度較好；調(diào)整決定系數(shù)R2值為0.98，說(shuō)明試驗(yàn)可進(jìn)行優(yōu)化，調(diào)整之后有98%的變化來(lái)源于試驗(yàn)所考察變量。變異系數(shù)為2.14%，在試驗(yàn)范圍內(nèi)變異較小，數(shù)據(jù)的離散程度在可接受范圍內(nèi)。

綜上，回歸模型與實(shí)際值的擬合程度較好，可用來(lái)預(yù)測(cè)和優(yōu)化純種根霉米粉種曲制備的工藝。

2.2.3 各因素交互作用的響應(yīng)面分析

各因素交互作用對(duì)種曲試飯?zhí)欠种档挠绊懭鐖D4所示。等高線的形狀可反映出交互作用的顯著性，等高線呈橢圓形表示兩因素交互作用顯著，等高線呈圓形表示交互作用不顯著；若響應(yīng)面坡度相對(duì)平緩，表明處理?xiàng)l件的變化對(duì)響應(yīng)值的影響不大，相反，如果一個(gè)響應(yīng)面坡度陡峭，表明響應(yīng)值對(duì)于處理?xiàng)l件的改變非常敏感[22]。由圖4可知，隨著3個(gè)因素的水平逐漸增高，種曲試飯?zhí)欠种党尸F(xiàn)出先增后降的趨勢(shì)，交互作用的3個(gè)響應(yīng)面均出現(xiàn)極大值。圖4的陡峭程度顯示：A（菌種時(shí)間）、B（培養(yǎng)溫度）、C（水分含量）均對(duì)響應(yīng)指標(biāo)試飯?zhí)欠种涤酗@著影響，其中BC（水分含量與培養(yǎng)溫度）的交互作用相對(duì)較強(qiáng)，對(duì)試飯?zhí)欠种档挠绊懴鄬?duì)較大。以上結(jié)果與響應(yīng)面二次模型方差分析結(jié)果一致。

圖4 各因素交互作用對(duì)種曲試飯?zhí)欠种涤绊懙捻憫?yīng)曲面及等高線Fig.4 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between each factors on the trial sugar content of rice testing

2.3 最佳工藝驗(yàn)證試驗(yàn)

針對(duì)Box-Behnken響應(yīng)面優(yōu)化過(guò)后得出的最佳工藝開展驗(yàn)證試驗(yàn)：一級(jí)試管菌種培養(yǎng)時(shí)間為73 h，種曲培養(yǎng)溫度為32℃，水分含量為26%，重復(fù)3次，實(shí)際試飯?zhí)欠制骄禐?7.18 g/100 g，與模型預(yù)測(cè)的理論優(yōu)值27.74 g/100 g基本一致，模型擬合成功，優(yōu)化工藝能為根霉種曲的生產(chǎn)提供依據(jù)。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)以試管菌種培養(yǎng)時(shí)間、種曲培養(yǎng)溫度、米粉水分含量為試驗(yàn)因素，以種曲的試飯?zhí)欠种禐轫憫?yīng)指標(biāo)，利用響應(yīng)面法建立了純種根霉種曲制作工藝的二次項(xiàng)回歸模型，通過(guò)方差分析，驗(yàn)證了該模型的預(yù)測(cè)優(yōu)值與實(shí)際值的擬合程度較高。在此基礎(chǔ)上，針對(duì)試飯?zhí)欠种底隽俗畲笾祪?yōu)化，得出優(yōu)化工藝為一級(jí)試管菌種培養(yǎng)時(shí)間為73 h，種曲培養(yǎng)溫度為32℃，水分含量為26%，在此條件下的重復(fù)驗(yàn)證試驗(yàn)顯示，試飯?zhí)欠种禐?7.18 g/100 g，與模型預(yù)測(cè)的理論優(yōu)值27.74g/100g基本一致。該模型優(yōu)化工藝能為根霉種曲的生產(chǎn)提供參考。